Naskah Skripsi - Dyan Oktaviani - 09909 - Periode Januari

PROFIL METABOLIT SEKUNDER KALUS
HASIL PERBANYAKAN TANAMAN CABAI PUYANG

(Piper retrofractum Vahl.) SECARA IN VITRO
Skripsi
Disusun oleh:
Dyan Oktaviani
17/414099/BI/09909
FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2022
Skripsi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan
Guna memperoleh derajad Sarjana Sains
Program Studi Biologi
Disusun oleh:
Dyan Oktaviani
17/414099/BI/09909
Dosen Pembimbing
Aries Bagus Sasongko, S.Si., M.Biotech.
FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2022
ii
HALAMAN PENGESAHAN
SKRIPSI

Disusun Oleh:
Dyan Oktaviani
17/414099/BI/09909
Telah diujikan di depan Tim Penguji pada tanggal 29 Desember 2021

dan dinyatakan telah memenuhi syarat
Yogyakarta, 11 Januari 2022

Universitas Gadjah Mada
Fakultas Biologi
Tim Penguji, Dekan,

Penguji I/Dosen Pembimbing Skripsi,
Aries Bagus Sasongko, S.Si., M. Biotech. Prof. Dr. Budi Setiadi Daryono,M.Agr.Sc.
NIP. 198303112015041001 NIP. 197003261995121001
Penguji II
Lisna Hidayati, S.Si., M. Biotech.

NIP. 198603212015042001
Penguji III
Prof. Dr. L. Hartanto Nugroho, M.Agr.

NIP. 196504301990101001
iii
PERNYATAN BEBAS PLAGIASI
iv
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan karunia-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan naskah skripsi berjudul “PROFIL
METABOLIT SEKUNDER KALUS HASIL PERBANYAKAN TANAMAN
CABAI PUYANG (Piper retrofractum Vahl. ) SECARA IN VITRO” dengan
baik. Naskah skripsi ini disusun untuk memenuhi persyaratan memperoleh derajat
Sarjana Sains Program Studi Biologi Universitas Gadjah Mada. Proses penelitian
skripsi ini tidak lepas dari bantuan, bimbingan, dan dukungan dari berbagai pihak.
Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Budi Setiadi Daryono, S.Si., M.Agr.Sc., Ph.D., selaku Dekan
Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada,
2. Plt. Wakil Dekan bidang Akademik., selaku Wakil Dekan Bidang
Akademik dan Kemahasiswaan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada,
3. Aries Bagus Sasongko, S.Si., M.Biotech., selaku Dosen Pembimbing
Skripsi,
4. Prof. Dr. L. Hartanto Nugroho, M.Agr. serta Lisna Hidayati, S.Si.,
M.Biotech., selaku Dosen Penguji Skripsi.
5. Prof. Dr. Suwarno Hadisusanto, S.U., selaku Dosen Pembimbing Akademik,
6. Dra. Siti Susanti, S.U. dan Dwi Umi Siswanti, S.Si., M.Sc., selaku Dosen
Pengelola Skripsi,
7. Prof. Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc., selaku Kepala Laboratorium
Bioteknologi yang telah mengizinkan saya menggunakan ruangan dan
fasilitas laboratorium untuk penelitian ini,
8. Kedua orang tua dan anggota keluarga yang selalu memberikan dukungan,
motivasi dan doa,
9. Eka Mega Sampurna, A.Md., selaku laboran Laboratorium Bioteknologi
Fakultas Biologi UGM,
10. Para Peneliti Laboratorium Bioteknologi Fakultas Biologi UGM,
11. Fadhilla Dwi Prameswary Rayes, Enik Sulistyana, Fatona Nur, Anindita
Della Rosyiadi, Dyah Prakasita Monisa Hapsari, Asyroful Muna beserta
v
teman-teman seperjuangan lainnya yang telah memberikan bantuan, saran
dan motivasi terhadap kegiatan penelitian yang dilakukan.
Akhir kata, penulis menyadari bahwa penyusunan naskah skripsi ini
masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan
saran, kritik dan masukan yang membangun demi perbaikan penulisan
selanjutnya.
Yogyakarta, 20 Desember 2021
penulis
vi
DAFTAR ISI
SAMPUL ........................................................................................................... i
HALAMAN JUDUL ......................................................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... iii
SKRIPSI .......................................................................................................... iii
PERNYATAN BEBAS PLAGIASI .................................................................. iv
PRAKATA ....................................................................................................... v
DAFTAR ISI................................................................................................... vii
DAFTAR SINGKATAN DAN SIMBOL .......................................................... ix
DAFTAR TABEL ............................................................................................. x
DAFTAR GAMBAR........................................................................................ xi
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................... xiii
INTISARI ...................................................................................................... xiv
ABSTRACT.................................................................................................... xv
BAB I PENDAHULUAN.................................................................................. 1
A. Latar Belakang................................................................................... 1
B. Permasalahan ..................................................................................... 3
C. Tujuan ............................................................................................... 4
D. Manfaat Penelitian ............................................................................. 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................ 5
A. Tinjauan Pustaka.................................................................................. 5
1. Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.)......................................... 5
2. Manfaat Cabe Puyang..................................................................... 7
3. Budidaya Cabe Puyang.................................................................. 8
4. Kultur In Vitro Kalus Tanaman Cabe Puyang............................... 9
5. Media Kultur............................................................................. 10
6. Kurva Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang ..................... 11
7. Komponen Metabolit Sekunder Tanaman Cabe Puyang.............. 13
8. Thin Layer Chromatopgraphy (Kromatografi Lapis Tipis)......... 16
B. Hipotesis ......................................................................................... 17
BAB III METODE PENELITIAN ................................................................... 18
A. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................... 18
B. Bahan .............................................................................................. 18
vii
1. Bahan Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl. ) yang
digunakan ........................................................................................ 18
2. Bahan untuk Kultur In vitro ....................................................... 18
3. Bahan untuk Uji Metabolit Sekunder Tanaman Cabe Puyang...... 18
C. Alat ................................................................................................. 19
1. Alat untuk pelaksanaan pada kultur in vitro ................................ 19
2. Alat untuk pengukuran kurva pertumbuhan kalus dan pengamatan
pertumbuhan kalus .................................................................... 19
3. Alat untuk analisis metabolit sekunder pada pertumbuhan kalus.. 20
D. Cara Kerja ....................................................................................... 20
1. Determinasi Tanaman Cabe Puyang........................................... 20
2. Pembuatan Media Murashige and Skoog (MS) ........................... 20
3. Induksi Kalus Daun Tanaman Cabe Puyang (P. retrofractum Vahl.)
................................................................................................. 21
4. Preparasi Ekstrak Kalus dan Daun Ex Vitro Tanaman Cabe Puyang
(Piper retrofractum Vahl.)......................................................... 23
5. Analisis Profil Metabolit Sekunder pada Kalus dan Daun Ex Vitro
Tanaman Cabe Puyang dengan Kromatografi Lapis Tipis ........... 24
6. Analisis Data............................................................................. 27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................... 28
1. Variasi Media yang Paling Berpengaruh Terhadap Pertumbuhan Kalus
Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.)............................ 28
2. Pengaruh variasi media dan ZPT terhadap kurva pertumbuhan kalus
tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.) secara in vitro pada
generasi pertama (G0)...................................................................... 39
3. Profil metabolit sekunder pada fase pertumbahan eksponensial generasi
pertama (G0) kalus tanaman cabe puyang medium optimal
dibandingkan dengan daun ex vitro tanaman cabe puyang.................. 45
a. Uji Alkaloid .............................................................................. 47
b. Uji Flavonoid ............................................................................ 52
c. Uji Terpenoid............................................................................ 57
BAB V PENUTUP .......................................................................................... 64
A. Kesimpulan...................................................................................... 64
B. Saran ............................................................................................... 64
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 66
LAMPIRAN.................................................................................................... 70
viii
DAFTAR SINGKATAN DAN SIMBOL
A. Singkatan
Singkatan Nama Pemakaian
pertama kali
pada halaman
2.4-D 2,4-diphenylphenoxyacetic acid 3
BA 6-Benzyladenine 3
BAP 6-Benzilaminopurin 2
ANOVA Analysis of Variance 27
DMRT Duncan Multiple Range Test 27
HCL Hydrochloric Acid 19
IAA Indol Acetic Acid 11
KOH Kalium Hydroxide 15
KLT Kromatografi Lapis Tipis 17
LAF Laminar Air Flow 20
Mdpl Meter Diatas Permukaan Laut 1
MS Murashige and Skoog 12
Mw Molecular Weight 16
NAA Naphtalene Acetic Acid 3
NaClO Natrium Hipoklorit 19
Rf Retardation Factor 50
UV Ultraviolet 21
WHO World Health Organization 1
WIK Waktu Induksi Kalus 23
ZPT Zat Pengatur Tumbuh 2
B. Simbol
Simbol Nama Pemakaian
pertama kali
pada halaman
 Panjang Gelombang (Lambda) 26
atm atmosphere 22
pH Power of Hydrogen 19
ix
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Kandungan Metabolit Sekunder pada Piper 15
retrofractum Vahl.
2. Rancangan Zat Pengatur Tumbuh yang 21
Digunakan.
3. Waktu Induksi Kalus (WIK), Persentase serta 28
Morf ologi Pertumbuhan Kalus Tanaman
Cabe Puyang secara In Vitro dengan berbagai
variasi penambahan ZPT
4. Morf ologi Kalus In vitro Daun Tanaman 35
Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.)
5. Bobot Segar Kalus Tanaman Cabe Puyang 39
(Piper retrofractrum Vahl.) pada Hari ke-0
sampai minggu ke -5
6. Rerata Berat Kering Kalus Tanaman Cabe 39
Puyang (Piper retrofractum Vahl.) Minggu
Ke-5 dengan Berbagai Variasi Media
7. Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Piperine dan 43
Golongan Alkaloid lainnya dengan Sampel
Ekstrak kalus dan daun ex vitro tanaman cabe
puyang (Piper retrofractum Vahl.)
menggunakan eluen toluena : etil asetat (1 :
1)
8. Hasil Perhitungan Nilai Rf Uji Metabolit 49
Sekunder Golongan Flavonoid dengan
Sampel Ekstrak Kalus dan Daun Ex Vitro
Tanaman Cabe Puyang ( Piper retrofractum
Vahl.) menggunakan eluen n -hexane : etil
asetat : Asam f ormiat (6 : 4 : 0,1)
9. Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Golongan 58
Terpenoid dengan Sampel Ekstrak kalus dan
daun ex vitro tanaman cabe puyang (Piper
retrof ractum Vahl.) menggunakan eluen
Toluena : etil asetat (9,3:0,7) dengan larutan
standar Linalool.
10. Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Golongan 61
Terpenoid dengan Sampel Ekstrak kalus dan
daun ex vitro tanaman cabe puyang (Piper
retrof ractum Vahl.) menggunakan eluen
Toluena : etil asetat (9,3:0,7) dengan larutan
standar Ca juput.
x
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Habitus Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum 3
Vahl.) (Dokumentasi Pribadi).
2. Kurva Pertumbuhan Kalus (Dwimahyani 2007) 9
3. Struktur Kimia Piperine (Patil, Das, and 9
Balasubramanian, 2016)
4. Struktur Kimia Metabolit Sekunder Indole Alkaloid 10
Cabe Jawa (Cahyono et al., 2019)
5. Perubahan Warna dan Tekstur Kalus 27
6. Kenampakan kalus yang mengalami browning saat 30
disubkultur pada medium N 12 yang sama dengan
medium induksinya
7. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang setelah 33
disubkultur pada variasi media yang optimal N 12
selama 30 hari
8. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang setelah 34
disubkultur pada variasi media yang optimal D 10
selama 30 hari
9. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang (Piper 37
retrofractum Vahl.) dengan Berat Segar Hari ke-0
hingga Minggu ke-5 menggunakan Berbagai
Variasi Perlakuan Media
10. Ekstrak Daun ex vitro dan Kalus Tanaman Cabe 41
Puyang (P. retrofractum Vahl.) dengan berbagai
pelarut
11. Uji Alkaloid ekstrak Ethanol Absolute kalus (A dan 43
B) Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum
Vahl.) dan larutan standar piperine (C) disertai
Gambar Diagram Bercak Noda.
xi
DAFTAR GAMBAR (LANJUTAN)
Gambar Halaman
12. Uji Alkaloid ekstrak kloroform daun ex vitro (A dan 44
B) Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum
Vahl.) serta larutan standar piperine (C) disertai
13. Uji Flavonoid Ekstrak Methanol Kalus (A) dan 48
Ethanol Absolute Kalus (B) serta Ekstrak Daun Ex
Vitro Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum
Vahl.) (C) dengan larutan standar Quersetine (D)
disertai Gambar Diagram Bercak Noda.
14. Uji Flavonoid Ekstrak Kloroform (A) dan Ethanol 49
Absolute (B) Daun Ex Vitro Tanaman Cabe Puyang
(Piper retrofractum Vahl.) dengan Larutan Standar
Quersetin (C) disertai Gambar Diagram Bercak
Noda.
15. Uji Terpenoid Ekstrak Kloroform (A) dan Ethanol 53
Absolute (B) Daun Ex Vitro serta Ekstrak Ethanol
Absolute Kalus (C) Tanaman Cabe Puyang (Piper
retrofractum Vahl.) dengan Larutan Standar
Linalool (D) disertai Gambar Diagram Bercak
Noda.
16. Uji Terpenoid Ekstrak Kloroform Daun Ex Vitro 55
(A) dengan Larutan Standar Cajuput (B) disertai
17. Uji Terpenoid Ekstrak Kloroform (A) dan Ethanol 56
Absolute (B) Daun Ex Vitro ekstrak ethanol
absolute kalus (C) Tanaman Cabe Puyang (Piper
retrofractum Vahl.) serta dengan Larutan Standar
Cajuput (D) disertai Gambar Diagram Bercak
Noda.
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Komposisi Medium Murashige and 71

