PERAN AHG

( ANTIHUMAN GLOBULIN )
DAN PEMERIKSAAN COOMB
TEST
Dr. Woro Umi Ratih,MKes,SpPK
Definisi AHG

Adalah : serum yang

diperoleh dari kelinci
yang sebelumnya
diinjeksi dengan serum
manusia
Nama Lain : Coombs serum

Ditemukan
oleh Coombs
tahun 1945
 Pembuatan AHG:
• Serum manusia disuntikkan ke kelinci
• Kelinci membuat Ab thd serum mns yg disuntikkan, disebut
Rabbit Antihuman globulin
Digunakan dlm Tes Antiglobulin
 Sejarah Penemuan AHG

Sebelum ada AHG, hanya

IgM antibodi yg dpt dideteksi

IgG antibodi tidak dpt krn

bersifat incomplete antibodi

Beberapa kasus spt HDN, gol

darah non ABO tidak bisa
dideteksi
 Sejarah Penemuan AHG

1908 Penelitian Moreschi

Rabbit antigoat serum

Agglutinasi RBC kelinci yg disensitisasi

oleh goat antirabbit serum
 Sejarah Penemuan AHG

1945 : Coombs menemukan AHG

Goldar
pertama
yang
terdeteksi
adalah Kell
Mendeteksi anti D dalam serum

1946 : Coombs : sdm tersensitisasi Ab pada kasus HDN

 Plasma Protein
Albumin (60%) komponen utama
, menjaga tekanan osmotik

Globulin (35%(, antibodi dan

transport protein

Fibrinogen (4%), pembekuan

darah

Lain2 (<1%)
Globulin (Immunoglobulin)
Globulin (Immunoglobulin)

Gamma Globulin
Diproduksi oleh limfosit dan plasma sel
pada sistem imun

Sebagian besar gamma globulin

adalah immunoglobulin (antibodi)

Immunoglobulin yg utama : IgM, IgG

dan IgA
Fungsi AHG
Deteksi
incomplete
antibodi

Coated di
eritrosit in vivo

Di dalam
plasma/serum
 Incomplete Antibodi

Coated di SDM invivo

Melekat dipermukaan eritrosit

Menyebabkan lisis eritrosit

Mengaktivasi complement
Aktivasi Complement
Antibodi Coated Eritrosit

IgG
Terdeteksi
dengan
AHG
C3
 Aplikasi AHG pada Laboratorium
AHG test px lab untuk mendeteksi antibodi yg tidak
atau sempurna (incomplete antibody) yg terdpt
Coombs didalam serum atau eritrosit penderita
Tes
Menegakkan diagnosis penyakit tertentu,
sebagai lanjutan dari pemeriksaan USS,
menentukan jenis antibody berdasar dari
asalnya dll
Ada dua macam : DCT dan ICT
 TUJUAN COOMB’S TEST

Mendeteksi antibodi tidak

sempurna (incomplete)

Yg melekat di eritrosit
penderita secara in vivo

Berada diserum penderita

kuliah D4
 Prinsip Tes Antiglobulin

Globulin Globulin mns

Kelinci membentuk
diinjeksikan ke antihuman globulin
(IgG dan C3) kelinci

Antihuman Eritrosit yg
globulin bereaksi diselubungi globulin
dg globulin akan diaglutinasi
manusia di serum oleh antihuman
at eritrosit globulin
kuliah D4
Macam-Macam Coombs Test

Tujuan Metoda

DCT Manual

ICT Gel
kuliah D4
Coombs Test = Antiglobulin Test

Interpretasi
: negatip
Antibodi dan positip
incomplete
berikatan dg
Reaksi serum
aglutinasi Coombs

kuliah D4
DCT=Direct Coombs Test (Manual)

• Mendeteksi antibodi
Tujuan incomplete yang
melapisi eritrosit
secara in vivo

• Eritrosit dicuci dengan

Prinsip Saline
(px manual) • Tambahkan Coombs
Serum
kuliah D4
DIRECT ANTIGLOBULIN TEST
(DAT)/Direct Coombs Test

Untuk mendeteksi incomplete antibody yg

melapisi eritrosit penderita in vivo

Ag Incompl Ab

kuliah D4 hemaglutinasi
Serum Coombs
 DIRECT COOMB’S TEST (DCT)

 Kegunaan : pada kasus

 AIHA ( Auto Immune Hemolytic Anemia)
 Drug induced hemolysis
 Alloimmunisasi akibat transfusi
 Bag px Uji Silang Serasi (incompatibel)
 HDN ( Hemolytic Disease of the

