IMUNOHISTOKIMIA

PA FK UGM
 IMUNOHISTOKIMIA
• Aplikasi dasar dan teknik imunologi dalam
mempelajari sel dan jaringan
• Dasar: reaksi antigen – antibodi
• Manfaat:
- identifikasi – lokalisasi – karakterisasi
antigen
- menentukan diagnosis, terapi, dan
prognosis kanker
 IMUNOHISTOKIMIA
• Banyak cara/metoda yang dapat dipakai
untuk melokalisir antigen
• Pilihannya tergantung pada kebutuhan
individual dari setiap laboratorium, yaitu:
- jenis jaringan
- derajat sensitivitas
- waktu dan biaya processing
 Antigen
• Biasanya berbentuk protein (kadang karbohidrat)
• Bereaksi dengan bagian (monoklonal) atau bagian-
bagian (poliklonal) antigen yang disebut epitop

Dapat berubah karena fiksasi atau embedding

Cocktail Antibodi
 Antigen
• Beberapa epitop resisten terhadap pemrosesan jaringan
rutin  seleksi antibodi

• Antigen unmasking (antigen retrieval)

– Treatment dengan enzyme
– HIAR ( heat-induced antigen retrieval method): direndam dalam
buffer dan dipanaskan dengan microwave, hot-plate, pembakar
Bunsen, steamer, atau pressure cooker
– Hampir semua antigen berhasil baik dengan HIAR
 Konservasi Antigen
• Antigen, terutama antigen permukaan ekspresi-
nya bisa sangat lemah atau hilang pada: FS dan
proses rutin (fiksasi & embedding)
• Pencegahan dengan jenis fiksasi tertentu:
- fiksasi berbasis alkohol: ethanol, Carnoy,
methacarn  intermediate filament protein
- logam berat: B5 & Zenker  antigen
intranuclear
- Bouin  neuropeptida biogenic amine
- periodate-lysine-paraformaldehida  stabilisasi
lipid, protein, protein membran
    fiksasi dengan formalin bufer fosfat
 Metoda Antigen-retrieval

• Proteolytic digestion
• Heat-induced Antigen Retrieval (HIAR)
• Combined proteolytic digestion & HIAR
 Metoda Antigen-retrieval

Proteolytic Digestion
• Formalin 10% masih merupakan fiksasi yang
paling banyak digunakan  kadang perlu
antigen retrieval
• Formalin menyebabkan cross-linkage antar
protein (terutama asam amino dasar: lysine),
atau yang lain: amino, amido, peptida, guanidil,
hidroksil, karboksil, sulfhidril, aromatik  “mask”
antigen yang dicari.
• Digesti proteolitik akan memecah “masking
cross-linkage”
• Trypsin tipe II 0,25 mg/ml, 37o, 3 menit
 Metoda Antigen-retrieval
Heat-induced Antigen Retrieval (HIAR)

• Dasarnya adalah pemanasan

• HIAR (pemanasan) mulai dari pengukusan, autoclave,
pressure cooker, waterbath, sampai oven microwave
• Shi (1991) pertama kali melakukan dengan microwave
• Pemanasan 100o C dengan microwave sambil direndam
dalam logam berat (Pb tiosianat atau dengan seng
sulfat)  unmasking antigen
• Perendaman juga bisa dengan bufer sitrat 10 mmol
dengan pH 6,0
• Juga baik untuk sediaan sitologi
 Metoda Antigen-retrieval
Combined proteolytic digestion & HIAR

• Kombinasi HIAR dengan dengan digesti

proteolitik memberikan hasil optimal, misalnya
untuk MiB-1dan Ki-67
• Dipakai kombinasi antara tripsin tipe II, 0,25
mg/ml selama 3 menit pada suhu 37o C,
sesudah itu dilanjutkan dengan HIAR

• Sebaliknya pada cytokeratin:HIAR dahulu baru

kemudian digesti proteolitik, hasilnya lebih baik
 Antigen
morfologis tidak bisa diidentifikasi  perlu visualisasi dan dilokalisasi

Teknik pengecatan tertentu berdasarkan reaksi

antigen-antibodi

Imunofluoresen (latar belakang tidak tampak)

Imunohistokimia (immunoenzyme technique)
 Latar belakang tampak
 Imunofluoresen
• Direct method
• Deteksi produk infeksi virus/mikroba,
juga pada tanaman, penyakit ginjal
(komplek antigen-antibodi)
• Pewarna:
- FITC (fluorescein isothiocyanate)
- TRITC (Tetramethylrhodamine isothiocyanate)
 Direct method
Antigen dilokalisasi dengan inkubasi 1 step
dalam antibodi yang dikonjugasi dengan
marker.
FITC / TRITC
Keuntungan: sederhana, hasil cepat
Keterbatasan:
Tidak tampak morfologi latar
Antibodi primer Perlu antibodi terkonjugasi setiap antigen
yang berbeda