Skoog’s (1962)
2. Hasil Induksi Kalus dengan 72
berbagai Zat Pengatur Tumbuh
selama 35 hari Kultur
3. Analisis Statistik Berat Segar 75
Kalus Hari Ke -0
Kalus Minggu Pertama
Kalus Minggu Kedua
Kalus Minggu Ketiga
Kalus Minggu Keempat
Kalus Minggu Kelima
9. Analisis Statistik Berat Kering 87
Kalus Minggu Kelima
10. Surat Keterangan Identifikasi 89
Tanaman Cabe Puyang
11. Hasil Uji Metabolit Sekunder 90
Alkaloid dan Flavonoi dengan
Eluen Lainnya
xiii
Disusun oleh:
Dyan Oktaviani
17/414099/BI/09909
INTISARI
Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.) merupakan golongan
Piperaceae yang mengandung khasiat sebagai obat dan dapat dikembangkan
dengan metode kultur jaringan. Selain itu, tanaman cabe puyang juga memiliki
kandungan metabolit sekunder golongan alkaloid, flavonoid dan terpenoid.
Permasalahan yang dihadapi, masih sedikit penelitian tentang metabolit sekunder
menggunakan kalus tanaman cabe puyang yang dikembangkan dengan kultur
jaringan. Sehingga, penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui profil
metabolit sekunder hasil perbanyakan kalus dengan variasi zat pengatur tumbuh
pada media basal Murashige and Skoog (MS) secara in vitro. Induksi kalus secara
in vitro dilakukan dengan eksplan daun tanaman cabe puyang. Eksplan daun
tersebut, diinokulasikan pada media basal MS dengan variasi ZPT NAA, 2,4 -D dan
BA. Media yang paling berpengaruh bagi perbanyakan kalus dan produksi
metabolit sekunder kalus adalah media MS + NAA:BA dengan konsentrasi 1 mg/L
dan 2 mg/L serta MS + 2,4-D: BA 1 mg/L dan 0,5 mg/L dengan jumlah berat segar
tertinggi dan waktu induksi kalus tercepat selama 26 hari. Kalus pada medium yang
paling berpengaruh tersebut dikeringkan pada oven bersuhu 33 ℃ sampai
menghasilkan berat kering yang konstan. Kalus kering, selanjutnya dilakukan
ekstraksi dengan metode maserasi kemudian ditimbang beratnya dan ditambahkan
pelarut dengan polaritas yang berbeda seperti kloroforom, methanol dan ethanol
absolute. Hasil ekstraksi kalus selanjutnya dilakukan uji metabolit sekunder
alkaloid, flavonoid dan terpenoid dengan metode kromatografi lapis tipis dan
menunjukkan hasil positif golongan senyawa alkaloid, flavonoid dan terpenoid.
Kata Kunci: Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl)., Kalus, Kromatografi Lapis
Tipis, Medium Murashige and Skoog, Metabolit Sekunder.
xiv
SECONDARY METABOLITE PROFILES ON IN VITRO
MICROPROPAGATED CALLUS OF THE JAVANESE LONG
PEPPER (Piper retrofractum Vahl.)
By:
Dyan Oktaviani
17/414099/BI/09909
ABSTRACT
The Javanese Long pepper (Piper retrofractum Vahl.) belongs to the Piperaceae
family which contains medicinal properties and can be developed using tissue
culture methods. In addition, the long pepper plant also contains secondary
metabolites of alkaloids, flavonoids, and terpenoids. The problem faced is that there
is still little research on secondary metabolites using callus from the long pepper
plant developed with tissue culture. Thus, this study was conducted to know the
profile of secondary metabolites resulting from callus propagation with a variety of
growth regulators on Murashige and Skoog (MS) basal media in vitro. Callus
induction in vitro was carried out with leaf explants of the long pepper plant. The
leaf explants were inoculated on MS basal media with variations of growth
hormone regulators NAA, 2,4-D, and BA. The most influential media for callus
propagation and production of callus secondary metabolites were MS + NAA:BA
with concentrations of 1 mg/L and 2 mg/L and MS + 2,4-D:BA 1 mg/L and 0.5
mg/L. L with the highest amount of fresh weight and the fastest callus induction
time was 26 days. The callus on the most influential medium was dried in an oven
at 33 ℃ to produce a constant dry weight. Dry callus, then extracted by maceration
method then weighed and added with solvents by different polarities such as
chloroform, methanol, and ethanol absolute. The results of callus extraction were
then tested for secondary metabolites of alkaloids, flavonoids, and terpenoids by
thin-layer chromatography method and showed positive results for the alkaloid,
flavonoid, and terpenoid compounds.
Keywords: Javanese Long Pepper (Piper retrofractum Vahl)., Callus, Murashige

and Skoog, Secondary metabolites, Thin-layer Chromatography.
xv
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Indonesia adalah negara dengan keanekaragaman jenis flora yang tinggi
serta dapat dimanfaatkan oleh manusia. Jumlah famili tumbuh-tumbuhan
yang ada diperkirakan sekitar 100-150 famili dan sebagian besar digunakan
sebagai tanaman obat-obatan (Melissa, 2017). Berdasarkan catatan World
Health Organization (WHO), lebih dari 20.000 spesies tanaman yang
digunakan sebagai tanaman obat. Penggunaan tanaman obat ini telah
digunakan oleh 65 % penduduk di negara maju dan 80 % penduduk di
negara berkembang (Jumiarni dan Komalasari, 2017).
Salah satu tanaman di Indonesia yang berpotensi dalam perkembangan
obat tradisional adalah Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.). Cabe
Puyang juga disebut Cabe Jawa. Tanaman ini dimasukkan dalam famili
sirih-sirihan (Piperaceae) dan biasanya ditanam di pekarangan, ladang, atau
dapat tumbuh secara liar di hutan dengan ketinggian kurang dari 600 mdpl
(Pratidina dkk., 2006). Selain itu, cabe puyang juga memiliki beberapa
khasiat diantaranya sebagai stimulan, menangani masalah pencernaan,
karminatif atau pengeluaran udara, mengatasi penyakit usus dan postpartum
(kehamilan) pada wanita. Ekstrak dari buahnya dapat berfungsi sebagai anti
mikroba, anti serangga, anti bakteri, anti diabetes, anti obesitas, dan aktivitas
sitotoksik (Muharini et al., 2015).
Beberapa khasiat tersebut kebanyakan diperoleh dari penggunaan
senyawa metabolit sekunder P.retrofractum Vahl. yang dihasilkan dari
isolasi bahan tanaman atau kalus hasil kultur jaringan. Kultur jaringan
adalah suatu metode pemeliharaan seluruh tanaman baik organ, jaringan
atau sel dalam kondisi aseptik yang terkendali di laboratorium. Sistem
kultur jaringan memasok semua nutrisi, energi, dan air yang diperlukan
pertumbuhan tanaman atau eksplan pada media basal. Penanaman dengan
kultur jaringan juga dilakukan dalam kondisi inkubasi yang terkontrol
dengan pengaturan suhu dan cahaya secara optimal mendorong
pertumbuhan. Pengembangan tanaman dengan teknik ini juga dilakukan
1
manipulasi dengan penambahan zat pengatur tumbuh berupa fitohormon
alami maupun sintesis pada tahap pertumbuhan dan pematangan sel
tanaman (Phillips and Garda, 2019).
Kultur jaringan dilakukan dengan menggunakan media yang
mengandung garam organik, logam (Fe), vitamin, sumber nitrogen organik,
inositol, sukrosa dan zat pengatur tumbuh. Proses penghasilan metabolit
sekunder dengan kultur jaringan dipengaruhi oleh kandungan media yang
digunakan serta zat pengatur tumbuh yang ditambahkan. Metabolit
sekunder pada suatu tanaman dihasilkan dengan spektrum yang luas dengan
proses metabolisme. Senyawa metabolit sekunder merupakan senyawa
organik yang tidak terlibat langsung dalam pertumbuhan, perkembangan
atau reproduksi tanaman. Kebanyakan metabolit sekunder pada tanaman
memainkan peranan penting dalam pertahanan tanaman terhadap herbivora
atau spesies lainnya (Iffat, 2019).
Metabolit sekunder yang ada pada tanaman cabe puyang dihasilkan dari
induksi kalus menggunakan eksplan daun. Pembentukan atau induksi kalus
dalam penelitian ini berdasarkan atas penelitian Junairiah dkk., (2018) yang
melakukan penanaman ekplan daun muda tanaman cabe puyang (P.
retrofractum Vahl.) di dalam media yang mengandung Zat Pengatur
Tumbuh (ZPT) dan hormon sesuai. Zat pengatur tumbuh yang digunakan
adalah NAA (Naphtalene Acetic Acid) dan BA (6-Benzilaminopurin)
dengan berbagai macam konsentrasi. Media yang paling optimal adalah
media dengan penambahan konsentrasi NAA:BA (0,5 mg/L dan BAP 0,5
mg/L) dengan waktu induksi kalus paling cepat yaitu selama 12 hari. Hasil
berat segar terdapat pada variasi media dengan konsentrasi NAA 1 mg/L
dan BAP 0,5 mg/L yang menghasilkan berat segar terbaik 70,6 mg
sedangkan hasil berat kering terbaik terdapat pada variasi media dengan
kombinasi ZPT konsentrasi NAA 1 mg/L dan BAP 2 mg/L yaitu 18 mg.
Seperti yang diketahui, induksi kalus dapat digunakan untuk identifikasi
profil metabolit sekunder. Identifikasi metabolit sekunder pada kalus
dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis. Berdasarkan penelitian
Faramayuda et al., (2021), proses identifikasi dengan kromatografi lapis
2
tipis dilakukan pada kalus yang di induksi dengan media optimal 2,4 -D:BA
(0,5:0,5) yang menghasilkan tekstur kompak dan warna putih pada minggu
ke-3 hingga minggu ke-9 setelah induksi. Kalus pada media optimal tersebut
dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut yang memiliki 3 sifat kepolaran
yaitu ekstrak methanol, ekstrak n-heksan dan ekstrak ethanol absolute
dengan variasi larutan standar. Proses penyemprotan dilakukan dengan
vanilin asam sulfat 10 % pada fase gerak pelarut ethyl acetate:n-heksan
dengan rasio (7:3). Hasil yang diperoleh adalah positif steroids-triterpenoids
atau monoterpenes-sesquiterpenes dengan kenampakan visual berwarna
ungu setelah disemprot vanilin asam sulfat 10 %.
Berdasarkan latar belakang diatas, diketahui bahwa kultur kalus dari
eksplan daun tanaman cabe puyang (P.retrofractum Vahl.) dapat digunakan
untuk produksi metabolit sekunder. Penelitian profil metabolit sekunder
alkaloid, flavonoid dan terpenoid pada pertumbuhan kalus dengan
menggunakan medium variasi 2,4-D dan NAA:BA masih terbatas
penggunannya. Sehingga, pada penelitian ini dilakukan uji metabolit
sekunder golongan alkaloid, flavonoid serta terpenoid pada tanaman cabe
puyang (P.retrofractum Vahl.) berdasarkan hasil perbanyakan kalus secara
in vitro pada berbagai variasi media dengan penambahan zat pengatur
tumbuh 2,4-D, NAA maupun BAP pada fase pertumbuhan kalus.
B. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang tersebut, permasalahan yang didapatkan
pada penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Media dengan variasi ZPT mana yang paling berpengaruh terhadap
pertumbuhan kalus tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.)
secara in vitro?
2. Bagaimanakah pengaruh variasi media terhadap kurva pertumbuhan
kalus tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.) secara in vitro
pada generasi pertama (G0)?
3. Apakah kalus tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.)
generasi pertama (G0) yang ditumbuhkan pada media optimal memiliki
profil metabolit sekunder?
3
C. Tujuan
Tujuan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Mengetahui media yang paling berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus
tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.)
2. Mengetahui pengaruh variasi media terhadap kurva pertumbuhan kalus
tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.) pada generasi pertama
(G0) dari beragam variasi media.
3. Serta mengetahui profil metabolit sekunder yang terkandung pada kalus
tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.) generasi pertama (G0)
berdasarkan variasi media optimal yang dihasilkan.
D. Manfaat Penelitian
Manfaat yang didapatkan dalam penelitian ini adalah:
1. Dapat memberikan informasi tentang media yang paling berpengaruh
terhadap pertumbuhan kalus tanaman cabe puyang (Piper retrofractum
Vahl.)
2. Dapat menambah wawasan tentang cara pembuatan kurva pertumbuhan
kalus tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.) generasi pertama
(G0) pada berbagai variasi media.
3. Dapat memperoleh informasi tentang profil metabolit sekunder yang
terkandung pada fase pertumbuhan kalus tanaman cabe puyang (Piper
retrofractum Vahl.) generasi pertama (G 0) berdasarkan variasi medium
optimal yang dihasilkan.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Tinjauan Pustaka
1. Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.)
Cabe Puyang atau biasa disebut Cabe Jawa (Piper retrofractum Vahl.)
merupakan salah satu jenis tanaman obat yang banyak digunakan di Indonesia.
Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.) tumbuh merambat dan
dimasukkan ke dalam famili Piperaceae (Haryudin dan Rostiana, 2009).
Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.) merupakan salah satu
tanaman yang memiliki berbagai nama daerah yakni di Sumatera dikenal
dengan nama: lada panjang, cabai jawa, cabai panjang, sedangkan di Jawa
dikenal dengan nama: cabean, cabe areuy, cabe jawa, cabe sula, cabe jimo,
cabe onggu, cabe solah (Madura) dan di Sulawesi dikenal dengan nama: cabia
(Makassar). Tanaman (P. retrofractum Vahl.) banyak dikenal dengan sebutan
“Cabai atau Cabe” karena memiliki buah berwarna merah dan berbentuk
panjang menyerupai cabai pada umumnya dari jenis Capsicum. Cabai ini
tidak dimasukkan dalam famili tanaman cabai genus (Capsicum), seperti yang
telah disebutkan sebelumnya cabai ini dimasukkan ke dalam famili
Piperaceae atau sirih-sirihan (Junairiah dkk., 2018). Berdasarkan taksonomi,
klasifikasi tanaman cabe puyang dari sumber ITIS (2020) adalah:
Kingdom : Plantae
Superdivision : Embryophyta
Division : Tracheophyta
Subdivision : Spermatophytina
Class : Magnoliopsida
Order : Piperaless
Family : Piperaceae
Genus : Piper
Species : Piper retrofractum Vahl.
5
Berdasarkan penelitian Haryudin dan Rostiana, (2011), diketahui
bahwa cabe puyang (P.retrofractum Vahl.) memiliki bentuk morfologi yaitu
pada daun, buah, batang, dan cabang dari 23 nomor aksesi yang
dikarakterisasi. Karakter yang baik untuk membedakan tanaman cabe
puyang adalah bentuk daun dan buahnya. Morfologi daun cabe puyang
dapat dibedakan ke dalam 2 kelompok, yaitu bentuk daun lebar (membulat),
dan daun sempit (lanset). Bentuk buahnya dibagi atas 4 kelompok, yaitu
bentuk buah bulat panjang, bulat pendek, panjang pipih, dan panjang kecil.
Selain itu, Cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) merupakan tanaman
tahunan yang tumbuh memanjat pada tiang panjat dan berbuku-buku (ruas),
bentuk batang bulat dan besar, berdiameter 5˗7 cm, Panjang ruas batang
utama 2,93˗9,82 cm, warna batang bervariasi dari hitam, coklat sampai
coklat kehitaman. Warna batang yang banyak ditemukan disetiap lokasi
ditemukannya cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) adalah coklat kehitaman.
Batang cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) menyerupai batang tanaman
lada yaitu memiliki pembuluh kayu dan pembuluh tapis serta percabangan
batang monopodial.
Daun tanaman cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) termasuk daun
yang tidak sempurna, daun hanya memiliki helai dan tangkai daun. Bentuk
helai daun ada dua macam yaitu berbentuk hati dan lonjong. Tangkai
daunnya melekat pada buku batang. Permukaan helai daun halus dan
berwarna hijau gelap. Tepi daun lurus melengkung atau rata, dengan ujung
runcing. Duduk/pangkal daun terdiri atas daun sulur utama dan sulur seperti
cacing. Tulang daun ada yang simestris dan tidak simetris (Zuchri, 2008).
Selain itu, Buah dari cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) beragam
yaitu memiliki bentuk bulat panjang (conical), bulat pendek (globular),
panjang pipih (filiform), dan panjang kecil (cylindrical) dengan ukuran yang
bervariasi. Perkembangan warna buahnya, terbentuk dari warna hijau,
kemudian berubah menjadi putih kekuningan, hijau, kuning kemerahan.
6
Semua variasi morfologi cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) dipengaruhi
oleh habitatnya (Haryudin dan Rostiana, 2009).
Gambar 1. Habitus Tanaman Cabe Puyang (P. retrofractum Vahl.)

