HUBUNGAN KEKERABATAN TIGA SPESIES TANAMAN

SELADA (Lactuca spp.), BERDASARKAN PROFIL MOLEKULER

MENGGUNAKAN MARKA RAPD

USULAN PENELITIAN

ALEXANDER JASON
B1A018049

KEMENTERIAN PENDIDIKAN, KEBUDAYAAN, RISET

DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2022
 HUBUNGAN KEKERABATAN TIGA SPESIES TANAMAN
SELADA (Lactuca spp.), BERDASARKAN PROFIL MOLEKULER
MENGGUNAKAN MARKA RAPD

ALEXANDER JASON
B1A018049

Diajukan sebagai Pedoman Pelaksanaan Penelitian Studi Akhir

pada Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman
Purwokerto

Disetujui dan disahkan

pada tanggal Februari 2022

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Puji Widodo, MSc. Dr.sc.Agr. Nurtjahjo Dwi Sasongko, M.App.Sc .

NIP 196007151986011001 NIP 196309051987031002

Mengetahui,

Wakil Dekan Bidang Akademik Fakultas Biologi

Universitas Jenderal Soedirman

Dr. Hendro Pramono, M.S.

NIP 19590722 198601 1
i
001

ii
 PRAKATA

Usulan penelitian ini ditulis sebagai pedoman pelaksanaan penelitian

studi akhir di Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman yang bertujuan
memenuhi syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains. Penulis mengambil
judul “Hubungan Kekerabatan Tiga Spesies Tanaman Selada (Lactuca spp.),
Berdasarkan Profil Molekuler Menggunakan Marka RAPD”. Penulis
mengucapkan puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat serta
tuntunan-Nya sehingga usulan penelitian ini dapat disusun. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Hendro Pramono, MS. Selaku Wakil
Dekan Bidang Akademik Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman yang
telah memberi izin untuk pelaksanaan usulan penelitian. Ucapan terima kasih juga
disampaikan kepada Bapak Dr.sc.Agr. Nurtjahjo Dwi Sasongko, M.App.Sc. atas
bimbingan dan arahan dalam bidang Genetika, dan Bapak Dr. Puji Widodo,
MSc. atas bimbingan dan arahan dalam bidang Sistematika Tumbuhan, serta
semua pihak yang telah berkontribusi dalam penyusunan usulan penelitian ini.

Purwokerto, 23 Februari
2022

Penulis

iii
 DAFTAR ISI

PRAKATA .......................................................................................................... ii
DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii
DAFTAR TABEL ............................................................................................... iv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... v
DAFTAR SATUAN DAN SINGKATAN ....................................................... vi
RINGKASAN ..................................................................................................... vii
I. PENDAHULUAN ................................................................................... 1
II. TELAAH PUSTAKA .............................................................................. 3
III. METODE PENELITIAN ........................................................................ 6
A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian ..............................................
6 1.
Materi Penelitian .........................................................................
6
2. Lokasi dan Waktu Penelitian ..................................................... 6
B. Rancangan Penelitian ......................................................................... 7
1. Rancangan Percobaan ................................................................. 7
2. Parameter Penelitian ................................................................
8 3.
Cara Kerja Penelitian ..................................................................
8
4. Analisis Data ............................................................................... 11
C. Bagan Alir Penelitian .......................................................................... 11
JADWAL PENELITIAN ................................................................................... 12
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 13
LAMPIRAN ........................................................................................................ 16

iv
 DAFTAR TABEL

Tabel 3.1. Marka RAPD ....................................................................................................... 9

Tabel 3.2. Jadwal Penelitian ................................................................................................. 12

v
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Spesifikasi Peralatan ........................................................................................ 16

Lampiran 2. Spesifikasi Bahan ............................................................................................. 17

vi
 DAFTAR SATUAN DAN SINGKATAN

Simbol Satuan Deskripsi

µL Mikroliter Volume
mL Mililiter Volume
°C Derajat Celsius Temperatur
kb Kilobase pair Ukuran DNA
mg Miligram Massa/Berat
nm Nanometer Panjang gelombang
V Voltase Tegangan Listrik
mA Miliampere Arus listrik
Rpm Rotasi per menit Kecepatan sentrifugasi
ng Nanogram Massa/Berat

Simbol Arti
% Persen

Singkatan Arti
PCR Polymerase Chain Reaction
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
DNA Deoxyribo Nucleic Acid (Asam Deoksiribonukleat)
TAE Tris-HCl, Asam asetat glasial, EDTA
EtBr Ethidium Bromide
UV Ultraviolet
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