Rekomendasi:
- Identifikasi imunoglobulin, komplemen,
komplek imun pada biopsi ginjal dan kulit
- Melokalisasi antigen viral, bakterial, proto-
zoal, dalam smear atau cairan tubuh
Antigen
 Indirect Method

FITC / TRITC

Prosedur dua langkah, pertama inkubasi

Antibodi sekunder dengan antibodi primer, kemudian antibodi
sekunder terkonjugasi

Keuntungan:
Versatility, dan lebih sensitif daripada direct
method.
Antibodi primer Keterbatasan:
Latar tidak tampak
Harus dengan frozen section

Rekomendasi:
Antibodi dalam serum (dipakai sebagai
Antigen antibodi primer: peny. Otoimun, bakterial, dan
parasit)
Ginjal: Immune complex nephritis & anti GBM disease
Ginjal: IgA nephropathy
Produk infeksi virus: Adenovirus
Produk infeksi virus: CMV
Produk infeksi virus: HSV1
Teknik imunohistokimia
Ada dua komponen utama
• Antibodi primer
• Sistem deteksi  identifikasi hasil reaksi antigen-
antibodi
- sistem pewarnaan (chromogen)
- komponen jembatan/penghubung (antibodi sekunder)
 ANTIBODI
• Antibodi adalah suatu immunoglobulin
• Merupakan reagen inti pada teknik
imunohistokimia
• Jumlahnya terus bertambah
• Manfaatnya terus bertambah
 ANTIBODI
• Ada 5 kelas dalam plasma / serum (sesuai
jumlahnya) dalam urutan sbb: IgG – IgA – IgM
– IgD – IgE
• Setiap Ig terdiri dari dua rantai berat (H)
identik dan dua rantai ringan (L) identik
• Rantai H berbeda dalam hal properti antigenik
dan struktural, dan menentukan klas dan
subklas molekul
• Kelas: gamma (IgG), alpha (IgA), mu (IgM),
delta (IgD), dan epsilon (IgE)
• Subkelas: dengan subskrip angka mis. IgG1
• Rantai L ada 2 tipe, kappa & lambda
 ANTIBODI – IgG
• Formula umum: gamma-kappa atau gamma-
lambda
• Struktur molekul ditentukan oleh digesti
proteolitik dan dissosiasi reduktif
• Digesti papain  pecahnya ikatan yang
rentan pada sisi teminal-N dari jembatan
disulfida antar-rantai H  2 Fab (antigen
binding fragment) heterogen monovalent,
dan 1 Fc
• Digesti pepsin  2 Fab, sedang Fc hancur
Struktur Molekul Imunoglobulin

Intra-chain disulfide bond

L
Inter-chain disulfide bond

H
IgG kelinci
Variable domain

Constant domain

Proteolytic digestion
with papain

Pepsin digestion
 Antibodi
• Antibodi sebagian besar dari subklas IgG, dan
sedikit dari IgM
• Antibodi yang bereaksi dengan antigen disebut
antibodi primer
• Tergantung pembuatannya, ada dua jenis
antibodi: antibodi poliklonal (PoAb) dan antibodi
monoklonal (MoAb)
 Antibodi poliklonal (PoAb)
• Antibodi polikonal diproduksi oleh berbagai
macam sel  imunologik tidak sama  PoAb
mengenali berbagai epitop yang berbeda dari
antigen yang sama  lebih sensitif daripada
MoAb
• Kelemahan:
– Masih mengandung antibodi non-spesifik 
tak dikehendaki
– Kecenderungan warna latar yang kuat
– Batch yang berbeda antar pabrik 
komparasi antar-lab sulit
Antibodi poliklonal

Gambaran skematik antibodi

poliklonal mengikat berbagai
epitop pada antigen
Antibodi monoklonal (MoAb)

• Dibuat dengan hibridoma  klon tunggal sel

plasma  antibodi yang hanya mengenali
epitop tunggal  diproduksi dengan
konstan, tak terbatas, dan persis sama
• Sensitivitas mungkin kurang dari PoAb 
cocktail (untuk meningkatkan sensitivitas)
• Sangat spesifik
Antibodi monoklonal

Antibodi monoklonal bereaksi

dengan epitop spesifik pada
antigen
 Sistem Deteksi
• 2 komponen: antibodi sekunder / bridging antibody
dan color development system (sistem pewarna)
• Antibodi sekunder menghubungkan antibodi primer
dengan sistem pewarna  antibodi sekunder (goat
antimouse IgG) merupakan antibodi terhadap
imunoglobulin dari antibodi primer (mouse IgG)
• ABC + DAB/AEC