(Dokumentasi pribadi)
Cabe Puyang tumbuh diseluruh wilayah Indonesia pada daerah

dengan ketinggian 1-6000 m dari permukaan air laut dengan suhu udara
20˗30 °C. Tanaman cabe puyang dapat tumbuh dan berbuah di dataran
tinggi pada elevasi 1200 m dari permukaan air laut. Tanaman ini dapat
tumbuh dengan media tanah lempung berpasir, dengan struktur tanah
gembur dan berdrainase baik. Toleransi pH media tanah tanaman cabe
puyang cukup tinggi yaitu pH 4-8. Curah hujan yang dikehendaki berkisar
1250˗2500 mm per tahun (Evizal, 2013).
2. Manfaat Cabe Puyang
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh beberapa orang,
tanaman cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) memiliki banyak manfaat.
Pada penelitian tersebut, dijelaskan bahwa tanaman cabe puyang
bermanfaat sebagai fitofarmaka atau tanaman obat. Menurut (Vinay et al.,
2012), buah tanaman cabe puyang dapat dijadikan ekstrak kering menjadi
berbagai macam jenis jamu, sehingga disebut juga sebagai cabe jamu. Efek
farmakologi ekstrak tanaman cabe puyang adalah analgesik (penghilang
rasa sakit), stimulant, afrodisiak (penambah syahwat), diaforetik
(peluruh/penghilang keringat), karminatif (pembuang angin), sedatif (obat
menenangkan, meredakan), hematinik dan antelmintik (obat cacing).
7
Selain itu, manfaat cabe puyang sebagai analgesik juga telah diteliti oleh
Evacuasiany dkk., (2010) dengan menggunakan ekstrak etanol buah cabe
jawa pada mencit. Ekstrak tersebut mengandung Piperidine yang
berfungsi mencegah obesitas pada mencit. Selain itu, khasiat cabe puyang
sebagai analgesik atau penghilang rasa nyeri didapatkan karena
komponen utama cabe puyang berupa piperine, chavicine, palmitic acid,
minyak atsiri, piperidine, thetrahydropiperic acid, dan sesamine memiliki
daya antipiretik, analgesik yang dapat menekan susunan saraf pusat.
Bagian cabe jawa mengandung piperine, piplartine, dan piperlonguminine.
Piperine berguna sebagai analgesik dan antiinflamasi karena menghambat
aktivitas cyclooxygenase (Cox) dan 5-lypoxygenase terhadap asam
arakidonat sehingga jumlah prostaglandin menurun.
Cabe Puyang selain menjadi efek analgesik juga bermanfaat dalam
pengobatan lain, hal tersebut dijelaskan dalam penelitian Mgbeahuruike et
al., (2017) bahwa tanaman cabe jawa yang mengandung beberapa metabolit
sekunder bermanfaat sebagai anti mikrobia, anti kanker, anti radang, anti
fungi, anti malaria, anti oksidan serta anti tumor. Secara spesifik, cabe
puyang berfungsi membantu melancarkan pencernaan, stimulan, gangguan
usus, karminatif, asma, kejang, sakit kepala, radang, influenza, anti perut
kembung saat masuk angin (antiflatulent), dan perawatan postpartum/ pasca
persalinan pada wanita.
3. Budidaya Cabe Puyang
Budidaya (perbanyakan) cabe puyang biasanya dilakukan secara
vegetatif menggunakan organ tanaman bukan secara generatif
menggunakan biji. Hal tersebut terjadi karena perbanyakan secara
generatif membutuhkan waktu yang cukup lama dan anakan yang
dihasilkan belum tentu memiliki sifat sama dengan induknya, tidak
seragam, dan membutuhkan waktu berbunga yang sangat lambat. Biji cabe
puyang memiliki sifat sangat keras dan impermeable, sehingga
membutuhkan usaha yang lebih saat proses perkecambahan (Utami dkk.,
2016). Perbanyakan secara vegetatif tanaman cabe puyang dilakukan
dengan stek sulur, baik sulur panjat maupun sulur tanah atau stek cabang
8
maupun stek tunas. Stek dengan sulur panjang memiliki daun yang lebih
lebar dan jumlah akar yang lebih banyak dibandingkan dengan tanaman
cabe puyang dari stek sulur menggunakan tanah (Setiawan dkk., 2013).
Sedangkan tanaman cabe puyang yang berasal dari sulur tanah mudah
diperoleh terutama saat musim hujan dan pengambilan bahan tanam tidak
merusak tanaman produksi (Melati dan Saleh, 2012).
4. Kultur In Vitro Kalus Tanaman Cabe Puyang
Kultur jaringan in vitro pada cabe puyang merupakan metode atau
teknik mengisolasi jaringan, organ, sel maupun protoplas tanaman yang
sering disebut sebagai eksplan yang mana eksplan tersebut ditumbuhkan
dalam media yang aseptik sehingga dapat tumbuh dan berkembang
menjadi tanaman yang utuh seperti induknya (Faramayuda dkk., 2016).
Kultur Jaringan in vitro pada cabe puyang dilakukan dengan maksud
perbanyakan kalus. Kultur jaringan yang digunakan dalam perbanyakan
kalus dapat dilakukan secara langsung dari organ tanaman maupun fase
kalus. Kultur kalus sering digunakan dalam memperoleh tanaman yang
bebas virus, embriogenesis somatik, regenerasi varian genetika dan
menghasilkan senyawa metabolit sekunder (Zulkarnain, 2009).
Kultur jaringan pada kalus tanaman cabe puyang juga digunakan
sebagai cara untuk memproduksi senyawa metabolit sekunder. Pada kultur
kalus tanaman cabe puyang ini dilakukan dengan prinsip aseptik dan
ditumbuhkan dalam media buatan yang mengandung zat pengatur tumbuh
(ZPT) untuk mempengaruhi pertumbuhan morfogenesis dalam kultur sel,
jaringan dan organ (Purnamaningsih dan Ashrina 2011).
Kultur in vitro dapat dilakukan secara langsung maupun tidak langsung
melalui fase kalus. Kalus adalah jaringan yang memiliki struktur kompak
(amorphous), terbentuk dari sel yang aktif membelah. Pembentukan kalus
terjadi akibat adanya perlukaan maupun kondisi tercekam pada bagian
tanaman. Kalus yang terbentuk selama kultur in vitro memiliki beberapa
kesamaan dengan jaringan yang tumbuh secara in vivo akibat perlukaan
pada tanaman (Sathyanarayana and Verghese, 2007). Secara histologi,
kalus merupakan hasil proliferasi sel parenkim di sekitar berkas
9
pengangkut tanaman selain xilem. Pembentukan kalus diawali dengan
pembengkakan (swollen) atau terbentuknya suatu jaringan berwarna putih
pucat atau kehijauan pada permukaan eksplan yang diberi perlukaan
(Parizot and Beeckman., 2008).
5. Media Kultur
Media kultur dalam perbanyakan tanaman cabe jawa (Piper
retrofractum Vahl.) merupakan media pertumbuhan eksplan yang memiliki
berbagai komponen baik sumber hara, sumber nutrisi dan vitamin yang
diperlukan eksplan untuk tumbuh. Media yang digunakan memiliki
beragam komposisi yang mempengaruhi ada atau tidaknya metabolit
sekunder senyawa alkaloid cabe puyang (Mujahid dkk., 2010).
Media kultur merupakan media steril untuk menumbuhkan sumber
bahan tanaman menjadi bibit. Pada umumnya, media berisi garam
anorganik dan organik seperti zat pengatur tumbuh, vitamin, karbohidrat,
dan heksitol. Selain itu, dalam media juga terdapat asam amino dan
antibiotik (Cristie et al., 2013). Dalam kultur jaringan, ZPT yang digunakan
diantaranya auksin dan sitokinin berupa 2,4 D dan BAP. Interaksi antara
ZPT tersebut dengan hormon yang diproduksi oleh sel secara endogen
menentukan arah perkembangan suatu kultur. Menurut Karjadi dan
Buchory (2008) penambahan auksin dan sitokinin eksogen mengubah
level dari ZPT endogen sel. Level ZPT merupakan triggering factor untuk
pertumbuhan dan morfogenesis.
Pada umumnya, kandungan auksin di dalam kultur jaringan berfungsi
merangsang pertumbuhan kalus, suspensi sel, dan organ. Auksin berfungsi
sebagai pembentukan akar dan kuncup samping dalam konsentrasi tertentu.
Sedangkan Sitokinin merupakan ZPT yang penting dalam pengaturan
pembelahan sel dan morfogenesis. Salah satu jenis sitokinin seperti yang
telah dijelaskan sebelumnya adalah BAP. Fungsi Sitokinin bersamaan
dengan Auksin eksogen berpengaruh terhadap pembentukan batang dan
akar. Perbandingan relatif antara auksin dan sitokinin pada media kultur
dapat mempengaruhi proses diferensiasi secara in vitro. Perbandingan
konsentrasi auksin yang lebih tinggi akan menginduksi akar sedangkan
10
perbandingan konsentrasi sitokinin yang lebih tinggi akan menginduksi
terbentuknya pucuk (Karjadi dan Buchory, 2008).
Zat pengatur tumbuh (ZPT) pada proses kultur in vitro sangat penting
ditambahkan dalam komponen media yang digunakan agar menyebabkan
pertumbuhan dan perkembangan pada sel tanaman. Zat pengatur tumbuh
yang biasa digunakan adalah sitokinin dan auksin dengan berbagai
kombinasi dan variasi agar dapat memanipulasi level keberhasilan kultur
tanaman. Sitokinin yang biasa digunakan adalah BAP (benzyl aminopurine)
dan kinetin yang diketahui dapat mengurangi dominansi apikal meristem
dan menginduksi terbentuknya tunas baru. Aplikasi konsentrasi BA yang
