IMUNOHISTOKIMIA

IMUNOHISTOKIMIA
Aplikasi dasar dan teknik imunologi dalam
mempelajari sel dan jaringan
Dasar: reaksi antigen – antibodi
Manfaat:
- Identifikasi
– Lokalisasi
– Karakterisasi antigen
- Menentukan diagnosis, terapi, dan
prognosis kanker
IMUNOHISTOKIMIA
Banyak cara yang dapat dipakai untuk
melokalisir antigen
Tergantung pada kebutuhan individual,
yaitu:
- jenis jaringan
- derajat sensitivitas
- waktu dan biaya processing
Antigen
 umumnya berbentuk protein (kadang
karbohidrat)
 Bereaksi dengan bagian (monoklonal) atau
bagian-bagian (poliklonal) antigen yang disebut
epitop

 Dapat berubah karena fiksasi atau embedding

 Cocktail Antibodi
Antigen
 Perludilakukan seleksi antibodiBeberapa epitop
resisten terhadap pemrosesan jaringan rutin

 Antigen unmasking (antigen retrieval)

◦ Treatment dengan enzyme
◦ HIAR ( heat-induced antigen retrieval method):
direndam dalam buffer dan dipanaskan dengan
microwave, hot-plate, pembakar Bunsen, steamer, atau
pressure cooker
◦ Hampir semua antigen berhasil baik dengan HIAR
Konservasi Antigen
 Antigen, terutama antigen permukaan ekspresi-
nya bisa sangat lemah atau hilang pada: FS dan
proses rutin (fiksasi & embedding)
 Pencegahan dengan jenis fiksasi tertentu:
- Fiksasi berbasis alkohol: ethanol, Carnoy,
methacarn  intermediate filament protein
- Logam berat: B5 & Zenker  antigen
intranuclear
- Bouin  neuropeptida biogenic amine
- Periodate-lysine-paraformaldehida  stabilisasi
lipid, protein, protein membran
     fiksasi dengan formalin bufer fosfat
Metoda Antigen-retrieval
Proteolytic
digestion
Heat-induced Antigen Retrieval (HIAR)
Combined proteolytic digestion & HIAR
Metoda Antigen-retrieval
Proteolytic Digestion
Formalin 10% masih merupakan fiksasi
yang paling banyak digunakan  kadang
perlu antigen retrieval
Formalin menyebabkan cross-linkage
antar protein (terutama asam amino
dasar: lysine), atau yang lain: amino,
amido, peptida, guanidil, hidroksil,
karboksil, sulfhidril, aromatik  “mask”
antigen yang dicari.
Digesti proteolitik akan memecah
“masking cross-linkage”
Trypsin tipe II 0,25 mg/ml, 37o, 3 menit
Metoda Antigen-retrieval
Heat-induced Antigen Retrieval (HIAR)

 Dasarnya adalah pemanasan

 HIAR (pemanasan) mulai dari pengukusan,
autoclave, pressure cooker, waterbath, sampai
oven microwave
 Shi (1991) pertama kali melakukan dengan
microwave
 Pemanasan 100o C dengan microwave sambil
direndam dalam logam berat (Pb tiosianat atau
dengan seng sulfat)  unmasking antigen
 Perendaman juga bisa dengan bufer sitrat 10
mmol dengan pH 6,0
 Juga baik untuk sediaan sitologi
Metoda Antigen-retrieval
Combined proteolytic digestion & HIAR

Kombinasi HIAR dengan dengan digesti

proteolitik memberikan hasil optimal,
misalnya untuk MiB-1dan Ki-67
Dipakai kombinasi antara tripsin tipe II, 0,25
mg/ml selama 3 menit pada suhu 37o C,
sesudah itu dilanjutkan dengan HIAR

Sebaliknya pada cytokeratin:HIAR dahulu

baru kemudian digesti proteolitik, hasilnya
lebih baik
Antigen
morfologis tidak bisa diidentifikasi  perlu visualisasi dan
dilokalisasi

Teknik pengecatan tertentu berdasarkan

reaksi antigen-antibodi

Imunofluoresen (latar belakang tidak tampak)

Imunohistokimia (immunoenzyme
technique)  Latar belakang tampak
Imunofluoresen
Direct method
Deteksi produk infeksi virus/mikroba,
juga pada tanaman, penyakit ginjal
(komplek antigen-antibodi)
Pewarna:
 - FITC (fluorescein isothiocyanate)
 - TRITC (Tetramethylrhodamine
isothiocyanate)
Direct method
Antigen dilokalisasi dengan inkubasi 1 step
dalam antibodi yang dikonjugasi dengan
marker.
FITC / TRITC
Keuntungan: sederhana, hasil cepat
Keterbatasan:
Tidak tampak morfologi latar
Antibodi primer Perlu antibodi terkonjugasi setiap antigen
yang berbeda