• Substrat + H2O2 + chromogen (DAB/AEC)

Pitfal: kekeliruan interpretasi
• Misinterpretasi:
– negatif palsu: hilangnya antigenisitas (prosesing),
hilangnya aktivitas antibodi primer
– positif palsu: non-spesific staining
• Hasil palsu karena terjadi sesuatu pada:
– Jaringan
– Antibodi primer
– Antibodi sekunder
– Sistem deteksi
• Perlu kontrol eksternal dan internal
Pitfal: kekeliruan interpretasi
• Hasil palsu karena terjadi sesuatu pada:
– Jaringan: antibodi terlalu pekat, antigen masking  HIAR
– Antibodi primer:
- bila kurang spesifik  non-specific binding  false positive
(terutama antibodi poliklonal)
- antibodi rusak
– Antibodi sekunder:
- = antibodi primer
- tidak cocok  false negative
– Sistem deteksi: endogenous peroxidase activity
 Hasil Positif Palsu
• Reaksi silang dengan antigen yang lain
• Pengikatan non-spesifik antibodi kepada
jaringan
• Adanya peroksidase endogen dalam elemen
selular
• Jaringan normal terperangkap di dalam jaringan
tumor (jar.otot dalam tumor jaringan lunak  rhabdo-
myosarkoma; jaringan tiroid dalam limfoma maligna 
dikira karsinoma tiroid; dll.)
• Lepasnya protein sitoplasma sel normal karena
invasi tumor  permeasi ke dalam sel
interstisial atau fagositosis  positif palsu
 Hasil Negatif Palsu
• Antibodi tidak cocok, rusak, atau
konsentrasi tidak tepat
• Antigen hilang/habis karena otolisis atau
difusi, misalnya bila jaringan terlalu lama
dalam formalin  lebih baik dalam blok
• Keberadaan/densitas antigen di bawah
level kemampuan deteksi oleh reagen
atau teknik yang digunakan, ini karena
produksi yang rendah atau hilang
 Direct method
Antigen dilokalisasi dengan inkubasi 1 step
dalam antibodi yang dikonjugasi dengan
marker.
Enzim peroxidase
Keuntungan: sederhana, hasil cepat
Keterbatasan:
Hasil inkonsisten (parafin)
Antibodi primer Perlu antibodi terkonjugasi setiap antigen
yang berbeda

Rekomendasi:
- Identifikasi imunoglobulin, komplemen,
komplek imun pada biopsi ginjal dan kulit
- Melokalisasi antigen viral, bakterial, proto-
zoal, dalam smear atau cairan tubuh
Antigen
 Indirect Method
Enzim peroxidase

Prosedur dua langkah, pertama inkubasi

Antibodi sekunder dengan antibodi primer, kemudian antibodi
sekunder terkonjugasi

Keuntungan:
Versatility, dan lebih sensitif daripada direct
method.
Antibodi primer Keterbatasan:
Makan waktu
Hasil terbaik dengan frozen section

Rekomendasi:
Antibodi dalam serum (dipakai sebagai
Antigen antibodi primer: peny. Otoimun, bakterial, dan
parasit)
 Peroxidase-anti-
Peroxidase

Enzim peroxidase
3. PAP-complex
Anti peroxidase

Keuntungan:
Lebih sensitif daripada conjugated antibodies
Hasil pewarnaan sangat baik
2. Antibodi sekunder
Keterbatasan:
Makan waktu
Spesies untuk pembuatan PAP complex = antibodi
1. Antibodi primer primer
Rekomendasi:
Identifikasi tumor tanpa tergantung morfologi atau
diferensiasi
Antigen Lokalisasi ultrastruktur  plastik resin
Avidin-Biotin-Complex (ABC)
Enzim peroxidase
Biotin 3. Komplek konjugasi
Avidin
Teknik ini memanfaatkan kemampuan gliko-
protein avidin untuk mengikat 4 molekul biotin

2. Antibodi sekunder terkonjugasi biotin

1. Antibodi primer spesifik untuk antigen tertentu

Keuntungan:
Komplek konjugasi dapat dipakai untuk setiap
jenis antibodi (beda spesies)
Hasil sangat baik pada preparat blok parafin
Keterbatasan: makan waktu, dan reagensia
harus cocok dan dilusiharus akurat
Rekomendasi:
Antigen Antigen permukaan jumlah sedikit
Bagus untuk blok parafin yang disimpan lama
 Lokasi antigen
• Dalam inti
• Dalam sitoplasma
• Dalam sitoplasma dan inti
• Membran sitoplasma: luminal (CA242)
Nuclear staining
Nuclear staining
Nuclear staining
Nuclear staining
Nuclear staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
Cytoplasmic staining
 Chromogranin: tumor Carcinoid (gaster)