tinggi dapat menyebabkan pemanjangan meristem tanaman beserta
membentuk tanaman yang utuh. Auksin pada media tumbuh contohnya
adalah NAA (Naphtalene acetic acid) yang membantu induksi akar pada
kultur in vitro (Ngomuo et al., 2013).
Selain itu, menurut Indah dan Ermavitalini (2013), zat pengatur tumbuh
ditambahkan pada medium sebagai penentu keberhasilan kultur in vitro. Zat
pengatur tumbuh (ZPT) yang sering digunakan sebagai pembentukan kalus
adalah auksin. Diantara golongan auksin yang sering digunakan pada media
kultur jaringan adalah 2,4-D dan IAA. Dibanding golongan auksin IAA,
2,4-D memiliki sifat yang lebih stabil karena tidak mudah terurai oleh
enzim-enzim yang dikeluarkan oleh sel tanaman ataupun oleh pemanasan
pada proses sterilisasi. Selain ZPT auksin 2,4-D digunakan juga ZPT
golongan sitokinin berupa BAP. Pemilihan zat pengatur tumbuh BAP
dibandingkan kinetin dikarenakan sifatnya yang lebih stabil, mudah
diperoleh dan lebih efektif dalam mempengaruhi produksi senyawa
metabolit sekunder.
6. Kurva Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang
Proses induksi kalus adalah proses untuk mendapatkan kalus. Pada
proses induksi kalus ini, eksplan diinduksikan ke media padat kemudian
diinkubasikan pada suhu 27 °C dalam ruang gelap dan dilakukan
penyesuaian terhadap kalus yang terbentuk.
11
Berdasarkan penelitian Tunjung et al., (2020) penggunaan semua
kombinasi ZPT 2,4-D dan BAP pada induksi kalus dari eksplan biji jeruk
purut (Cyrus Hystrix DC.) pada medium Murashige and Skoog
menghasilkan 100 % terbentuknya kalus. Semua kalus yang terbentuk
memiliki tekstur friabel atau remah. Tekstur kalus remah atau friabel adalah
penanda yang digunakan untuk mengetahui kualitas dari kalus tersebut.
Kalus yang friabel dapat digunakan sebagai kultur suspensi sel. Selain itu,
kalus yang dihasilkan adalah berwarna kuning, transparan dan cerah, serta
warna kalus ini sama dengan eksplan daun yang digunakan. Selama
pertumbuhan, kalus berubah dari kuning menjadi cokelat. Kalus berwarna
kuning menandakan kalus masih aktif membelah sedangkan kalus berwarna
cokelat menandakan kalus memasuki fase kematian. Proses ini
mengindikasikan kekurangan nutrisi dan pembentukan metabolit sekunder.
Kebanyakan kalus yang digunakan sebagai uji metabolit sekunder adalah
kalus dengan tekstur kompak atau friabel. Fase pertumbuhan kalus yang
ideal biasanya disajikan dalam bentuk kurva pertumbuhan. Fase
pertumbuhan tersebut disajikan dalam kurva sigmoid yang dibagi atas 3 fase
yaitu fase lag (lag phase)., fase eksponensial (exponential phase) serta fase
stationer (stationary phase).
Kurva pertumbuhan semua tanaman dapat ditunjukkan dalam 4 fase
pertumbuhan. Fase lag terjadi saat pertama kali eksplan dimasukkan dalam
media padat. Periode awal (lag phase) adalah periode yang menunjukkan
sinyal dari pembelahan sel. Pembelahan sel terus meningkat diikuti dengan
bertambahnya jumlah sel, sehingga pertumbuhan kalus memasuki fase
eksponensial. Peningkatan sel tersebut kemudian bergerak menuju fase
linear yang menyebabkan jumlah sel yang bertambah sudah tidak meningkat
lagi dan terjadi perlambatan secara berangsur-angsur pada tingkat
pembelahan. Diakhiri dengan masuknya sel-sel pada fase stasioner atau
tidak lagi terjadi pembelahan. Biasanya untuk memperbanyak
kelangsungan hidup dari kultur eksplan harus dilakukan subkultur pada
awal fase stationary (Dwimahyani, 2007).
12
Gambar 2. Kurva Pertumbuhan Kalus (Dwimahyani 2007).
7. Komponen Metabolit Sekunder Tanaman Cabe Puyang
Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.) memiliki metabolit sekunder
yang beragam dan mampu dimanfaatkan dalam berbagai aspek kehidupan.
Metabolit sekunder tersebut diantaranya adalah senyawa alkaloid seperti
piperine, piperlonguminine, sylvatine, guineensine, piperlongumine, filfiline,
sitosterol, methyl piperate, kavisin, piperidin, saponin, isobutildeka-trans-2-
trans-4-dienamida, polifenol, asam tetrahidropiperat, 1 undesenil-3,4-
metilendoksibenzena, sesamin dan minyak atsiri (Taryono dan Ruhnayat,
2004).
Kandungan metabolit sekunder alkaloid yang paling banyak ditemukan
pada cabe jawa ini adalah piperin dan piperidin. Menurut Nugroho (2017),
alkaloid piperidine dibentuk dari L-lisin yang merupakan homolog dari L-
ornitin dan berfungsi sebagai prekursor alkaloid. Kelompok ekstra metilen
pada lisin tersebut yang menunjukkan bahwa asam amino berpartisipasi
dalam membentuk cincin enam atom karbon pada cincin piperidina,
sedangkan pada cincin pirolidin tersedia lima atom karbon. Berikut adalah
gambar struktur kimia piperine:
Gambar 3. Struktur Kimia Piperine (Patil et al., 2016)
13
Berdasarkan struktur kimia Piperine (gambar 3), diketahui bahwa
senyawa piperine kebanyakan ditemukan pada kandungan heterosiklik dari
tanaman lada hitam, lada putih, lada hijau dan jenis piperaceae lainnya.
Piperine dihasilkan dengan banyak golongan alkaloid yang berasal dari 6
pasangan cincin yang saling menyatu berupa N atau Piperidine. Selain itu,
Piperine juga terdiri atas ikatan alifatik yang berkonjugasi pada jembatan
struktur kimia antara piperidine heterosiklik dan sekelompok 5 -(2,4-
Methylenedioxyphenyl). Alkaloid juga dibentuk karena adanya ikatan
nitrogen heterosiklik dengan atom oksigen. Adanya ikatan kelompok C=O
akan menyebabkan polaritas pada molekul yang ada tetapi berkonjugasi
pada jembatan yang menghubungkan cincin benzena yang membuat
piperine bersifat nonpolar atau hidrofobik (Patil et al., 2016).
Sedangkan struktur kimia metabolit indol alkaloid yang lain adalah:
Gambar 4. Struktur Kimia Metabolit Sekunder Indole Alkaloid Cabe Jawa

(Cahyono et al., 2019), Gambar struktur (A) menunjukkan
standar piperine; kandungan lain dari buah cabe jawa (Piper
retrofractum Vahl.) yang lain adalah dihydropiperine (B);
dihydropiperolonguminine (C); Piperilin pipersida (D);
Piperside (E); Pelitorine (F) dan dihydropiperine (G).
Kandungan piperine yang dimiliki cabe jawa sekitar 2 % atau 4-6 %
sedangkan minyak atsiri sebanyak 1 % (Evizal, 2013). Selain itu,
berdasarkan penelitian (Jamal dkk., 2013), minyak atsiri yang dimiliki
cabe jawa mengandung 3 komponen utama diantaranya β- caryophyllene
(17 %), pentadecane (17,8 %), dan β- bisabollene (11,2 % ). Daun cabe
jawa mengandung minyak atsiri yang memiliki aktivitas sebagai
antibakteri. Minyak atsiri pada daun tanaman cabe puyang
(P. retrofractum Vahl.) juga dikelompokkan kedalam beberapa golongan
terpenoid seperti Monoterpene 3,48 %; Monoterpene alkohol 0,50 %,
Sesquiterpene 63,44 %, Sesquiterpene alkohol 3,61 % dan komponen
terpen lain sebanyak 28,21 %. Minyak atsiri pada tanaman cabe puyang
14
dibagi kedalam 33 komponen kimiawi dengan 4 senyawa kimia paling
utama yaitu germacrene sebanyak 24,20 %; tetramethylcyclo
[5.3.1.0(4,11)] undec-8-ene sebanyak 17,73 % Ar-turmerone dan benzyl
nenzoate sebanyak 6,28 %.
Minyak atsiri pada Piperaceae merupakan modifikasi dari sel
parenkim, turunan dari asam mevalonat dan biasanya disebut minyak
essensial karena terdiri atas asam lemak dan asam amino yang sangat
dibutuhkan oleh mahluk hidup (Nugroho, 2017). Menurut Junairiah et al.,
(2020) tanaman cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) memiliki
kandungan minyak atsiri yang berfungsi sebagai obat. Kandungan
dominan pada tanaman ini berdasarkan hasil penelitan tersebut diperoleh
senyawa piperine dan phytol yang paling dominan sebanyak 41.71 % dan
23.95 %.
Kandungan metabolit sekunder yang dimiliki tanaman Cabe Puyang
menurut (Knapsackfamily.com) adalah:
Tabel 1. Kandungan Metabolit Sekunder pada Piper retrofractum Vahl.
Number of matched data 9
C_ID Metabolites Molecular Mw Organism or InChIKey

formula etc.
C00002065 Piperine C17H19NO3 285.136493 Piper retrofractum Vahl.

48
C00002066 Piperlongumi C17H19NO5 317.126322 Piper retrofractum Vahl.

ne 72
C00003672 beta - C29H50O 414.386166 Piper retrofractum Vahl.

Sitosterol 22
C00030436 Guineensine C24H33NO3 383.246043 Piper retrofractum Vahl.

93
C00037153 Filfiline C26H47NO 389.365765 Piper retrofractum Vahl.

13
C00037498 Methyl C13H12O4 232.073558 Piper retrofractum Vahl.

piperate 87
C00037873 Sylvatine C24H33NO3 383.246043 Piper retrofractum Vahl.