vii
 RINGKASAN

Tanaman selada (Lactuca spp.) merupakan anggota famili Asteraceae

yang terdiri dari banyak spesies, dan sering dimanfatkan sebagai sayuran. Selada
hijau (L. sativa) misalnya, memiliki nilai ekonomis yang cukup tinggi karena
kandungan nutrisinya seperti: serat, vitamin, protein, dan mineral yang lengkap
untuk memenuhi syarat kebutuhan gizi.. Hal tersebut menyebabkan permintaan
terhadap jenis selada ini meningkat, dan mendorong para petani untuk
melakukan perbaikan terhadap budidaya tanaman selada untuk meningkatkan
produksi. Sementara itu, selada berduri (L. serriola), yang juga merupakan salah
satu anggota genus Lactuca, hanya dimanfaatkan sebagai bahan obat, khususnya
karena kandungan getahnya. Keterbatasan pemanfaatan ini menyebabkan selada
berduri belum dibudidayakan, sehingga terkesan sebagai tanaman liar. Spesies
lainnya, selada India (L. indica), juga dikenal sebagai tanaman obat yang tumbuh
secara liar. Penelitian tentang ke-tiga spesies tanaman ini baik dalam kajian
morfologi, kandungan flavonoid dan molekulernya belum pernah dilaporkan ada
di Indonesia, Penelitian kali ini merupakan sebuah lompatan karena dilakukan
berdasarkan karakter molekuler yang hasilnya diyakini tidak dipengaruhi faktor
lingkungan. Karakter molekuler digunakan untuk melihat hubungan kekerabatan
antara ke tiga spesies yang terkesan jauh berbeda, dengan menggunakan penanda
molekuler RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui profil RAPD serta keragaman Genetik ketiga spesies
tersebut. Penelitian kali ini menggunakan teknik pengambilan sampel secara acak.
Parameter yang digunakan adalah konsentrasi DNA, kemurnian DNA, dan pita
polimorfik sebagai hasil amplifikasi.

Kata kunci: perbedaan genetik, selada berduri, selada hijau, selada India

viii
 I. PENDAHULUAN

Di Indonesia, komoditas hortikultural memiliki nilai ekonomi yang sangat

tinggi, serta potensi pasar yang terbuka lebar, baik di pasar domestik maupun
ekspor (Prasetyo & Lazuardi, 2019). Secara umum, komoditas tanaman
hortikultural sering dikomsumsi sebagai sayuran segar dalam salad ataupun
dimasak, karena memiliki banyak manfaat terutama bagi kesehatan tubuh
(Haryanto, 2007). Oleh karena itu, komoditas tanaman ini mempunyai prospek
pengembangan yang sangat baik, salah satunya adalah tanaman selada (Lactuca
spp.) karena nilai gizi serta manfaat yang relatif baik (Prasetyo & Lazuardi, 2019).
Menurut Badan Pusat Statistik (2014), nilai impor tanaman selada semakin
meningkat, tetapi nilai ekspor tanaman selada semakin menurun. Hal tersebut
menunjukkan bahwa produksi selada belum memenuhi kebutuhan dalam negeri,
sehingga mendorong petani untuk melakukan perbaikan terhadap budidaya tanaman
selada untuk meningkatkan produksi dalam negeri (Badan Pusat Statistik, 2014).
Selada hijau (L. sativa) adalah tanaman semusim, berasal dari kawasan Asia
Barat dan Amerika yang sudah menyebar secara luas ke berbagai negara termasuk
Indonesia (Prasetio, 2013). Menurut Setyaningrum & Saparinto (2011), Kandungan
gizi yang terdapat dalam selada hijau, yaitu kalsium, fosfor, dan besi, serta
memiliki kandungan vitamin antara lain Vitamin A, B, & C. Sementara itu selada
berduri (L. serriola) merupakan spesies tanaman herba, yang dapat ditemukan di
kawasan Eropa, Afrika, Amerika, dan Asia, salah satunya di Indonesia (Mieslerova
et al., 2013). Tanaman ini mengandung getah seperti susu yang terdapat di
sepanjang batang, sehingga tanaman tesebut lebih banyak digunakan dalam
berbagai tujuan pengobatan sebagai obat penenang, ekspektoran, pencahar, penekan
batuk, antiseptik, diuretik, dan antispasmodik. Selada berduri (L. serriola) kaya
akan lactucarium dan terdiri dari berbagai nutrisi mineral, vitamin, antioksidan
alami, flavonoid, dan fenolat (El-Esawi et al., 2017). Selada India (L. indica) juga
merupakan salah satu tanaman herba yang dapat ditemukan pada kawasan Asia
seperti Indonesia, Korea, Jepang, Cina, dan India (Panjaitan & Silalahi, 2020).
Tanaman ini dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai penambah nafsu makan,
penambah stamina, memperlancar pencernaan, mengobati sakit lambung,
menurunkan kolestrol dan kadar gula darah (Hepni, 2019). Tanaman ini