Newborn)

kuliah D4
 Penyebab DAT Positive

Kondisi Klinik Penyebab Sumber IgG

Reaksi transfusi SDM donor dilapisi dgn Dari pasien

IgG
HDN SDM fetus dilapisi dg IgG Antibodi ibu

AIHA IgG atau C3 di SDM pasien Autoantibodi

pasien
Drug induced Komplek IgG – obat yg Komplek imun
hemolysis berikatan dg SDM krn obat
kuliah D4
 ICT=Indirect Coombs Test

Tujuan : mendeteksi antibodi incomplete yg ada

diserum penderita (melapisi eritrosit secara in vitro)

Eritrosit org normal dg goldar yg sama dengan penderita

at goldar O disuspensikan dg serum penderita, kmdn
diinkubasi 37⁰ C

Cuci dgn saline, tambahkan Coombs serum, sentrifuge 1

menit pd 1000 rpm

kuliah D4
 Ab dlm serum
Ag
IAT
E
E

1
Inkubasi 37° C
2
Sentrifus 1000 rpm (1 menit)

Cuci dg salin

Serum Coombs

3 4 hemaglutinasi
kuliah D4
INDIRECT COOMB’S TEST (ICT)

 Kegunaan : pada kasus

♦ skrining antibodi
♦ deteksi thd varian Rh yg bereaksi
lemah, Ag Kell & Duffy
♦ uji silang serasi (fase 3)
♦ fenotiping ( identifikasi gol darah
spesifik non ABO)
kuliah D4
kuliah D4
 Perbandingan DAT dan IAT
DAT IAT

Mendeteksi IgG dan C3 yg melapisi Mendeteksi IgG dan C3 yg melapisi

eritrosit eritrosit

Pelapisan scr in Vivo Pelapisan secara in Vitro

Prosedur satu tahap Prosedur 2 tahap

SDM pasien ditambahkan AHG tanpa Serum pasien diinkubasi terlebih

inkubasi dahulu dg SDM sblm ditambah AHG

Tidak memerlukan SDM orang lain Memerlukan SDM orang lain

Digunakan pd kasus HDN, AIHA, drug Sbg fase ttt pada pemeriksaan
induced hemolytic immunohematology
kuliah D4
Reagen antihuman globulin

Polispesifik Monospesifik

kuliah D4
 Reagen Anti Human Globulin
(AHG)
Reagen • berisi 2 at lebih
polispesifik antibodi
• Anti IgG dan anti C3
(poliklonal)

Reagen • Berisi 1 jenis antibodi

monospesifik • anti Ig G saja atau
anti C3 saja
(monoklonal)
kuliah D4
Reagen Definisi
POLISPESIFIK
1. Rabbit polyclonal 1. Mengandung anti-IgG dan anti-C3d

2. Rabbit/murine 2. Mengandung campuran rabbit polyclonal

monoclonal blend antihuman IgG dan murine monoclonal anti-C3b
& C3d
3. Murine polyclonal 3. Mengandung murine monoclonal anti-IgG, anti-
C3b & anti -C3d

MONOSPESIFIK
1. Rabbit monoclonal 1. Mengandung anti-IgG
2. Monoclonal IgG 2. Mengandung murine monoclonal anti-IgG
3. Monoclonal Anti-C3d 3. Mengandung anti C 3 d

kuliah D4
 Faktor yg berpengaruh thd
hasil tes Coombs
1. Perbandingan serum : sel
2. Medium reaksi
3. Temperatur
4. Waktu inkubasi
5. Pencucian sel
6. Salin utk pencucian
7. Penambahan antihuman globulin
8. Sentrifugasi untuk pembacaan
kuliah D4
 1. Perbandingan serum : sel

 Peningkatan rasio antara serum

thd sel menyebabkan peningkatan
sensitivitas sistim tes
 Biasanya: 2 tts serum & 1 tts 5%
vol suspensi sel

kuliah D4
 2. Medium Pereaksi

Medium utk Meningkatkan

kekuatan
Penambahan
mereaksikan aglutinasi antibodi
pemeriksaan potensiator

kuliah D4
 2. Medium Pereaksi

Enzim
proteolitik
(ficin dan
LISS papain)

PEG
(polyethylen
glicol)
kuliah D4
Antibodi Mekanisme Kerja
potensiator

LISS Meningkatkan antibodi uptake (fase

sensitisasi)
PEG Membuat suasana pemeriksaan mjd
media dg kekuatan ionik yg rendah dg
cara menghilangkan molekul air shg
memudahkan sensitisasi
PEG : pd reagen IgG AHG
Proteolytic enzymes Menghilangkan muatan negative
(papain, ficin dan dipermukaan membran SDM shg
mengurangi zeta potensial.
bromelin)
kuliah D4
 3. Temperatur

 Kecepatan reaksi optimum sebagian besar IgG

terjadi pada suhu 37°C
 Suhu inkubasi 37°C dipakai dalam:

 Tes Coombs indirek (IAT)

 Aktivasi komplemen

kuliah D4
 4. Waktu inkubasi

 Inkubasi sel dlm salin:

Bervariasi antara 30-120 menit
Sebagian besar Ab yg memp arti klinik
dpt dideteksi sesudah inkubasi 30
menit
Dan biasanya perpanjangan wkt kurang
bermanfaat
kuliah D4
 Waktu inkubasi

 Jika teknik LISS digunakan, wkt inkubasi

diperpendek mjd 10-15 menit
 Dg perpendekan wkt tsb, tabung sangat penting
diinkubasi dlm 37°C

 Perpanjanganwaktu dg teknik LISS (sp 40 menit)

menyebabkan Ab elusi dr eritrosit (elusi=lepasnya
Ab) & mengakibatkan penurunan sensitivitas

kuliah D4
 5. Pencucian sel

• Saat keduanya IAT dan DAT dikerjakan, eritrosit harus

dicuci dg salin minimum 3 kali sebelum penambahan
AHG

• Pencucian tsb ditujukan utk menghilangkan globulin

serum bebas tak terikat

• Pencucian tak adekuat dapat menghasilkan reaksi

negatif palsu krn tjd netralisasi reagensia AHG oleh
sisa globulin serum tak terikat

kuliah D4
 Pencucian sel

• Pencucian sebaiknya sedapat mungkin

dilakukan dlm waktu pendek utk meminimasi
elusi Ab dg afinitas rendah

• Pellet harus diresuspensi secara lengkap sblm

penambahan salin berikutnya

• Semua salin hrs terbuang sec lengkap ses

tahap final krn salin residu (sisa) melarutkan
reagen AHG dan dpt menurunkan sensitivitas
tes
kuliah D4
 6. Saline untuk mencuci

Tidak
segar terkontaminasi

Di buffer
7,2-7,4

kuliah D4
7. Penambahan AHG

Segera setelah
pencucian

Volume sesuai
kit

Tidak boleh lupa

kuliah D4
 8. Sentrifugasi
Kecepatan dan
waktu harus tepat

Overcentrifuge :
pos palsu

Undercentrifuge :
neg palsu
kuliah D4
 Validasi Hasil Pemeriksaan Coombs

Penambahan
CCC

Coombs test negatif

Negatif benar
(betul-betul negatif?) Negatif palsu ?
kuliah D4
 Protein/globulin non spesifik
(menetralisir antihuman globulin) Kasus NEGATIF PALSU
Mis.
pencucian kurang baik,
kontaminasi protein
Y
Π

+
Π Y

Incomplete CCC
Ab (Coombs Control Cells)

Antihuman globulin
(serum Coombs)

Y
Π
Tidak tjd aglutinasi (reaksi negatif)

kuliah D4

ΠY
 Kasus NEGATIF PALSU
Mis. lupa tdk me + serum Coombs

+
Incomplete CCC
Ab (Coombs Control Cells)

Tidak tjd aglutinasi (reaksi negatif)

kuliah D4
 Kasus NEGATIF BENAR
Π

+
Π

Incomplete CCC
Ab tdk ada (Coombs Control Cells)

Antihuman globulin
(serum Coombs)

Π
Tjd aglutinasi (reaksi positif)

kuliah D4

Π
 Penyebab Positif Palsu

Positip Palsu Keterangan

SDM sdg beragglutinasi sblm Cold antibodi pd pasien

pencucian danpenambahan AHG

Penggunaan peralatan gelas yg Kontaminasi partikel

kotor

Sentrifugasi yg tidak tepat SDM terikat sangat kuat shg

(overcentrifugation) gumpalan tidak bisa terurai
kembali
kuliah D4
 Penyebab Negative Palsu
Negative palsu Keterangan

Pencucian SDM tidak sempurna Globulin nonspesifik yg bebas

mentralisasi AHG
AHG tidak segera diteteskan IgG at C3 yg sudah melakt terlepas
setelah pencucian kembali
Gagal mengenali reaksi positip Kesalahan teknik
lemah
Potensi reagen berkurang Penyimpanan reagen yg tdk tepat,
kontaminasi bakteri
Lupa menambahkan AHG Kesalahan teknk

Sentrifugasi tdk tepat Fase aglutinasi kurang optimal

kuliah D4
(undercentrifugation)
 Coombs Metode Gel

Tidak perlu
AHG sudah
menggunakan
terdapat dlm gel
CCC sbg kontrol
matrix
kualitas

kuliah D4
Cara Pemeriksaan DCT Metode Gel

1.Suspensi 2. Masukkan ke
eritrosit 1 % dlm satu tube
pasien LISS coombs

3.Sentrifuse 10
menit
Baca hasil nya
kuliah D4