93
15
Berdasarkan (Knapsackfamily.com) yang disajikan pada (Tabel 1)
diatas, kandungan metabolit sekunder yang paling banyak dimiliki oleh
tanaman cabe puyang adalah (-)-beta-Sitosterol (C29H50O) dengan berat
molekul 414.38 Mw.
8. Thin Layer Chromatopgraphy (Kromatografi Lapis Tipis)
Kromatografi lapis tipis termasuk ke dalam tipe kromatografi planar
dan menjadi teknik analisis yang banyak digunakan untuk memisahkan
campuran senyawa kimia berdasarkan distribusinya di antara dua fase, yaitu
fase diam dan fase gerak. Fase diam merupakan bahan pelapis pada lempeng
KLT yang biasanya terbuat dari bubuk silika, aluminium oksida, atau
selulosa. Fase gerak merupakan pelarut tunggal atau campuran yang
menyebabkan ekstrak mengalami pemisahan. Fase gerak berinteraksi
dengan fase diam melalui daya kapilaritas yang memungkinkan terjadinya
pemisahan beragam komponen berdasarkan kelarutan dan retensinya dalam
fase diam dan fase gerak. Pemisahan tersebut terjadi melalui kompetisi
antara molekul sampel dan fase gerak untuk berikatan atau berinteraksi
dengan fase diam. Setiap senyawa akan bergerak dengan laju tertentu dan
tingkat pergerakannya dinyatakan sebagai faktor retardasi (R f). Faktor
retardasi tersebut merupakan hasil perbandingan jarak yang ditempuh fase
gerak mulai garis awal hingga akhir dengan jarak pergerakan senyawa kimia
yang telah terpisah dengan afinitas tertentu (Laode et al., 2014).
Kromatografi lapis tipis berfungsi mengetahui metabolit sekunder suatu
tanaman secara kualitatif. Berdasarkan (Hikmawanti dkk., 2021). Buah
tanaman cabe jawa memiliki banyak kandungan senyawa esensial
didalamnya salah satunya Piperin. Piperidin merupakan suatu senyawa
alkaloid dalam bentuk prisma monosiklik dari alkohol dengan titik lebur
128-130°C, mudah larut dalam etanol, eter namun hampir tidak larut
dalam air, senyawa piperin juga berwarna putih kekuningan. Kadar piperin
tersebut diuji dengan metode KLT dengan cara diekstraksi menggunakan
metode maserasi.
16
Ekstrak kalus hasil induksi eksplan daun tanaman cabe puyang (Piper
retrofractum Vahl.) dianalisis metabolit sekundernya menggunakan
kromatografi lapis tipis. Analisis metabolit sekunder dilakukan dengan
menggunakan perbandingan pengembang yaitu toluen : etil asetat : n-heksan
(7:3) selanjutnya dilakukan identifikasi kandungan dengan memberikan
penampak bercak yang spesifik seperti H 2SO4 10 % dalam metanol,
Sitroborat dan Lieberman-Bouchard. Profil KLT kalus dibandingkan
dengan eksplan cabe jawa kontrol dan ekstrak daun cabe jawa yang tumbuh
di habitat aslinya (Faramayuda dkk., 2016).
B. Hipotesis
Berdasarkan kajian pustaka penelitian-penelitian yang telah dilakukan
sebelumnya, diperkirakan hipotesis dari penelitian ini adalah sebagai
berikut:
1. Media yang paling berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus tanaman
cabe puyang pada generasi pertama (G0) adalah media dengan
kombinasi ZPT yang seimbang yaitu 2,4-D (0,5 mg/L) dan BA (0,5
mg/L) serta NAA (0,5 mg/L) dan BA (0,5 mg/L).
2. Variasi media yang ditambahkan zat pengatur tumbuh dengan rasio
sitokinin dan auksin yang sesuai akan berpengaruh terhadap
kecepatan pertumbuhan kalus tanaman cabe puyang (Piper
retrofractum Vahl.) secara in vitro.
3. Profil metabolit sekunder yang ditemukan pada fase pertumbuhan
kalus cabe puyang (P.retrofractum Vahl.) pada medium optimal berupa
metabolit sekunder golongan alkaloid yaitu Piperine, golongan
flavonoid dan terpenoid.
17
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada Bulan September tahun 2020 hingga Bulan
Desember tahun 2021 di Laboratorium Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan
atau Bioteknologi serta Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi
Universitas Gadjah Mada.
B. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini dibagi menjadi 3 yaitu
tanaman yang digunakan, bahan untuk kultur in vitro dan bahan untuk uji
metabolit sekunder.
1. Bahan Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl. ) yang
digunakan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bibit tanaman
cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) dari petani Desa Barongan,
Kecamatan Jetis, Kabupaten Bantul, Daerah Istimewa Yogyakarta.
Bahan yang diambil dari bibit tanaman ini adalah daun muda yang
terletak 2 tingkat di bawah pucuk daun tanaman cabe puyang.
2. Bahan untuk Kultur In vitro
Bahan yang digunakan untuk kultur in vitro dalam penelitian ini
adalah akuades steril, Etanol 70 % grade C (untuk sterilisasi alat di
laboratorium), NaClO 5,25 % (Bayclin/Proclin), Sabun (sunlight),
fungisida (Amistar Top), kertas label, kertas saring, tissue, korek api,
spiritus, alumunium foil, plastic seal, blade, scalpel steril, KOH 0,1 N;
HCl 0,1 N; kertas indikator pH atau pH universal (Merck), serta media
MS (Murashige and Skoog) ditambah dengan hormon pertumbuhan
sintetik BA (Sitokinin) serta sintetik auksin NAA dan 2,4-D.
3. Bahan untuk Uji Metabolit Sekunder Tanaman Cabe Puyang
Bahan yang digunakan untuk uji metabolit sekunder tanaman cabe
puyang (P. retrofractum Vahl.) adalah sampel kalus pada fase
eksponensial serta daun ex vitro sebagai pembanding. Pada saat
18
ekstraksi dengan cara maserasi, digunakan pelarut Ethanol absolute 95%
(Merck), Kloroform (Merck) dan Methanol (Merck) dengan sifat
kepolaran yang berbeda yaitu polar, non-polar dan semi polar. Selain
itu, untuk uji metabolit sekunder dengan KLT (Kromatografi Lapis
Tipis) secara kualitatif digunakan pelarut berupa methanol dan etanol
absolute serta digunakan eluen polar, semi polar dan non-polar yaitu
toluena, etil asetat dan n-heksan untuk pereaksi semprot digunakan
Reagen Dragendroff (untuk uji Alkaloid) menggunakan larutan standar
Piperin 1 mg dalam 1 mL metanol., Reagen Siroborat (untuk uji
Flavonoid) menggunakan larutan standar Quersetin., serta Reagen
Vanilin Asam Sulfat (untuk uji Terpenoid) menggunakan larutan
standar Linalool dan Cajuput.
C. Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini terbagi atas 3 kelompok
yaitu alat untuk pelaksanaan pada kultur in vitro, Alat untuk pengukuran
kurva pertumbuhan kalus dan pengamatan pertumbuhan kalus, serta alat
untuk analisis metabolit sekunder pada pertumbuhan kalus.
1. Alat untuk pelaksanaan pada kultur in vitro
Alat yang digunakan pada pembuatan media adalah: timbangan
analitik, gelas beaker, gelas ukur, syringe 1 mL, pH meter, magnetic
stirrer, tabung erlenmeyer, botol kultur, petridish, kompor, corong dan
autoclave. Sedangkan alat untuk induksi kalus adalah: botol jam steril,
petridish steril, pinset steril, scalpel handle steril, sprayer alkohol,
lampu bunsen, kertas bungkus, erlenmeyer, botol kultur steril, gelas
beaker, pipet tetes, LAF (Laminar Air Flow) merk (Gelman Sciences),
shaker dan ruang inkubator.
2. Alat untuk pengukuran kurva pertumbuhan kalus dan
pengamatan pertumbuhan kalus
Alat yang digunakan pada pengukuran kurva pertumbuhan kalus
tanaman Cabe Puyang adalah timbangan analitik untuk mengukur berat
kering dan berat segar kalus, RHS colour Chart Sixth Edition 2015 untuk
pengamatan warna kalus, Oven merk (esco isoterm) untuk
19
mengeringkan kalus serta dokumentasi selama pengamatan
menggunakan kamera digital Fuji Film X-A2 9V.
3. Alat untuk analisis metabolit sekunder pada pertumbuhan kalus
Alat yang digunakan untuk analisis metabolit sekunder pada kalus
dan daun ex vitro tanaman cabe puyang adalah: pada proses ekstraksi
digunakan oven untuk pengeringan sampel, blender atau cawan porselen
untuk pembuatan serbuk sampel, gelas ukur, spatula atau pengaduk,
gelas beaker., kertas saring, Mikrotube, konikel tube, tempat tube,
sentrifuge, vortex, sonikator dan lemari maserasi. Sedangkan alat yang
digunakan untuk proses uji metabolit dengan KLT (Kromatografi Lapis
Tipis) adalah gelas ukur, Chamber KLT, Plat KLT silika gel GF 254
dengan ukuran 2 cm × 10 cm, kertas saring, sprayer KLT, Pompa
Vakum semprot KLT, spatula, mikropipet, propipet, pipet ukur, pipet
tip, mikrotube, corong kaca, botol gelap reagen, cutter, penggaris,
timbangan analitik, oven, lampu UV, kamera, pinset, hair dryer, dan
lemari asam.
D. Cara Kerja
Pada penelitian ini, perlakuan dibagi atas determinasi tanaman cabe
puyang, pembuatan medium Murashige and Skoog (MS), induksi kalus,
preparasi ekstrak kalus dan daun ex vitro, uji metabolit sekunder dengan
kromatografi lapis tipis beserta analisis data dengan SPSS.
1. Determinasi Tanaman Cabe Puyang
Tanaman cabe puyang yang diperoleh petani dilakukan determinasi
di Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas
Gadjah Mada. Determinasi dilakukan untuk menunjukkan bahwa
tanaman yang digunakan benar cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.).
2. Pembuatan Media Murashige and Skoog (MS)
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media basal MS
(Murashige and Skoog). Langkah pembuatan media kultur secara
umum adalah sebagai berikut: Disiapkan akuades sebanyak 500 mL
dalam gelas beaker berukuran 1000 mL atau 1 . Kemudian komponen
makronutrien larut, ditambahkan stok mikronutrien, stok besi, stok
20
vitamin, stok zat pengatur tumbuh dan myo-inositol. Setelah itu, semua
media dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer. Kemudian,
media tersebut diukur pH nya menggunakan indikator universal pH,
jika media tersebut asam maka ditambahkan KOH sedangkan jika pH
media tersebut basa maka ditambahkan HCL sebanyak 7-10 tetes.
kemudian media dipanaskan diatas kompor disertai dengan pengadukan
dan dituang dalam botol kultur. Selanjutnya, disterilisasi menggunakan
autoclave pada suhu 121°C selama 45 menit dengan tekanan 1 atm.
Setelah itu, media disimpan dalam ruang inkubasi.
Dalam proses induksi kalus untuk menguji metabolit sekunder,
digunakan berbagai perbandingan konsentrasi zat pengatur tumbuh
berupa auksin sintetik dan sitokinin seperti NAA, 2,4-D dan BAP
dengan 7 perlakuan atau variasi medium. Perlakuan tersebut dibuat
menjadi 5 ulangan penanaman dan perhitungan 3 ulangan.
Tabel 2. Rancangan Zat Pengatur Tumbuh yang Digunakan:
Konsentrasi
ZPT (mg/L)
Kode
Perlakuan 2,4-D NAA BA
Kontrol 0 0 0
N1 0 1 0
N0 0 0,5 0,5
N12 0 1 2
N10 0 1 0,5
D1 1 0 0
D10 1 0 0,5
3. Induksi Kalus Daun Tanaman Cabe Puyang (P. retrofractum