1
mengandung Vitamin A & C, mineral, serta senyawa golongan fenolik dan polifenol
seperti flavonoid (Harikrishnan et al., 2011).
Menurut Anggraheni & Mulyaningsih (2018), pendekatan molekuler dapat
digunakan untuk mengetahui perbedaan tanaman selada hijau, selada berduri, dan
selada India tersebut, yaitu dengan identifikasi marka molekuler, yang dapat
digunakan untuk memperlihatkan perbedaan genetik dalam waktu yang singkat dan
pada tingkat yang lebih rinci tanpa dipengaruhi oleh aspek lingkungan. Penelitian
Subosisti et al. (2020), menegaskan agar tidak terjadi kesalahan dalam identifikasi
spesies tanaman yang memiliki ciri morfologi dan kandungan senyawa fitokimia
yang sangat mirip tetapi sebenarnya berbeda spesies atau kultivar seperti halnya
tanaman selada. Marka molekuler dalam kasus di atas juga dapat digunakan dalam
upaya autentikasi dan standardisasi tanaman obat, sehingga dengan demikian akan
diperoleh jaminan atas kemurnian, keamanan, potensi, dan efikasi pengobatan
herbal.
Beberapa cara untuk mendeteksi keragaman genetik, yaitu dengan analisis
DNA, salah satunya adalah Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan
primer pendek yang membentuk oligonukleotida, menjadi penanda molekuler
secara acak Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), metode ini
dipergunakan karena dapat mengidentifikasi jenis tumbuhan dalam waktu singkat
dan murah (Purnaningsih, 2013). RAPD juga telah terbukti menjadi penanda
molekuler yang baik untuk tujuan pengujian keragaman genetik pada beberapa
sampel karena membutuhkan sedikit sampel DNA untuk membentuk ekspresi
ontogeni independen dengan sidik jari DNA yang tepat dan menghasilkan karakter
yang relatif tidak terbatas sehingga dapat membantu untuk keperluan analisis
variabilitas genetik tanaman yang tidak diketahui latar belakang genomnya
(Istiqomah et al., 2016). Kelemahan menggunakan metode RAPD adalah
repoduktifitas yang rendah, namun dapat diatasi dengan konsistensi kondisi PCR
(Wijaya et al., 2009).
Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk:
1. Mengetahui profil RAPD tanaman selada hijau (L. sativa), selada berduri (L.
serriola), dan selada India (L. indica)
2. Mengetahui keragaman Genom tanaman selada hijau (L. sativa), selada

2
 berduri (L. serriola), dan selada India (L. indica)
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah berupa
data marka molekuler spesifik beserta sekuennya yang membedakan antara tanaman
selada hijau (L. sativa), selada berduri (L. serriola), dan selada India (L. indica)
untuk mengidentifikasi keragaman genetik yang ada.

3
 II. TELAAH PUSTAKA

Tanaman selada merupakan salah satu tanaman hortikultural yang

memiliki potensi nilai ekonomi yang sangat baik dan mempunyai potensi tinggi
untuk dibudayakan sehingga layak untuk dikembangkan, meskipun di Indonesia
proses pengembangannya belum membudaya, namun dalam prospek ekonomi
terbilang cukup cerah (Prasetyo & Lazuardi, 2019). Di Indonesia, perkembangan
budidaya tanaman selada belum sepesat jenis sayuran lainnya dan hanya
beberapa wilayah menjadi sentra-pusat penghasil sayur saja yang banyak
membudidayakan tanaman selada (Prasetio, 2013). Pada Tahun 2013, nilai
ekspor selada hanya 1,414 Kg/Tahun, jauh lebih kecil dibandingkan dengan nilai
impor yang mencapai 78,348 Kg/Tahun, sehingga mendorong para petani
melakukan perbaikan budidaya tanaman selada untuk memenuhi kebutuhan
dalam negeri (Badan Pusat Statistik, 2014).
Tanaman selada termasuk dalam famili Asteraceae dan merupakan suku
yang paling banyak serta mudah untuk dikenali (Kristkova et al., 2008).
Tanaman selada diwakili oleh varietasnya yang dibudidayakan, yaitu selada hijau
(L. sativa) dan varietas liar yaitu, selada berduri (L. serriola) dan selada India (L.
indica) (Abdul-Jalil, 2020).
Selada hijau (L. sativa) merupakan tanaman semusim, banyak digunakan
sebagai sayuran segar dalam salad ataupun dimasak, karena memiliki banyak
manfaat terutama bagi kesehatan tubuh, kandungan serat dan vitaminnya dapat
memberikan suplai nutrisi yang baik bagi tubuh (Haryanto, 2007). Daun selada
mengandung vitamin dan dapat mencegah panas dalam, melancarkan
metabolisme, membantu menjaga kesehatan rambut, mencegah kulit menjadi
kering, dan dapat mengobati insomia (Haryanto, 2007; Hartanto, 2015).
Kandungan gizi yang terdapat pada selada adalah serat, provitamin A
(karotenoid), kalium, kalsium, kalori, protein, lemak karbohidrat, kalsium,
fosfor, zat besi, (Fe), vitamin A, vitamin B1, Vitamin C dan air (Cahyono, 2005;
Supriati & Herliana, 2014; Haryanto, 2007). Selada juga mengandung vitamin K,
kaya garam dan mineral dengan unsur-unsur alkali yang sangat mendominasi dan
baik bagi tubuh, sehingga dapat membantu darah tetap bersih, juga kaya akan
lutein, beta karoten, kalsium, dan folat (Hartanto, 2015).