Antibodi primer ini negatif pada ca gaster. Keluarga kromogranin, tersusun

oleh glikoprotein asam dengan berat molekul 20 – 100 kD, lokasi di dalam
fraksi-fraksi terlarut, terdiri dari chromogranin A, chromogranin B (screto-
granin I), dan chromogranin C (secretogranin II)  hampir setiap tumor
neuroendokrin positif  “pan-endocrine” marker
 Factor VIII – related antigen

Diekspresikan pada sitoplasma sel tumor epitheloid vascular tumor

of bone, merupakan satu dari 3 faktor hemofili (faktor VIII).
Disintesis dalam endotel, dan dapat ditemukan juga dalam
megakariosit, sel mast, trombosit.
Marker untuk diferensiasi endotel.
 Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)
Malignant Astrocytoma

Suatu filamen intermedate dalam sitoplasma (MW: 48-52.000)

Ekspresi pada sel normal, sel reaktif, dan neoplasma sel ependym,
serta membentuk oligodendrocytes neoplastic. Juga positif pada
peripheral nerve sheath tumor dan mixed tumor pada kelenjar
ludah dan keringat
Human Chorionic Gonadotropin-hCG

Seminoma dgn trophoblast-like giant cell.

Normal disekresi oleh sinsitiotrofoblastus, terdiri dari 2 rantai.
Rantai alfa mirip dengan FSH, LH, dan TSH. Rantai beta sebagai
unsur spesifik hormon  aktif biologik.
Untuk deteksi neoplasma trofoblastik dan hCG ektopik
 Epithelial Membrane Antigen (EMA)

Glikoprotein yang didapatkan pada membran globulus lemak susu manusia

EMA pada Paget’s disease, kadang diperlukan untuk membedakan
dengan koilocytosis karena infeksi HPV  pre-kanker untuk SCC
Marker yang baik untuk banyak epitel normal maupun neoplastik.
Diekspresikan juga pada: mesotelioma, meningioma, beberapa tumor
mesenkimal dan limfoma
 Metastasis Karsinoma Lobular ke Tiroid

Antibodi primer: thyroglobulin. Thyroglobulin berasal dari folikel

tiroid yang terperangkap merembes ke sela interselular 
Positif (warna merah)
 Keratin/Cytokeratin
• Family of water-insoluble , intracellular fibrous
proteins present in almost all epithelia
• 20 sub-klas
• Berat mol 40 – 68 kD
• pH isoelektrik: 5 – 8
• Baik untuk marker diferensiasi epitel, tak peduli
apakah tumor berasal dari endodermal, neuro-
ektodermal, mesenkimal, atau sel benih
• CK8 & CK18 diekspresikan juga pada jaringan
non-epitelial dan neoplasmanya
 Keratin/Cytokeratin
Contoh Ekspresi Keratin
• CK8 & CK18 : diekspresikan juga pada jaringan non-
epitelial dan neoplasmanya
• 34β12 : sel basal  DD antara Ca prostat dif. baik
dengan BPH
• CK7+/CK20+ : Ca pankreas, bile duct, urothelium
(masing-masing 65%), dan gaster (33%)
• CK7+/CK20- : Ca paru, mama, endometrium, ovarium,
tiroid, kel.ludah, mesotelioma.
• CK7-/CK20+ : Ca kolon (95%), sel Merkel, gaster
(33%)
• CK7-/CK20- : Ca kortex adrenal, hati, ginjal, kelenjar
adrenal
• CK5/CK6 : DD mesotelioma dengan Ca paru; SCC, Ca
kelenjar ludah, timoma
 Keratin

Ca anaplastik pankreas Thymoma tipe B1,

lymphocyte rich
 CMV

Colitis viral: penderita immunosuppressed

 Calcitonin

hiperplasia sel C pada tiroid

 Insulin
Ovarium – tumor karsinoid
Prostatic Specific Antigen PSA
karsinoma prostat
 Protein S-100

Warna tampak pada sitoplasma dan inti

Thyroglobulin

Ca tiroid dif. Jelek (insular)

 Imunoperoksidase

A: peroxidase antibody conjugate, direct; B: peroxidase antobody conjugate,

indirect; C: labeled antigen method; D: Enzyme bridge procedure;
E: peroxodase-anti-peroxidase, PAP immune complex method

Antigen PX: peroxidase

 Biotin-Avidin Immunoenzymatic Techniques

Biotinylated primary antibody method

Antigen
Biotinylated peroxidase method

Avidin-biotin-peroxidase complex method

 Kontrol
Kontrol reagen
Kontrol prosedur
• Penggantian reagen
Antibodi primer
Reagen lain
• Kontrol jaringan
Kontrol jaringan negatif
Kontrol jaringan positif
Kontrol jaringan internal