Vahl.)
Sebelum dilakukan induksi kalus dan regenerasi daun cabe puyang,
dilakukan prasterilisasi alat ruang kerja dan eksplan terlebih dahulu.
Prasterilisasi alat dilakukan pada beberapa alat inokulasi yang
sebelumnya telah disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 °C selama
15 menit dengan tekanan 1 atm. Tahap sterilisasi ruang kerja dilakukan
21
pada semua peralatan selain bahan tanam dan media tanam, yang
dimasukkan ke dalam LAF dan sebelumnya telah disemprot
menggunakan alkohol 70 %, kemudian disinari dengan UV selama 15
menit. Ketika siap digunakan, UV dimatikan kemudian lampu neon dan
blower pada LAF dihidupkan.
Tahap sterilisasi pada eksplan dimulai dengan tahap prasterilisasi

kemudian sterilisasi. Tahap prasterilisasi pada eksplan dilakukan
dengan mencuci eksplan terlebih dahulu menggunakan sabun Tween 80
dan dibilas dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran pada
permukaan eksplan, kemudian eksplan daun dimasukkan ke dalam
erlemnmeyer ditambah dengan fungisida Amistar Top 325Sc sebanyak
0,7 mL. Setelah itu, ditambah akuades steril sampai tanda batas 100 mL
pada erlenmeyer, lalu erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan
seal kemudian di shaker selama ±15 menit.
Pada tahap sterilisasi eksplan, dilakukan di dalam LAF. Eksplan
yang sudah dilakukan prasterilisasi tadi, fungsida dalam erlenmeyer
dibuang. Kemudian eksplan dicuci dengan akuades 1 kali. Setelah itu,
eksplan direndam dalam alkohol 70 % sesaat selama 30 detik sambil
digojok. Selanjutnya, larutan alkohol 70 % dibuang, dan eksplan dicuci
lagi menggunakan akuades steril sebanyak 1 kali kemudian eksplan
disterilisasi dengan menambahkan NaClO 5,25 % sampai eksplan
terendam dan digojok selama ±3 menit. Larutan NaClO 5,25 % dibuang
dengan pipet tetes dan eksplan dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali.
Proses induksi kalus dimulai dengan penanaman eksplan. Bagian
eksplan yang digunakan dalam induksi kalus adalah daun muda. Daun
tersebut dipotong dengan membentuk persegi dengan ukuran ±1 -1,5
cm2, dipotong bagian tengah, pangkal dan ujungnya kemudian
diberikan perlukaan pada bagian tengah daun yang telah dipotong tadi.
Eksplan tersebut diambil dengan pinset steril dan dilewatkan di atas api
(Bunsen) kemudian diinokulasikan pada medium perlakuan dalam
botol kultur atau petridish. Setiap jenis eksplan diinokulasikan
sebanyak 5 ulangan botol kultur atau petridish kemudian ditutup
22
kembali dan di seal serta disimpan dalam ruang inkubasi. Induksi kalus
diamati pertumbuhannya selama ±1 bulan atau 33 hari. Parameter yang
diamati dalam induksi kalus berupa: waktu inisiasi kalus (WIK), warna
kalus, struktur kalus, berat segar dan berat kering dari kalus.
Subkultur kalus juga dilakukan untuk menghindari browning. Kalus
disubkultur pada medium perlakuan yang sama. Selain itu, untuk
menghindari browning dapat dilakukan juga dengan penambahan arang
aktif sebanyak 2 g pada medium. Pengamatan kalus dilakukan tiga hari
sekali sampai umur kalus 35 hari dan dihitung berat segar seminggu
sekali, dilakukan sampai umur kalus 35 hari juga. Perhitungan berat
kering dilakukan setelah perhitungan berat segar telah selesai.
4. Preparasi Ekstrak Kalus dan Daun Ex Vitro Tanaman Cabe
Puyang (Piper retrofractum Vahl.)
Kalus dan daun ex vitro tanaman cabe puyang sebelum dilakukan
uji metabolit sekunder menggunakan kromatografi lapis tipis, dilakukan
ekstraksi menggunakan metode maserasi. Metode ektraksi dengan
maserasi merupakan ekstraksi dingin sebab tidak menggunakan
pemanasan.
Metode ekstraksi menggunakan maserasi dilakukan dengan
perendaman sampel kurang lebih 1 hari. Sampel yang sudah ditumbuk
dengan alu dan mortar dihasilkan dalam bentuk serbuk kemudian
dihitung beratnya dengan timbangan analitik. Selanjutnya, serbuk
tersebut dimasukkan dalam conical tube dan ditambahkan dengan
pelarut atau solvent dengan perbandingan (1:10) dari berat sampel.
Setelah itu, di shaker kurang lebih 24 jam atau dilakukan perendaman
selama 24 jam. Kemudian, hasil perendaman tersebut dituang dalam
microtube dan dilakukan sonikasi sebanyak 2 kali selama 2 menit
kemudian di sonikasi lagi 1 kali selama 10 menit. Setelah itu, ekstrak
diuapkan pada lemari maserasi atau suhu ruang sehingga diperoleh
ekstrak kental.
23
5. Analisis Profil Metabolit Sekunder pada Kalus dan Daun Ex
Vitro Tanaman Cabe Puyang dengan Kromatografi Lapis Tipis
Profil metabolit sekunder tanaman cabe puyang di identifikasi
menggunakan kromatografi lapis tipis secara kualitatif. Identifikasi
metabolit sekunder ini dilakukan pada ekstrak kental hasil maserasi
berupa ekstrak ethanol, methanol dan kloroform dengan sifat kepolaran
yang berbeda.
Uji metabolit sekunder dengan kromatografi lapis tipis dilakukan

untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder golongan Alkaloid,
Flavonoid, dan Terpenoid pada daun ex vitro dan kalus tanaman cabe
puyang. Hasil ekstraksi dengan proses maserasi tadi, diuapkan dengan
menggunakan rotary evaporator dan vortex kemudian diperoleh
ekstrak kental. Hasil ekstrak kental ditambah sedikit pelarut
sebelumnya, kemudian digunakan dalam uji kromatografi lapis tipis ini.
Sebelum dilakukan uji profil metabolit sekunder, disiapkan plat KLT
silika gel GF254 dengan cara memotong plat tersebut dengan ukuran 2
cm × 10 cm., atau 4cm x 10 cm dibagian atas kertas diberi tanda batas
atas ± 0,5 cm dan dibagian bawah diberi tanda batas bawah ±1,5 cm.
Sebelum digunakan, plat diaktivasi dengan cara dikeringkan
menggunakan oven pada suhu
± 70 °C selama 15 menit untuk menghilangkan air atau kelembaban
pada plat sehingga pada proses elusi lempeng dapat menyerap dan
berikatan dengan ekstrak sampel. Selanjutnya, disiapkan eluen sebagai
fase gerak dengan kepolaran masing-masing. Penggunaan eluen dibagi
atas:
a. Untuk uji Alkaloid dilakukan dengan menggunakan pelarut:

i. toluena : etil asetat (1:1) dalam 10 mL larutan
ii. n-heksan dan etil asetat (7:3) dalam 10 mL larutan.
b. Untuk uji Flavonoid dilakukan dengan menggunakan pelarut:
i. n-heksan : etil asetat : asam formiat (6 : 4 : 0,1) dalam 10
mL larutan
24
ii. toluene : etil asetat (1 :1) dalam 10 mL larutan
iii. serta n-heksan : etil asetat (7:3) dalam 10 mL larutan.
c. Untuk uji Terpene dilakukan dengan menggunakan pelarut:

i. Larutan toluena : etil asetat (97 : 3) dalam 10 mL larutan.
Beberapa eluen yang digunakan tersebut, dilakukan

penjenuhan dalam chamber atau bejana pengembang dengan cara
memasukkan kertas saring dan dilihat penyerapan eluen tersebut
sampai tanda batas atas chamber.
Setelah plat KLT di aktivasi dalam oven, plat tersebut
ditotolkan dengan sampel ekstrak sebanyak 0,5 µL, Penotolan
tersebut dilakukan dengan menggunakan mikropipet pada batas
bawah plat tersebut. Penotolan sampel sejajar dan diberi jarak ± 0,5
cm antar penotolan, Penggunaan mikropipet ini dilakukan untuk
menyamakan volume larutan yang diambil pada setiap penotolan.
Setelah selesai penotolan, dilakukan pengeringan menggunakan
hair dryer selama ± 1 menit dengan jarak ± 20 cm antara hair dryer
dengan plat. Pengeringan bertujuan agar sampel dan larutan standar
benar-benar menempel dan terserap oleh plat. Selanjutnya, plat di
running di dalam chamber atau bejana pengembang setelah eluen
telah jenuh. Kertas saring dalam chamber diambil, kemudian plat
dimasukkan dalam chamber untuk melakukan proses elusi.
Kemudian bejana ditutup dan ditunggu hingga eluen merambat
sampai batas atas plat kromatografi tersebut. Setelah eluen dalam
bejana sudah mencapai batas atas plat tersebut, plat diambil dengan
pinset dan di oven lagi selama ± 1 menit dengan suhu ± 70°C.
Pengeringan dengan oven bertujuan untuk menghilangkan eluen
yang masih membasahi plat. Setelah di oven, hasil running di amati
dibawah sinar UV λ 254 nm dan UV λ 366 nm serta sinar tampak
kemudian di dokumentasi. Setelah diamati, Plat tersebut disemprot
dengan pereaksi semprot yang sesuai yaitu:
• Uji Alkaloid dengan pereaksi semprot Dragendroff
25
• Uji Flavonoid dengan pereaksi semprot Sitroborat
• Uji Terpenoid dengan pereaksi semprot Vanilin Asam
Sulfat
Penyemprotan dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya
kandungan Alkaloid, Flavonoid dan Terpenoid pada ekstrak daun
dan kalus tanaman cabe puyang. Penyemprotan dilakukan dengan
jarak ± 10 cm dari jarak plat ke penyemprotan. Penyemprotan
tersebut dilakukan pada lemari asam agar larutan tidak menyebar
keluar dan untuk menjaga kondisi ruang laboratorium tetap safety.
Penyemprotan menggunakan sprayer khusus KLT dan pompa
vakum KLT yang memiliki hasil semprotan dengan ukuran partikel
yang sangat kecil sehingga hasil semprotan bisa merata dan tidak
merusak plat KLT.
Setelah dilakukan penyemprotan, plat kemudian dikeringkan
kembali di dalam oven selama 15 menit. Pengeringan ini bertujuan
untuk menghilangkan pereaksi semprot pada plat dan mengaktivasi
warna dari bercak noda yang sudah disemprot dengan pereaksi
semprot sehingga dapat memunculkan warna spesifik dengan jenis
senyawa metabolit yang dicari.
Selanjutnya, plat diamati pada cahaya tampak dibawah sinar
UV λ 254 nm dan UV λ 366 nm. Pengamatan dengan cahaya tampak
berfungsi untuk mengamati warna yang terbentuk dari hasil
penyemprotan sedangkan pengamatan dengan sinar UV λ 254 nm
akan terjadi fluoresensi sedang akibat adanya interaksi sinar UV
dengan indikator fluoresensi pada plat sehingga dapat memperjelas
noda yang terdapat pada plat serta pada Sinar UV λ 366 nm akan
terjadi fluoresensi tinggi akibat adanya interaksi antara sinar UV
dengan kromofor yang terikat pada plat sehingga menimbulkan
warna yang lebih gelap dan noda-noda pada plat terlihat lebih jelas.
Hasil positif kandungan senyawa metabolit sekunder alkaloid
pada ekstrak kalus dan daun ex vitro tanaman cabai puyang (Piper
retrofractum Vahl.) dengan eluen yang digunakan adalah penampak
26
bercak timbul warna coklat, biru atau kuning. Hasil positif
kandungan senyawa metabolit sekunder flavonoid pada ekstrak
kalus dan daun ex vitro tanaman cabai puyang (Piper retrofractum
Vahl.) dengan eluen yang digunakan adalah penampak bercak
timbul warna warna kuning atau warna terang (Faramayuda dkk.,
2016). Sedangkan untuk senyawa metabolit sekunder terpenoid pada
ekstrak dan larutan standar penampak bercak yang timbul adalah
abu-abu atau violet ungu.
6. Analisis Data
Data kualitiatif diperoleh dari pengamatan yang dilakukan
berupa morfologi kalus sedangkan profil metabolit sekunder
dianalisis secara deskriptif. Data kuantitatif dianalisis secara statistik
menggunakan analisis varian (ANOVA) faktorial 7 x 3. Apabila
ditemukan siginifikansi maka dilanjutkan dilakukan uji lanjut
Duncan multiple range test (DMRT) dengan taraf siginifikansi
sebesar 95 %. Penyajian data dilakukan menggunakan Ms. Excel
2016 dan dibuat grafik nya dalam bentuk kurva.
27
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Variasi Media yang Paling Berpengaruh Terhadap Pertumbuhan
Kalus Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.)
Beberapa variasi media dengan penambahan ZPT yang digunakan dalam
proses pertumbuhan kalus menghasilkan respon pertumbuhan kalus yang
berbeda-beda sehingga waktu induksi kalus, persentase pembentukan kalus,
serta morfologi kalus antara satu variasi media dengan yang lain akan
menghasilkan kalus yang berbeda pula. Hal tersebut dapat diketahui dengan
hasil penelitian yang telah dilakukan sebagai berikut:
Tabel 3. Waktu Induksi Kalus (WIK), Persentase serta Morfologi
Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang secara In Vitro dengan berbagai
variasi penambahan ZPT.
Waktu Kode
Morfologi Kalus
Formulasi Induksi Pembentukan Warna
Media Kalus kalus
(mg/L) (WIK) (%) Warna Kalus Tekstur Kalus
152A
per Hari
Hijau kecoklatan 152B
MS + N1 27 20 Remah/Friable
(152 D) 152C
tidak muncul
tidak 152D
MS + N0 0 Tidak muncul hanya
muncul
menggulung
Remah/Friable
putih kekuningan
MS + N12 26 100 dan
(150D) 151A
kompak
Hijau Kekuningan 151B
pekat dan hijau B
MS + N10 28 100 kecokelatan Remah/Friable 151C
(151 A dan 150 151D
C)
tidak muncul
tidak
MS + D1 0 tidak muncul hanya 150A
muncul
menggulung
kuning kecoklatan 150B
MS + D10 28 40 Kompak
(150 D)
kuning sedikit muncul 150C
Kontrol 35 20 kecokelatan ditepi,
(150 D) kompak 150D
Berdasarkan (Tabel 3) diatas, hasil yang diperoleh yaitu dari