4
 Selada berduri (L. serriola) adalah spesies selada liar yang dapat
ditemukan di kawasan Afrika, Turki timur, Armenia, Siberia, Pakistan, Iran,
India, dan Indonesia (Prasetio, 2013). Tanaman ini memiliki kegunaan sebagai
obat tradisional, seperti obat penenang, ekspektoran, pencahar, penekan batuk,
antiseptik, diuretik, antispasmodik, ekspektoran, pencahar, antiseptik, dan
vasorelaksan, bronkitis, asma, pertusis, gastrointestinal, dan berbagai penyakit
lainnya (Abdul-Jalil, 2020; El-Esawi et al., 2017). Selada berduri (L. serriola)
kaya akan lactucarium dan terdiri dari berbagai nutrisi mineral, beta-carotene, zat
besi, vitamin B, vitamin C, antioksidan alami, flavonoid, dan fenolat (Sammour,
2014; El-Esawi et al., 2017). Lactucarium digunakan dalam pengobatan
misalnya: anodyne, antispasmodik, pencernaan, diuretik, hipnotis, sifat narkotik
dan sedatif yang memiliki efek candu, tetapi tanpa kecenderungan dan tidak
menyebabkan gangguan pencernaan, serta tidak membuat ketagihan (Abdul-Jalil,
2020).
Selada India (L. indica) atau yang dikenal dengan nama “sawi belanda” di
pulau Jawa dan “sijukkot” di daerah Sumatera Utara, termasuk spesies tanaman
selada liar yang banyak dimanfaatkan sebagai obat-obatan tradisional dan dapat
ditemukan pada kawasan Asia seperti Indonesia, Korea, Jepang, Cina, dan India
(Panjaitan & Silalahi, 2020). Tanaman ini memiliki kegunaan sebagai penambah
nafsu makan, penambah stamina, memperlancar pencernaan, mengobati penyakit
gondok, mengobati sakit lambung, menurunkan kolestrol, kadar gula darah,
risiko kanker, antidiabetes, dan antibakteri (Hepni, 2019; Panjaitan & Silalahi,
2020). Tanaman ini mengandung vitamin A & C, mineral, flavonoid, saponin,
tannin, glikosida, dan triterpeoid/steroid (Harikrishnan et al., 2011; Hepni,
2019).
Untuk mendeteksi keanekaragaman spesies atau antarspesies dengan resolusi
lebih tinggi, dapat menggunakan marka molekuler. Teknologi marka molekuler
digunakan untuk analisis keanekaragaman genetik secara efektif dan efisien
(Tambunan et al., 2019). Marka molekuler digunakan untuk karakterisasi suatu
spesies dan memberikan hasil yang akurat, karena tidak dipengaruhi oleh aspek
lingkungan (Nugroho et al., 2017).
RAPD adalah teknik penanda molekuler berbasis PCR yang menggunakan
primer oligonukleotida tunggal dengan susunan sekuen basa acak untuk
5
mengamplifikasi segmen-segmen DNA genom secara acak yang digunakan dalam
pengujian polimorfisme DNA (Murtiyaningsih, 2017). Kriteria hasil amplifikasi
yang ideal adalah tingginya jumlah lokus poliformik (91%), bacaan pita di agar
elektroforesis antara 200 bp sampai 800 bp, serta tingkat keberulangan yang tinggi
(Frianto et al., 2018). Kelebihan teknik RAPD yaitu, merupakan primer acak yang
tidak memerlukan informasi target sekuens DNA, seperti yang dilakukan pada
analisis RFLP (Kusmini et al., 2011; Yulita, 2013). Teknik ini pengerjaannya lebih
mudah dengan biaya yang lebih sedikit, tetapi mendapatkan hasil yang cepat dengan
menghasilkan polimorfisme pita DNA dalam jumlah banyak, dan dapat digunakan
untuk menganalisis diferensiasi serta dinamika genetik, struktur populasi, hingga
keanekaragaman dalam populasi (Frianto et al., 2018). Meskipun demikian, teknik
RAPD memiliki kelemahan karena mempunyai reproduktifitas yang rendah, namun
kelemahan ini dapat diatasi dengan konsistensi kondisi PCR (Wijaya et al., 2009).
Setelah hasil data diperoleh dengan penanda molekuler, dapat dianalisis
menggunakan UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Aritmetic) untuk
mendapatkan dendogram atau pohon filogenetik. Menurut Hua et al. (2017),
Dendogram mampu menunjukkan hubungan evolusioner berbagai organisme
berdasarkan kesamaan residu fisik atau genetiknya. UPGMA membuat pohon
filogenetik dari matriks kesamaan berpasangan atau matriks jarak yang
menggambarkan kesamaan semua kemungkinan pasangan unit taksonomi yang
diberikan.

6
 III. METODE PENELITIAN

A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian

1. Materi Penelitian
a. Bahan
Bahan tanaman yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah dua
rangkap masing-masing spesies selada hijau (L. sativa), selada berduri (L.
serriola), dan selada India (L. indica).

Untuk perlakuan RAPD akan menggunakan primer OPA-2, OPA-9, OPAE-

03, OPAE-15, OPAN-01, OPX-17, OPX-18, dan UBC-210. Sedangkan pada
tahap isolasi menggunakan GeneAid™ Plant DNA isolation mini kit yang terdiri
dari GP1 buffer, GP2 buffer, GP3 buffer, W1 buffer, wash buffer, etanol absolut,
isopropanol, elution buffer, GD column dan filter column.

Pada tahap PCR, bahan yang akan digunakan adalah PCR mix yang terdiri
dari MyTaq PCR master mix, primer dan nuclease-free water. Setelah perlakuan
tersebut, tahap visualisasi akan dilaksanakan menggunakan bahan TAE buffer
1x, loading dye, agarosa dan GeneAid™ 1 kb DNA ladder.
b. Alat
Alat-alat yang akan digunakan adalah mortar dan pestle, penangas air,
tabung mikro 1,5 mL, mikropipet dan tip, sentrifus mikro, autoklaf, timbangan
analitik, mesin thermal cycler, vortex, pH meter, lemari es ultra-low -80˚C,
lemari pendingin, Freezer -20˚C, UV Transiluminator, peralatan elektroforesis,
parafilm dan kamera.

2. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Genetika & Molekuler
Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto Utara. Penelitian
ini akan berlangsung dari Februari 2022 hingga April 2022.

B. Rancangan Penelitian
1. Rancangan Percobaan
Metode penelitian yang akan digunakan adalah pengambilan sampel
secara acak atau random menggunakan teknik purposive random sampling.
Purposive random sampling merupakan teknik pengambilan sampel yang
7
 disesuaikan dengan kriteria ataupun jumlah tertentu. Selanjutnya
mengindentifikasi morfologi tanaman sampel secara visual menggunakan kunci
identifikasi dari Kew.org, disertai konfirmasi dari herbarium (PUNS) Fakultas
Biologi, Unsoed.

2. Parameter Penelitian
Analisis data pita DNA akan menggunakan software MEGA 7 dengan
parameter UPGMA dan Maximum Parsimony, untuk melihat kekerabatan
Lactuca spp.

3. Cara Kerja Penelitian

a. Isolasi DNA Genom
DNA Genom akan diisolasi menggunakan GeneAid™ plant DNA isolation
mini kit. Dimana spesifikasi prosedur sebagai berikut :
1. Tiga individu L. sativa, L. serriola, dan L. indica akan digunakan sebagai sampel
2. Sampel daun akan diambil dari masing-masing individu menggunakan gunting.
3. Daun akan dicuci menggunakan alkohol 70%
4. Sampel daun akan dihaluskan menggunakan mortar dan alu, sambil ditambah
secara perlahan 400 µL GPX1 buffer
5. Sampel akan dipindahkan kedalam 1,5 mL microtube dan ditambahkan 5 µL
RNAse
6. Setelah itu sampel akan dihomogenasi menggunakan vortex secara singkat
7. Sampel akan diinkubasi ke dalam waterbath selama 15 menit dengan suhu 60OC
(tube akan diagitasi dan dihomogenasi setiap 5 menit)
8. Pada tahap ini elution buffer akan mulai diinkubasi ke dalam waterbath pada
suhu 60OC
9. Sekitar 100 µL GP2 buffer akan ditambahkan ke dalam sampel tube,
dihomogenasi menggunakan vortex, lalu diinkubasi diatas es selama 3 menit
10. Filter column akan dipasangkan dengan 2mL collection tube
11. Lalu sampel akan ditransfer ke dalam filter column
12. Filter dan collection tube akan disentrifugasi pada kecepatan 1000 x g selama 8
menit, dan filter column akan dibuang
13. Supernatan pada collection tube akan dipindahkan pada tube 1,5mL baru
14. GP3 buffer (yang telah ditambah isopropanol dengan perbandingan 1:3) akan
ditambahkan sebanyak 1,5 kali volume supernatan
8
15. GD column akan dipasangkan dengan 2mL collection tube baru
16. Kemudian, sampel akan dipindahkan ke dalam GD column
17. Lalu, sampel akan disentrifugasi pada kecepatan 15000 x g selama 2 menit,
supernatan akan dibuang
18. Sekitar 400 µL W1 buffer akan diteteskan secara perlahan ke dalam GD column
dan disentrifugasi selama 30 detik dengan kecapatan 15000 x g, lalu supernatan
dibuang kembali
19. Sebanyak 600 µL wash buffer (yang telah ditambahkan absolut etanol dengan
perbandingan 1:2) akan ditambahkan ke dalam GD column dan disentrifugasi
pada kecepatan 15000 x g selama 30 detik dan supernatan dibuang kembali
20. GD column akan dikeringkan dengan sentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan
15000 x g
21. GD column yang telah dikeringkan akan dipasangkan dengan collection tube
baru
22. 100 µL elution buffer yang sebelumnya telah dipanaskan akan diteteskan secara
perlahan pada lingkaran mesh GD column, dan dibiarkan selama 5 menit
23. Sampel akan disentrifugasi lagi pada kecepatan 15000 x g selama 30 detik untuk
mengikat DNA yang telah dimurnikan
b. Pengukuran Kualitatif dan Kuantitatif DNA
Sampel DNA yang telah diisolasi akan di-running menggunakan
elektroforesis gel. Lalu divisualisasi dibawah cahaya UV Transiluminator untuk
pengukuran kualitatif. Konsentrasi DNA akan diukur menggunakan
spektrofotometer pada λ 260 nm, dimana penghitungan rasio kemurnian pada
serapan λ 260 - λ 280 nm. DNA yang telah murni, akan diencerkan sesuai dengan
kebutuhan yang akan digunakan sebagai templet DNA pada amplifikasi RAPD.
c. Marka RAPD
PCR primer yang akan digunakan adalah sebagai berikut : OPA-2, OPA-9,
OPAE-03, OPAE-15, OPAN-01, OPX-17, OPX-18, dan UBC-210. (Table 3.1).
Table 3.1. Marka RAPD
Primer Sekuen 5’-3’ Daftar pustaka
OPA-2 TGCCGAGCTG Prakash, et al., 2011
OPA-9 GGGTAACGCC Aydin et al., 2012
OPAE-03 CATAGAGCGG Aladele et al., 2008
OPAE-15 CCTGTCAGTG Aladele et al., 2008
OPAN-01 ACTCCAGGTC Aladele et al., 2008
OPX-17 GACACGGACC Prakash, et al., 2011
9
 OPX-18 GACTAGGTGG Merza et al., 2017
UBC-210 TGCCGAGCTG Merza et al., 2017