Rekomendasi:
- Identifikasi imunoglobulin, komplemen,
komplek imun pada biopsi ginjal dan kulit
- Melokalisasi antigen viral, bakterial, proto-
zoal, dalam smear atau cairan tubuh
Antigen
Indirect Method

FITC / TRITC

Prosedur dua langkah, pertama inkubasi

Antibodi sekunder dengan antibodi primer, kemudian antibodi
sekunder terkonjugasi

Keuntungan:
Versatility, dan lebih sensitif daripada direct
method.
Antibodi primer Keterbatasan:
Latar tidak tampak
Harus dengan frozen section

Rekomendasi:
Antibodi dalam serum (dipakai sebagai
Antigen antibodi primer: peny. Otoimun, bakterial, dan
parasit)
Ginjal: Immune complex nephritis & anti GBM disease
Ginjal: IgA nephropathy
Produk infeksi virus: Adenovirus
Produk infeksi virus: CMV
Teknik imunohistokimia
 Ada dua komponen utama
 Antibodi primer
 Sistem deteksi  identifikasi hasil reaksi
antigen-antibodi
 - sistem pewarnaan (chromogen)
 - komponen jembatan/penghubung (antibodi sekunder)
ANTIBODI
Antibodiadalah suatu immunoglobulin
Merupakan reagen inti pada teknik
imunohistokimia
Jumlahnya terus bertambah
Manfaatnya terus bertambah
ANTIBODI
Ada 5 kelas dalam plasma / serum
(sesuai jumlahnya) dalam urutan sbb:
IgG – IgA – IgM – IgD – IgE
Setiap Ig terdiri dari dua rantai berat (H)
identik dan dua rantai ringan (L) identik
Rantai H berbeda dalam hal properti
antigenik dan struktural, dan
menentukan klas dan subklas molekul
Kelas: gamma (IgG), alpha (IgA), mu
(IgM), delta (IgD), dan epsilon (IgE)
Subkelas: dengan subskrip angka mis.
IgG1
Rantai L ada 2 tipe, kappa & lambda
ANTIBODI – IgG
Formula umum: gamma-kappa atau
gamma-lambda
Struktur molekul ditentukan oleh
digesti proteolitik dan dissosiasi
reduktif
Digesti papain  pecahnya ikatan yang
rentan pada sisi teminal-N dari
jembatan disulfida antar-rantai H  2
Fab (antigen binding fragment)
heterogen monovalent, dan 1 Fc
Digesti pepsin  2 Fab, sedang Fc
hancur
Struktur Molekul Imunoglobulin

Intra-chain disulfide bond

L
Inter-chain disulfide bond

H
IgG kelinci
Variable domain

Constant domain

Proteolytic digestion
with papain

Pepsin digestion
Antibodi
Antibodi sebagian besar dari subklas IgG,
dan sedikit dari IgM
Antibodi yang bereaksi dengan antigen
disebut antibodi primer
Tergantung pembuatannya, ada dua jenis
antibodi: antibodi poliklonal (PoAb) dan
antibodi monoklonal (MoAb)
Antibodi poliklonal (PoAb)
Antibodi polikonal diproduksi oleh
berbagai macam sel  imunologik tidak
sama  PoAb mengenali berbagai epitop
yang berbeda dari antigen yang sama 
lebih sensitif daripada MoAb
Kelemahan:
◦ Masih mengandung antibodi non-spesifik 
tak dikehendaki
◦ Kecenderungan warna latar yang kuat
◦ Batch yang berbeda antar pabrik 
komparasi antar-lab sulit
Antibodi poliklonal

Gambaran skematik antibodi

poliklonal mengikat berbagai
epitop pada antigen
Antibodi monoklonal (MoAb)
Dibuat dengan hibridoma  klon tunggal
sel plasma  antibodi yang hanya
mengenali epitop tunggal  diproduksi
dengan konstan, tak terbatas, dan persis
sama
Sensitivitas mungkin kurang dari PoAb 
cocktail (untuk meningkatkan sensitivitas)
Sangat spesifik
Antibodi monoklonal