7 perlakuan yang digunakan hanya 5 medium yang menghasilkan kalus
sedangkan 2 medium lainnya hanya menyebabkan eksplan menggulung
28
tanpa adanya pembentukan kalus. Waktu Induksi Kalus (WIK) adalah
waktu yang dibutuhkan eksplan untuk menginduksi kalus. Medium yang
menginduksi kalus dengan waktu induksi kalus paling cepat adalah medium
basal dengan penambahan ZPT MS + N 12 yaitu berhasil menginduksi kalus
selama 26 hari setelah penanaman eksplan dengan persentase pembentukan
kalus sebanyak 100 %. Medium lainnya seperti MS + N1 berhasil
menginduksi kalus 27 hari setelah penanaman eksplan dengan persentase
pembentukan kalus 20 %, medium MS + N10 dan MS + D10 berhasil
pembentukan kalus 100 % dan 40 %. Serta medium MS kontrol dapat
pembentukan kalus sebanyak 20 %.
Hasil tersebut menunjukkan bahwa, penambahan ZPT NAA dan 2,4-D
pada medium dapat merangsang pertumbuhan kalus. Penambahan Auksin
(NAA) dengan konsentrasi lebih rendah daripada Sitokinin (BA) dapat
menumbuhkan kalus lebih cepat dibandingkan dengan penambahan
konsentrasi auksin (NAA) dan sitokinin (BA) yang seimbang. Hal ini
disebabkan karena karakteristik hormon auksin endogen yang dapat
menstimulasi pembelahan sel batang, koleoptil, akar, buah dan bunga.
Pembelahan sel batang akan memicu pertumbuhan tunas dan biasanya
hormon auksin akan menyebabkan diferensiasi sel vaskular pada batang
yang memicu pertumbuhan tunas aksiler. Sedangkan karakteristik hormon
sitokinin endogen adalah menstimulasi pembelahan dan perkembangan sel,
memberikan stimulus akar dan batang agar dapat merespon perkembangan,
menstimulus perkembangan dan pembentangan sel pada daun dan kloroplas
serta mencegah penuaan pada tanaman selama proses kultur jaringan
(William and Noorman, 2008).
Konsentrasi ZPT sitokinin (BA) dan auksin (NAA) tersebut juga
dipengaruhi oleh zat pengatur tumbuh sintetik yang ditambahkan pada
media. Kedua hormon yang ada pada eksplan berupa hormon endogen dan
sintetik yang ditambahkan akan mempengaruhi respon pertumbuhan
eksplan membentuk kalus. Hormon sintetik yang ditambahkan akan
29
meningkatkan konsentrasi hormon endogen dalam sel, sehingga akan
menjadi faktor pemicu dalam proses tumbuh dan perkembangan jaringan
(Lestari, 2011).
Hormon sintetik auksin berupa NAA (Naphtalena Acetic Acid)
merangsang pembelahan sel, pembesaran, diferensiasi sel, dan aliran
protoplasma pada vegetatif tanaman terutama akar. Sedangkan hormon
sintetik BAP (Benzyladenine) berfungsi dalam proses regenerasi kultur in
vitro dan digunakan sebagai diferensiasi kalus membentuk organ (Muliati
dkk., 2017). Efektifitas penambahan ZPT auksin maupun sitokinin eksogen
bergantung pada konsentrasi hormon endogen dalam tanaman. Penambahan
konsentrasi auksin lebih rendah dapat memacu pertumbuhan kalus lebih
cepat sebab konsentrasi ini sesuai dengan hormon endogen yang ada dalam
sel eksplan daun tanaman cabe puyang (P. retrofractum Vahl.) sedangkan
konsentrasi lainnya seperti MS + N 1, MS + N10, MS + D10 dan kontrol tidak
merangsang pertumbuhan kalus lebih cepat dikarenakan pertumbuhan kalus
terhambat oleh hormon endogen dan eksogen yang terdapat pada eksplan.
Selain itu, kehabisan unsur hara dan air juga dapat terjadi . Hal ini dapat
terjadi karena unsur hara terhisap untuk pertumbuhan dan media dapat
menguapkan air. Ketika medium kehabisan hara, senyawa hasil
metabolisme akan menghambat pertumbuhan kalus itu sendiri (Indah dan
Ermavitalini, 2013).
Menurut Faramayuda dkk., (2016) dalam penelitian optimasi induksi
kalus tanaman cabe jawa (P. retrofractum Vahl.) konsentrasi variasi
penambahan ZPT pada medium basal (MS) yang paling optimum
menghasilkan kalus adalah ZPT 2,4-D : BAP (0,5ppm : 0,5ppm). Hasil
tersebut ditunjukkan dengan eksplan daun mulai menggulung pada minggu
ke-1 sedangkan kemunculan kalus terjadi pada minggu ke-3. Hasil ini
berbeda dengan penelitian yang dilakukan dengan medium optimal D 10 dan
N12. Hal tersebut bisa terjadi karena kandungan hormon endogen pada
eksplan kemungkinan dapat mempengaruhi respon eksplan membentuk
kalus ketika ditambahkan hormon eksogen dengan berbagai konsentrasi.
Selain itu, menurut penelitian Junairiah dkk., (2018) yang juga
30
menggunakan eksplan daun (Piper retrofractum Vahl), penambahan ZPT
NAA 0,5 mg/L dan BA 0,5 mg/L menghasilkan respon kalus paling cepat
yaitu selama 12 hari dan merupakan medium optimal sedangkan medium
optimal kedua adalah NAA 1mg/L dan BA 2mg/L yang dapat menghasilkan
kalus selama 13 hari.
(A) (B)
(C) (D)
Gambar 5. Perubahan Warna dan Tekstur Kalus, Keterangan:
Gambar (A) kalus berwarna kuning ditandai dengan inisiasi daun yang
menggulung serta beberapa kalus muncul dibagian tepi daun, warna (151 A)
hijau kekuningan; (B) kalus mulai terbentuk dibeberapa bagian perlukaan
dengan tekstur friabel atau remah, warna 150 D (Putih kekuningan); (C)
Kalus mulai tambah membengkak dan bertekstur remah, warna (152 D)
hijau kecokelatan; (D) kalus mengalami browning, kode warna N148A.
Selain pengamatan waktu induksi kalus dan persentase kalus, dilakukan

juga pengamatan warna dan tekstur pada kalus. Berdasarkan hasil (Tabel 4)
semua perlakuan medium yang digunakan, menghasilkan perbedaan warna
dan tekstur pada kalus. Pada medium dengan induksi kalus paling cepat (N 12)
31
menghasilkan kalus dengan warna putih kekuningan pada RHS colour chart
ditunjukkan dengan kode (150 D) dan tekstur kalus yang dihasilkan adalah
remah serta ada sebagian yang kompak. Selain itu, medium (N 1)
menghasilkan warna kalus hijau kecokelatan dengan kode (152 D) dan
tekstur remah/friable. Medium (N 10) menghasilkan warna kalus hijau
kekuningan pekat (Strong Grenish Yellow) dan kuning kecokelatan dengan
kode (151 A dan 150 C) dengan tekstur kalus remah/friable. Medium (D 10)
menghasilkan warna kalus kuning kecokelatan dengan kode (150D) dan
tekstur kalus kompak. Medium kontrol menghasilkan warna kalus kuning
kecokelatan dengan kode (150 D) dan tekstur kalus kompak di tepi daun
yang diberi perlukaan.
Warna dan tekstur kalus (pada tabel 4 dan gambar 5) yang dihasilkan,
bergantung terhadap respon pertumbuhan kalus akibat perlukaan yang
terjadi serta respon kalus berdasarkan penambahan zat pengatur tumbuh
pada medium yang digunakan. Warna dan tekstur kalus menggambarkan
kondisi visual sel-sel kalus sehingga dapat diketahui tingkat keaktifan
pembelahan sel-selnya. Semua perlakuan medium yang dilakukan,
kebanyakan menghasilkan warna kalus kuning kecokelatan atau putih
kecokelatan dibanding dengan warna kalus putih kehijauan atau kuning
kehijauan.
Menurut Fatmawati (2019), warna kalus menginduksi adanya
kandungan klorofil dalam jaringan kalus. Semakin hijau, maka semakin
banyak pula kandungan klorofil yang ada dalam jaringan tersebut. Hasil dari
penelitian ini kebanyakan berwarna putih kekuningan. Sedangkan menurut
Ariati dkk., (2012), warna putih pada kalus menandakan bahwa jaringan
embrionik pada kalus belum mengandung klorofil atau kloroplas, tetapi
mengandung butir pati yang merupakan polisakarida simpanan pada
tumbuhan. Semakin rendah konsentrasi ZPT yang ditambahkan dalam
media akan mempengaruhi kandungan klorofil dan karoten pada jaringan
kalus. Penurunan jumlah klorofil ini terjadi karena pengaruh ZPT pada
metabolisme karbohidrat. Selain itu, menurut Rasud dan Bustaman (2020),
perubahan warna kalus tersebut menunjukkan adanya perubahan fase
32
pertumbuhan pada sel, dari sel-sel muda yang aktif membelah (putih)
menjadi sel-sel dewasa mature (putih kekuningan)., kemudian berubah
menjadi cokelat yang menandakan bahwa massa sel menuju fase penuaan
(senescene).
Tekstur kalus adalah indikator pertumbuhan eksplan pada kultur in
vitro yang dapat digambarkan secara visual sehingga dapat digunakan untuk
mengetahui sel pada kalus masih aktif membelah atau telah mati. Tekstur
kalus yang paling banyak dihasilkan dalam penelitian ini adalah kompak
atau non friable terutama pada kalus dengan medium optimal seperti N 12
dan D10. Menurut Indah dkk., (2013), Kalus yang baik sebagai penghasil
senyawa metabolit sekunder adalah kalus dengan tekstur kompak (non
friable). Tekstur kalus yang kompak dianggap baik karena dapat
mengakumulasi metabolit sekunder lebih banyak.
Warna dan tekstur kalus dalam penelitian ini dari pertama muncul
hingga mengalami penuaan dapat dilihat pada (Gambar 5). Warna dan
tekstur kalus setelah dilakukan induksi adalah kuning yang menandakan
adanya klorofil dan eksplan menggulung (Gambar A). Kemudian saat fase
lag, terjadi pembelahan sel sehingga dibagian tepi daun yang diberi
perlukaan terlihat adanya butir-butir pati berwarna putih dan eksplan daun
membengkak (Gambar B). Setelah itu, tekstur kalus menjadi kompak dan
berwarna kuning/hijau kecokelatan menandakan klorofil atau kloroplas
semakin berkurang, sedangkan sel kalus masih mengalami pembelahan
yang terus meningkat dan butir pati masih terus bertambah (Gambar C),
Terakhir, kalus akan mengalami penuaan dengan warna kecokelatan atau
browning sehingga perlu dilakukan subkultur sebelum penuaan terjadi
(Gambar D).
Terkadang, dalam suatu proses kultur jaringan terjadi banyak kendala
dalam menghasilkan kalus salah satunya adalah browning. Browning atau
pencokelatan pada jaringan umumnya disebabkan oleh senyawa fenolik
yang biasanya muncul dan terakumulasi ketika eksplan dilukai, yang
biasanya disebabkan oleh aktivasi dari enzim polyphenol oxidase (PPO).
Pelukaan organ dapat menyebabkan terjadinya ketidakseimbangan
33
metabolisme dari ROS (Recative Oxygen Species), peroksidasi pada
membran lipid, dan kehilangan integritas membran sel yang dapat memicu
over akumulasi dari senyawa fenolik dan menyebabkan browning (Admojo
dan Indrianto, 2016). Selain itu, Golongan Piperaceae seperti cabe puyang
merupakan tanaman dengan senyawa fenolik tinggi sehingga tergolong
sebagai antioksidan (Jadid et al., 2018).
Gambar 6. Kenampakan kalus yang mengalami browning saat disubkultur

pada medium N12 yang sama dengan medium induksinya.
34
Tabel 4. Morfologi Kalus In vitro Daun Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.)
Usia Kalus (minggu)