Total reaksi PCR akan berada pada volume total 12,5 µL, yang terdiri dari
6,25 µL GreenTag PCR mix, 25 ng DNA template, 1 µL primer 10 μM, dan 5 mL
nuclease-freewater. Amplifikasi DNA akan dilakukan menggunakan Thermocycler
peqlab primus 250. Amplifikasi akan dimulai dengan pre-denaturasi pada suhu 95° C
selama 3 menit, diikuti dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi 95° C selama 15
detik, annealing pada suhu 31oC selama 15 detik, elongasi pada suhu 72oC selama 10
detik lalu, akan diselesaikan satu siklus elongasi-akhir untuk menyelesaikan
pemanjangan pita pada suhu 72oC selama 5 menit.
d. Electroforesis
PCR produk dan pengukuran kualitatif Genom akan divisualisasi
menggunakan gel agarosa dan UV Transiluminator. Gel agarosa akan digunakan
pada konsentrasi 1,5% untuk produk PCR dan 1% untuk pengukuran kualitatif
Genom. Pembuatan gel agarosa sebagai berikut :
1. 0,45 g (1,5%), 0,6 g (1%) agarosa akan dicampurkan dengan TAE 1x sampai
volume mencapai 30 mL
2. Lalu, larutan akan dihomogenasi dan dipanaskan didalam oven sampai
terhomogenasi dengan sempurna tanpa terjadi pendidihan (± 1 menit)
3. Larutan agarosa akan diletakan pada suhu ruangan hingga suhu berada pada ±
60OC, kemudian ditambahkan 1 µL EtBr
4. Kemudian larutan akan dihomogenasi dan dituang ke dalam cetakan gel yang
sudah dipasangkan dengan sisir untuk membentuk sumuran
5. Lalu, gel akan dibiarkan mengeras selama 15 menit. Setelah itu sisir dilepaskan
dan membentuk sumuran peletakan DNA yang akan dielektroforesis
6. Gel yang telah mengeras bersama cetakannya akan diletakan ke dalam tangki
elektroforesis yang telah diisi buffer TAE 1x sampai gel terbenam
7. Sampel DNA/Produk PCR sebanyak 5 µL akan dimasukkan ke dalam sumur,
menggunakan mikropipet
8. Salah satu sumur, akan digunakan untuk menampung DNA ladder sebagai
penanda ukuran
9. Tanki elektroforesis akan disambungkan pada power supply dengan voltase 80
V, dan daya sebanyak 250 mA selama 30 menit

10
 10. Visualisasi akan dilaksanakan menggunakan UV Transiluminator setelah gel
dipisahkan dari cetakkannya
11. Gambar visualisasi akan difoto dan dianalisasi menggunakan MEGA 7 dengan
prosedur UPGMA dan Maximum parsimony

4. Analisis Data

Pola pita DNA yang muncul dimasing-masing sampel, akan digunakan sebagai
penentu polimorfisme. Jika kemunculan allel yang sama lebih dari 95%. Produk PCR
akan dinilai berdasarkan secara terpisah antara muncul/tidak muncul pada berat fragmen
tertentu menggunakan kode biner (0/1). Nilai 1 akan digunakan ketika pita DNA muncul
dan 0 ketika pita DNA tidak muncul pada fragmen DNA tertentu (terlepas dari intensitas
DNA).
Data biner yang didapat akan digunakan untuk menentukan diversitas genetik
diantara spesies L. sativa, L. serriola, dan L. indica. Data tersebut akan pula digunakan
untuk analisis dengan metode UPGMA dan Maximum Parsimony dengan software
MEGA 7. Selanjutnya, pengelompokan akan terlihat pada fenogram dan cladogram yang
dihasilkan untuk mengukur kemiripan atau tidak kemiripan ketiga spesies tersebut.

C. Bagan Alir Penelitian

Survey di Purwokerto

Sampel Tanaman

Morfologi Karakter Isolasi DNA Genom

DNA Genom

Pengecekan Kualitatif dan Kuantitatif

Herbarium

Amplifikasi Fragmen DNA

Produk PCR

11
 PUNS
Visualisasi Menggunakan Elektroforesis

Profil RAPD

Sebagai Referensi di Masa Depan Analisis Data

12
 JADWAL PENELITIAN

Tabel 3.2. Jadwal Penelitian

Bulan ke-
No. Kegiatan 1 2 3 4 5
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
1. Pesiapan
- Seminar
proposal
- Pengurusan
ijin
- Persiapan alat
dan bahan
2. Penyemaian dan
pemeliharaan
3. Analisis sampel di
laboratorium
4. Analisis data
5. Penelaahan Pustaka
6. Penyusunan draft
skripsi
7. Seminar hasil
penelitian
8. Revisi skripsi
9. Pengesahan skripsi