Antibodi monoklonal bereaksi

dengan epitop spesifik pada
antigen
Sistem Deteksi
2 komponen: antibodi sekunder / bridging
antibody dan color development system (sistem
pewarna)
 Antibodi sekunder menghubungkan antibodi primer
dengan sistem pewarna  antibodi sekunder (goat
antimouse IgG) merupakan antibodi terhadap
imunoglobulin dari antibodi primer (mouse IgG)
 ABC + DAB/AEC

 Substrat + H2O2 + chromogen (DAB/AEC)

Pitfal: kekeliruan interpretasi
 Misinterpretasi:
◦ negatif palsu: hilangnya antigenisitas
(prosesing), hilangnya aktivitas antibodi
primer
◦ positif palsu: non-spesific staining
 Hasil
palsu karena terjadi sesuatu
pada:
◦ Jaringan
◦ Antibodi primer
◦ Antibodi sekunder
◦ Sistem deteksi
 Perlu kontrol eksternal dan internal
Pitfal: kekeliruan interpretasi
 Hasil palsu karena terjadi sesuatu pada:
◦ Jaringan: antibodi terlalu pekat, antigen masking  HIAR
◦ Antibodi primer:
◦ - bila kurang spesifik  non-specific binding  false positive
◦ (terutama antibodi poliklonal)
◦ - antibodi rusak
◦ Antibodi sekunder:
◦ - = antibodi primer
◦ - tidak cocok  false negative
◦ Sistem deteksi: endogenous peroxidase activity
Hasil Positif Palsu
Reaksi silang dengan antigen yang lain
Pengikatan non-spesifik antibodi kepada
jaringan
Adanya peroksidase endogen dalam
elemen selular
Jaringan normal terperangkap di dalam
jaringan tumor (jar.otot dalam tumor jaringan lunak
 rhabdo-myosarkoma; jaringan tiroid dalam limfoma
maligna  dikira karsinoma tiroid; dll.)
Lepasnya protein sitoplasma sel normal
karena invasi tumor  permeasi ke dalam
sel interstisial atau fagositosis  positif
palsu
Hasil Negatif Palsu
Antibodi tidak cocok, rusak, atau
konsentrasi tidak tepat
Antigen hilang/habis karena otolisis atau
difusi, misalnya bila jaringan terlalu lama
dalam formalin  lebih baik dalam blok
Keberadaan/densitas antigen di bawah
level kemampuan deteksi oleh reagen
atau teknik yang digunakan, ini karena
produksi yang rendah atau hilang
Direct method
Antigen dilokalisasi dengan inkubasi 1 step
dalam antibodi yang dikonjugasi dengan
marker.
Enzim peroxidase
Keuntungan: sederhana, hasil cepat
Keterbatasan:
Hasil inkonsisten (parafin)
Antibodi primer Perlu antibodi terkonjugasi setiap antigen
yang berbeda

Rekomendasi:
- Identifikasi imunoglobulin, komplemen,
komplek imun pada biopsi ginjal dan kulit
- Melokalisasi antigen viral, bakterial, proto-
zoal, dalam smear atau cairan tubuh
Antigen
Indirect Method

Enzim peroxidase

Prosedur dua langkah, pertama inkubasi

Antibodi sekunder dengan antibodi primer, kemudian antibodi
sekunder terkonjugasi

Keuntungan:
Versatility, dan lebih sensitif daripada direct
method.
Antibodi primer Keterbatasan:
Makan waktu
Hasil terbaik dengan frozen section

Rekomendasi:
Antibodi dalam serum (dipakai sebagai
Antigen antibodi primer: peny. Otoimun, bakterial, dan
parasit)
 Peroxidase-anti-
Peroxidase

Enzim peroxidase
3. PAP-complex
Anti peroxidase

Keuntungan:
Lebih sensitif daripada conjugated antibodies
Hasil pewarnaan sangat baik
2. Antibodi sekunder
Keterbatasan:
Makan waktu
Spesies untuk pembuatan PAP complex = antibodi
1. Antibodi primer primer
Rekomendasi:
Identifikasi tumor tanpa tergantung morfologi atau
diferensiasi
Antigen Lokalisasi ultrastruktur  plastik resin
Avidin-Biotin-Complex (ABC)
Enzim peroxidase
Biotin 3. Komplek konjugasi
Avidin
Teknik ini memanfaatkan kemampuan gliko-
protein avidin untuk mengikat 4 molekul biotin