13
 DAFTAR PUSTAKA

Aladele, S. E., Ariyo, O. J. & de Lapena, R., 2008. Genetic Relationships

among West African okra (Abelmoschus caillei) and Asian Genotypes
(Abelmoschus esculentus) using RAPD. African Journal of
Biotechnology, 7(10), pp. 1426-1431.
Abdul-Jalil, T.Z., 2020. Lactuca serriola: Short Review of its Phytochemical
and Pharmacological Profiles.
Anggraheni, Y.G.D. & Mulyaningsih, E.S., 2018. Evaluasi Keragaman
Genetik Sembilan Varietas Rambutan (Nephelium lappaceum) dengan
Marka RAPD. Biopropal Industri, 9(1), pp.1-8.
Aydin, S. S., Basaran, E., Cansaran-Duman, D. & Aras, S., 2012. Genotoxic
Effect of Cadmium in Okra Seedlings: Comperative Investigation with
Population Parameters and Molecular Markers. Journal of
Environmental Biology, 34, pp. 985-990.
Badan Pusat Statistik. 2014. Produksi Pangan Dan Palawijaya (Angka
Sementara Tahun 2014). Berita Resmi Statistik No. 19/04/13/Thn.
XIX, 11 April 2014
Cahyono. 2005. Budidaya Tanaman Sayuran. Jakarta: Perkabar Swadjaya.
El-Esawi, M.A., Elkelish, A., Elansary, H.O., Ali, H.M., Elshikh, M.,
Witczak, J. & Ahmad, M., 2017. Genetic transformation and hairy
root induction enhance the antioxidant potential of Lactuca serriola
L. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2017.
Frianto, D., Rasyad, A. & Roslim, D.I., 2018. Keanekaragaman Genetik
Scorodocarpus borneensis di Riau Berdasarkan Penanda Molekuler
RAPD. Jurnal Penelitian Kehutanan Sumatrana, 1(2), pp.27-38.
Harikrishnan, R., Kim, J.S., Kim, M.C., Balasundaram, C.& Heo, M.S., 2011.
Lactuca indica extract as feed additive enhances immunological
parameters and disease resistance in Epinephelus bruneus to
Streptococcus iniae. Aquaculture, 318(1-2), pp.43-47.
Hartanto, Windy. 2015. Rainbow After Cancer . Jakarta : PT Kawan Pustaka.
Haryanto, Eko. 2007. Sawi Dan Selada. Jakarta: Perkabar Swadaya.
Hepni, H., 2019. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dalam Daun
Kumak (Lactuca indica L.). Jurnal Dunia Farmasi, 4(1), pp.17-22.
Hua, G.J., Hung, C.L., Lin, C.Y., Wu, F.C., Chan, Y.W.& Tang, C.Y., 2017.
MGUPGMA: a fast UPGMA algorithm with multiple graphics
processing units using NCCL. Evolutionary Bioinformatics, 13,
p.1176934317734220.
14
Křístková, E., Doležalová, I., Lebeda, A., Vinter, V. & Novotná, A., 2008.
Description of morphological characters of lettuce (Lactuca sativa L.)
genetic resources. Horticultural Science, 35(3), pp.113-129.
Kusmini, I.I., Gustiano, R. & Mulyasari, 2011. Karakterisasi Genetik Ikan
Kelabau (Osteochilus kelabau) dari Berbagai Lokasi di Kalimantan
Barat Menggunakan Metode RAPD (Random Amplified
Polymorphism DNA). Berita Biologi, 10(4), pp.449-54.
Merza, T. M. & Jaafer, H. S., 2017. Estimation of Genetic Distances
Among Some Local Okra Cultivars Using RandomLy Amplified
Polymorphic DNA (RAPD) Markers. Kufa Journal for
Agricultural Sciences, 9(4), pp. 31-46.
Mieslerova, B., Lebeda, A., Petrželová, I.R.E.N.A. & Korbelova, P., 2013.
Incidence of lettuce downy mildew (Bremia lactucae) and powdery
mildew (Golovinomyces cichoracearum) in natural populations of
prickly lettuce (Lactuca serriola). Plant Protection
Science, 49(Special Issue), pp.S24-S32.
Murtiyaningsih, H., 2017. Isolasi DNA Genom dan Identifikasi
Kekerabatan Genetik Nanas Menggunakan RAPD (Random
Amplified Polimorfic DNA). Agritrop, 15(1), pp.84-93.
Nugroho, K., Slamet & Lestari, P., 2017. Keragaman Genetik 24 Varietas
Padi Sawah dan Padi Gogo (Ory (Anon., n.d.)za sativa L.) Indonesia
Berdasarkan Marka SSR. Scripta Biologica, 4(1), pp.5-10.
Panjaitan, J.C. & Silalahi, A., 2020. Phytochemical Screening Of Sijukkot
Ekstract (Lactuca indica L.). Indonesian Journal of Chemical Science
and Technology (IJCST), 3(2), pp.53-56.
Prakash, K., Pitchaimuthu, M. & Ravishankar, K. V., 2011. Assessment of
Genetic Relatedness Among Okra Genotypes [Abelmoschus
esculentus (L.) Moench] Using Rapd Markers. Electronic Journal of
Plant Breeding, 2(1), pp. 80-86.
Prasetio, Bambang., 2013. Budidaya Sayuran Organik di Pot. Yogyakarta:
Lily Publisher.
Prasetyo, J. & Lazuardi, I.B., 2019. Pemaparan Teknologi Sonic Bloom
Dengan Pemanfaatan Jenis MusikTerhadap Pertumbuhan Vegetatif
Tanaman Selada Krop (Lactuca sativa L). Jurnal Keteknikan
Pertanian Tropis dan Biosistem, 5(2), pp.178-188.
Saparinto, C. & Setyaningrum, H.D., 2011. Panen Sayur secara rutin di lahan
sempit. Penebar Swadaya. Jakarta.
Sammour, R.H., 2014. Biochemical evaluation of Lactuca L.
germplasm. Research & Reviews in Bio Sciences Review, pp.78-84.

15
Supriati, Y. & Herliana, E., 2014. 15 Sayuran Organik Dalam Pot. Penebar
Swadaya Grup.
Tambunan, R.R., Sari, S., Saragih, Y., Carsono, N. & Wicaksana, N., 2019.
Studi Kekerabatan Padi Hasil Piramidisasi Berbasis Marka Molekuler
dan Fenotipik. Jurnal Agrikultura, 30(3), pp.100-08.
Wijaya, A., Lakitan, B. & Surahman, M., 2009. Identifikasi Beberapa Aksesi
Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) Melalui Analisis RAPD dan
Morfologi. Jurnal Agronomi Indonesia (Indonesian Journal of
Agronomy), 37(2).
Yulita, K.S., 2013. Identifikasi Molekuler Pohon Induk Beberapa Varietas
Durian Asal Jepara Menggunakan Random Amplified
Polymorphic DNA. J. Hort, 23(2), pp.99-106.

16
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Spesifikasi Peralatan

No Nama Alat Merek/Tipe Fungsi Tempat

Menghomogenasi Lab. Genetika dan
1. Parafilm Bemis sampel DNA dan Molekuler Biologi
loading dye Unsoed
2. Mortar dan Pestle - Menghaluskan Lab. Genetika dan
sampel Molekuler Biologi
Unsoed
3. Waterbath Grant Y6 Inkubasi bahan Lab. Genetika
dalam suhu dan Molekuler
tertentu Biologi Unsoed
4. Mikropipet dan tip Omnipette Clever Mengambil larutan Lab. Genetika dan
Saintific dalam volume kecil Molekuler Biologi
Unsoed
5. Mesin PCR (thermal Pqlab primus 25 Amplifikasi DNA Lab. Genetika dan
cycler) Molekuler Biologi
Unsoed
6. Lemari pendingin Sharp Menyimpan larutan Lab. Genetika dan
dan DNA sampel Molekuler Biologi
Unsoed
7. Freezer Modena Menyimpan larutan Lab. Genetika dan
(-20°C dan dan DNA sampel Molekuler Biologi
-80°C) Unsoed
8. Timbangan digital Ohaus Menimbang bahan Lab. Lingkungan
Biologi Unsoed
9. Mesin sentrifugasi Hitachi Sentrifugasi bahan Lab. Genetika dan
Molekuler Biologi
Unsoed
10. Nanodrop Thermo Scientific Mengukur kuantitas Lab. Riset Unsoed
Spektrofotometer DNA
11. Microwave Modena Melarutkan bubuk Lab. Genetika dan
agarosa Molekuler Biologi
Unsoed
12. Power supply EPS 500/400 Sumber aliran Lab. Genetika dan
Pharmacia Fine listrik untuk Molekuler Biologi
Chemicals elektroforesis Unsoed
13. Baki gel agarosa - Mencetak gel Lab. Genetika dan
agarosa Molekuler Biologi
Unsoed
14. Sisiran - Membuat lubang Lab. Genetika dan
pada gel agarosa Molekuler Biologi
Unsoed
15. Tangki elektroforesis Cleaver Tempat Lab. Genetika dan
berlangsungnya Molekuler Biologi
elektroforesis Unsoed
Lab. Genetika dan
Whatman
16. UV Transiluminator Visualisasi DNA Molekuler Biologi
Bioemetra
Unsoed
17. Spatula Oxone Mengambil gel Lab. Genetika

17
 dan Molekuler
agarosa
Biologi Unsoed
Untuk Lab. Genetika
18. 1,5 mL Microtube OneMed menempatkan dan Molekuler
sampel Biologi Unsoed
Untuk Lab. Genetika
19. Vortex IKA MS 3 Digital menghomogenasi dan Molekuler
larutan Biologi Unsoed
Lab. Genetika
Tempat meraksikan
20. Gelas beker Pyrex, Iwaki dan Molekuler
bahan
Biologi Unsoed

Lampiran 2. Spesifikasi Bahan

No Nama Bahan Spesifikasi Fungsi

1. Alkohol 70% - Untuk mensterilisasi
2. Air bebas nuklease - Media pelarut
3. GeneAid™ Plant - Untuk mengekstrak DNA dari daun
DNA isolation mini tanaman
kit
4. RNAse - Untuk mendegradasi RNA
5. RAPD Markers Sebagai Marka RAPD
6. TAE Buffer 1x - Untuk membuat media agarosa untuk di
visualisasi
7. Agarosa - Sebagai media bahan
8. Loading dye - Untuk mewarnai sampel DNA
9. GeneAid™ 100bp - Sebagai DNA ladder
DNA Ladder

18