2. Antibodi sekunder terkonjugasi biotin

1. Antibodi primer spesifik untuk antigen tertentu

Keuntungan:
Komplek konjugasi dapat dipakai untuk setiap
jenis antibodi (beda spesies)
Hasil sangat baik pada preparat blok parafin
Keterbatasan: makan waktu, dan reagensia
harus cocok dan dilusiharus akurat
Rekomendasi:
Antigen Antigen permukaan jumlah sedikit
Bagus untuk blok parafin yang disimpan lama
Lokasi antigen
Dalam inti
Dalam sitoplasma
Dalam sitoplasma dan inti
Membran sitoplasma: luminal (CA242)
 Imunoperoksidase

A: peroxidase antibody conjugate, direct; B: peroxidase antobody conjugate,

indirect; C: labeled antigen method; D: Enzyme bridge procedure;
E: peroxodase-anti-peroxidase, PAP immune complex method

Antigen PX: peroxidase

 Biotin-Avidin Immunoenzymatic Techniques

Biotinylated primary antibody method

Antigen
Biotinylated peroxidase method

Avidin-biotin-peroxidase complex method

Kontrol
Kontrol reagen
Kontrol prosedur
Penggantian reagen
Antibodi primer
Reagen lain
Kontrol jaringan
◦ Kontrol jaringan negatif
◦ Kontrol jaringan positif
◦ Kontrol jaringan internal
Clear cell renal cell carcinoma
Pewarnaan untuk menggambarkan inti pada
ccRCC dan neoplasma epitel ginjal lainnya
adalah PAX8 dan faktor transkripsi 48 kDa.
PAX2 hadir dalam distribusi yang sama pada
PAX8, tetapi PAX8 lebih sensitive.
Carbonic anhydrase IXmemiliki peran sebagai
tranportasi karbon dioksida dan pengaturan
pH dan dapat diekspresikan dalam distribusi
membran difus pada 75-100% ccRCC
ccRCCmengekspresikan pewarnaan epitel
seperti cytokeratin AE1/AE3, CAM5.2, dan
antigen membran epitel.
Ekspresi CK7 jarang mengekspresikan sel
atau kelompok selpada tumor dan tumor
high-grade tinggi dengan komponen kistik.
CK7 sering digunakan untuk membedakan
ccRCC dari chromophobe RCC, Vimentin
positif dalam ccRCC terutama pada yang high
grade
Papillary renal cell carcinoma

Khususnya tipe 1 PRCC sering

menunjukkan imunohistokimia positif
reaksi untuk cytokeratin AE1/AE3,
CAM5.2, high-molecular weight
cytokeratins,epithelial membrane antigen,
AMACR, antigen RCC, vimentin, danCD10.
Ekspresi CK7 lebih umum pada PRCCtipe
1 daripada tipe 2. 
Chromophobe renal cell carcinoma

ChRCC positif untuk KIT, parvalbumin,

dan cadherin khusus ginjal.CK7 sering
positif, tetapi pewarnaan mungkin fokus
pada sel eosinofil. Vimentin biasanya
negatif.
Medullary Renal Carcinoma

Tumor selalu positif dengan PAX8 (yang

sesuaidengan histogenesis ginjal),
polyclonal carcinoembryonic antigen, CK7,
CAM5.2, dan Ulex europaeus agglutinin-1
positif pada lebih dari setengah dari
semua kasus. HilangnyaSMARCB1 (juga
disebut INI1) dan marker stem
cellOCT3/4 (juga disebut POU5F1) bisa
membantu diagnostik.6,21
Mucinous tubular and spindle cell
carcinoma

Secaraimunohistokimia, tumorSel
umumnya positif untuk CK7,PAX2, dan
AMACR
Acquired cystic disease-associated
renal cell carcinoma
Acquired cystic disease-associated renal
cell carcinomapositifterhadap marker RCC
yaitu CD10 dan AMACR. Sebaliknya, CK7
tidak terkekspresi
Multilocular cystic renal neoplasm
of low malignant potential

Sel-sel tumor sangat immunoreaktif

terhadap PAX8 dan carbonat anhidrase IX,
seperti halnya pada ccRCC
Clear cell papillary renal cell
carcinoma

Sel-sel tumor memiliki kepekaan terhadap

CK7 difus,karbonic anhydrase IX positivity
dalam distribusi seperti cup, dan negatif
pada racemase. PAX2, PAX8,dan 34βE 12
positif, dan CD10 biasanya negatif atau
positif secara fokal
Unclassified renal cell carcinoma

Immunohistokimia bermanfaat untuk

mendukung histogenesis marker ginjal
termasuk PAX8, PAX2, penanda RCC,
danCD 10.18,28