No Perlakuan
1 2 3 4 5
1. Kontrol
150D
2. N1
152D
3. N0
35
4. N12
150D
5. N10
151A
6. D1
7. D10
150D
36
Berdasarkan hasil pengamatan keseluruhan medium diatas, dihasilkan medium
optimal pembentukan kalus sebagai berikut:
Gambar 7. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang setelah disubkultur pada

variasi media yang optimal N 12 selama 30 hari.
Pada (gambar 7) diatas, diketahui bahwa medium basal + Zat pengatur

tumbuh perlakuan N 12 adalah medium yang paling optimal mempengaruhi
pertumbuhan kalus. Waktu Induksi Kalus (WIK) pada medium ini adalah 26 hari
dengan morfologi kalus berwarna putih kekuningan, friabel atau remah serta
memiliki berat segar yang tinggi setelah medium D 10 dengan persentase
pembentukan kalus 100 %. Selain itu, medium optimal pertumbuhan kalus juga
37
terdapat pada medium basal (MS) dengan penambahan zat pengatur tumbuh
perlakuan D10 yang dapat diketahui hasil pertumbuhan kalusnya sebagai berikut:
Gambar 8. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang setelah disubkultur pada

variasi media yang optimal D 10 selama 30 hari.
Pertumbuhan kalus pada media basal MS + D 10 (gambar 8) juga optimal

sebab menghasilkan berat segar paling tinggi dengan persentase pertumbuhan kalus
sebanyak 40 %, tekstur kalus yang kompak serta waktu induksi kalus yang cepat
yaitu selama 28 hari.
38
2. Pengaruh variasi media dan ZPT terhadap kurva pertumbuhan kalus
tanaman cabe puyang (Piper retrofractum Vahl.) secara in vitro pada
generasi pertama (G 0)
Tabel 5. Bobot Segar Kalus Tanaman Cabe Puyang (P. retrofractrum Vahl.) pada
Hari ke-0 sampai minggu ke-5
Formulasi Berat Segar Kalus (minggu)
media H0 Minggu Minggu Minggu Minggu Minggu
(mg/l) 1 2 3 4 5
Kontrol 0,007±0,027a 0,004±0.039a 0,018±0.038a 0.015±0.041a 0,027±0.044a 0,029±0.059a
N1 0,008±0,015ab 0,005±0.024a 0,013±0.029a 0,015±0.032a0,0007±0.059a0,009±0.095a
N0 0,009±0,022ab 0,002±0.030a 0,017±0.036a 0,006±0.021b0,005±0.040a 0,030±0.098a
N12 0,013±0,035ab 0,021±0.066b 0,039±0.063ab 0,025±0.090a0,024±0.134ab 0,069±0.183a
N10 0,014±0,029b 0,013±0.029a 0,009±0.032a 0,002±0.032a0,0177±0.046a0,077±0.121a
D1 0,0006±0,003b 0,0008±0.016a 0,004±0.023a 0,025±0.047a 0,033±0.072a 0,059±0.104a
D10 0,0227±0,059c 0,029±0.067b 0,031±0.079b 0,010±0.094b 0,196±0.219b 0,369±2.773ab
Keterangan: notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan nyata signifikan pada

uji duncan yang dilakukan dengan taraf nyata 0,05 %.
Berdasarkan (Tabel 5) diatas, didapatkan hasil pengukuran rerata berat
segar pada hari ke-0 hingga minggu ke-5 pengamatan. Pengukuran berat segar
tersebut dilakukan dengan menimbang kalus menggunakan 3 ulangan dan
dianalisis menggunakan ANOVA dengan taraf nyata 0,05 % (pada lampiran
3 sampai 8). Rerata berat segar tertinggi dihasilkan pada medium dengan
perlakuan formulasi media D10 yaitu pada hari ke-0 menghasilkan berat segar
0,05997 g yang berbeda nyata dengan semua perlakuan medium. Pada minggu
pertama menghasilkan berat segar 0,06713 g yang tidak berbeda nyata dengan
medium N12. Pada minggu kedua menghasilkan 0,07963 g yang tidak berbeda
nyata juga dengan medium N 12. Pada minggu ketiga menghasilkan berat segar
0,09457 g yang tidak berbeda nyata dengan medium N 0. Pada minggu keempat
menghasilkan 0,21917 g yang tidak berbeda nyata dengan medium N 12 juga dan
pada minggu kelima menghasilkan 2,77367 g yang berbeda nyata dengan semua
perlakuan medium.
Dibandingkan dengan medium lainnya, medium ini menunjukkan
peningkatan pada berat segar yang diamati. Setelah medium D 10 hasil berat
segar tertinggi kedua adalah N 12. Pada hari ke-0 berat segar medium ini adalah
39
0,0357 g yang berbeda nyata dengan medium D 1 dan D10. Pada minggu pertama
berat segar kalus pada medium ini adalah 0,0664 gram yang tidak berbeda nyata
dengan perlakuan D 10 tetapi berbeda nyata dengan medium lainnya. Pada
minggu kedua berat segar medium ini adalah 0,063 g yang tidak berbeda nyata
dengan medium lainnya. Medium yang berat segar nya paling rendah adalah
perlakuan formulasi media D 1 dengan berat segar pada hari ke-0 sebesar
0,00323 g yang tidak berbeda nyata dengan medium kontrol, N 1 dan N0 dan
berbeda nyata dengan medium N 12, N10 dan D10. Pada minggu pertama berat
segar yang dihasilkan sebesar 0,01613 g yang tidak berbeda nyata dengan
perlakuan medium kontrol, N 1, N0, dan N10 dan berbeda nyata dengan medium
N12 dan D10. Pada minggu kedua, berat segar yang dihasilkan sebesar 0,023 g
yang tidak berbeda nyata dengan semua perlakuan medium kecuali perlakuan
medium D10. Media dengan penambahan ZPT D 1 menghasilkan berat segar
terendah sebab media ini tidak ditambahkan sitokinin sehingga efektivitas
pembentukan kalus rendah serta pembelahan sel eksplan membentuk kalus juga
rendah.
Pada penelitian ini, induksi kalus dari eksplan daun cabe puyang (P.
retrofractum Vahl.) dengan berbagai macam variasi ZPT yang digunakan pada
media menghasilkan berat segar yang berbeda-beda pada fase pertumbuhan
yang diamati. Berat segar tertinggi berada pada medium dengan penambahan
ZPT D10 (Tabel 5). Berat segar yang tinggi disebabkan karena kandungan air
dalam kalus tinggi. Penambahan auksin eksogen yang tinggi juga berpengaruh.
Hormon Auksin tersebut dapat merubah aktivitas enzim-enzim yang berperan
dalam sintesis komponen-komponen dinding sel yang utuh sehingga akan
berpengaruh terhadap berat sel (Abidin, 1990).
Menurut Junairiah dkk., (2018) dalam penelitian induksi kalus tanaman
Piper retrofractum Vahl. dengan zat pengatur tumbuh auksin (NAA) dan
sitokinin (BA) hasil perlakuan media yang menghasilkan kalus dengan berat
segar tertinggi adalah media dengan konsentrasi ZPT NAA 1,0 mg/L dan BA
0,5 mg/L. Sedangkan, pada penelitian Junairiah et al., (2019) tentang pengaruh
hormon IBA dan BAP pada Piper bettle media yang memiliki berat segar
tertinggi adalah media yang seimbang dengan penambahan ZPT IBA 1,5 mg/L
40
dan BAP 1,5 mg/L. Hasil berat segar yang tinggi pada masing-masing medium
berbeda disebabkan berat segar yang dihasilkan sangat bergantung pada
kecepatan sel-sel tersebut membelah diri, memperbanyak diri, dan dilanjutkan
dengan membesarnya kalus (Indria dkk., 2016).
Berat Segar Kalus

2,705
2,405
2,105
Berat Kalus (gram)
1,805
1,505
1,205
0,905
0,605
0,305
0,005
Hari Ke-0 Minggu 1 Minggu 2 Minggu 3 Minggu 4 Minggu 5
Umur Kalus (Minggu)

Kontrol N1 N0 N12 N10 D1 D10
Gambar 9. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.)

dengan Berat Segar Hari ke-0 hingga Minggu ke-5 menggunakan
Berbagai Variasi Perlakuan Media.
Kurva diatas merupakan suatu kurva hasil pertumbuhan kalus yang diperoleh
dari pengukuran berat segar kalus dari hari ke-0 hingga hari ke-35 atau dari hari
pertama induksi hingga minggu kelima induksi kalus. Pada kurva diatas, dapat
dilihat bahwa media basal + perlakuan ZPT D 10 menunjukkan laju pertumbuhan
tertinggi sampai minggu kelima. Kemudian diikuti oleh perlakuan D 1, N10, N12, N0
dan N1. Perlakuan yang menunjukkan laju pertumbuhan kalus tanaman cabe puyang
paling rendah adalah perlakuan kontrol.
Fase kalus tersebut adalah fase inisiasi kalus setelah induksi dalam media
dengan penambahan ZPT yang berbeda-beda. Fase kalus dalam kurva dihasilkan
dengan perhitungan berat segar yang dilakukan. Pada minggu ke-1 hingga minggu
ke-2 terlihat adanya peningkatan berat segar pada beberapa media. Media yang
tidak mengalami penambahan berat segar adalah N 1 dan kontrol (Gambar 9).
Minggu ke-1 sampai minggu ke-2 merupakan fase lag sebab kebanyakan pada umur
eksplan kalus belum terlihat dan respon eksplan daun hanya menggulung. Terdapat
41
lima fase pertumbuhan kalus menurut (Purnamaningsih dan Ashrina, 2011). Fase
pertama adalah fase lag yaitu fase persiapan pembelahan sel. Fase selanjutnya
adalah fase eksponensial yaitu fase dimana laju pembelahan sel mengalami
peningkatan. Fase ketiga adalah fase linier yaitu fase dari pembelahan sel mulai
melambat tetapi laju dari perkembangan sel meningkat. Fase keempat adalah fase
perlambatan dimana laju pembelahan sel dan pemanjangan sel menurun. Fase
terakhir adalah stationer dimana jumlah dan ukuran sel konstan atau stabil.
Berdasarkan (Gambar 9) tersebut semua perlakuan masih mengalami fase
eksponensial kecuali medium N 1 dan kontrol yang sudah menuju fase stationer.
Fase eksponensial menyebabkan sel mengalami peningkatan dalam pembelahan sel
sedangkan fase stationer menyebabkan sel sudah berhenti membelah.
Pertumbuhan kalus memerlukan daya penyerapan air yang berarti bahwa
suatu sel harus mempertahankan potensial airnya agar selalu negatif daripada
potensial air di sekitarnya. Pemberian hormon auksin pada pertumbuhan dapat
berpengaruh dalam perkembangan sel karena auksin dapat meningkatkan tekanan
osmotik sel, permeabilitas sel, sintesis protein, plastisitas dan pengembangan
dinding sel (Abidin, 1990). Pemberian auksin dapat menyebabkan sel penerima
mengeluarkan ion H+ kemudian menurunkan pH sehingga terjadi pengenduran
dinding sel dan pertumbuhan yang cepat. Diduga pH rendah yang dapat bekerja
dalam mengaktifkan suatu kerja enzim perusak dinding sel tertentu, sehingga
memutuskan ikatan polisakarida pada medium dan menyebabkan dinding sel
merenggang (Salisbury dan Ross, 1995).
Menurut Wattimena (1991) Sitokinin yang ditambahkan berperan dalam
pembelahan dan sintesis protein. Pemacuan pembelahan sel dan sintesis protein
oleh kinetin menyebabkan sel berproliferasi akibatnya volume bertambah sehingga
menyebabkan bertambahnya berat kalus yang dihasilkan. Adanya penambahan
hormon NAA/2,4-D dan Sitokinin dapat digunakan sebagai sumber tenaga dalam
pertumbuhan kalus. Selain itu, terdapat gen yang dapat mengatur perubahan pola
pertumbuhan sehingga proses proliferasi sel dan morfogenesisnya dapat berjalan.
Seperti gen-gen yang mengatur konsentrasi yang efektif dari zat-zat yang dapat
mendirong pertumbuhan.
42
Pemberian variasi konsentrasi NAA, 2,4-D dan BAP menghasilkan laju
pertumbuhan kalus yang berbeda nyata pada uji DMRT 5 %. Laju pertumbuhan
tertinggi terdapat pada media D 10 (2,4 1mg/L dan BA 0,5mg/L). Proses berhasilnya
pembentukan kalus dipengaruhi oleh beberapa faktor contohnya medium yang
digunakan, regulasi pertumbuhan, kandungan metabolit pada eksplan serta
lingkungan. Proses berhasilnya kultur eksplan menjadi kalus yang paling utama
adalah pengaruh dari konsentrasi regulasi pertumbuhan atau hormon yang
digunakan pada suatu medium (Shi and Yang, 2014). Auksin, Sitokinin dan
Giberelin adalah beberapa hormon yang mempengaruhi kultur jaringan. Salah satu
hormon auksin sintesis adalah 2,4-D dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Hormon
2,4-D ini memiliki manfaat dalam induksi kalus. Pembentukan kalus akan menjadi
efektif apabila hormon 2,4-D ditambahkan dengan hormon sitokinin yang lain
seperti BAP (Sari et al., 2018). Laju pertumbuhan kalus paling rendah ada pada
medium kontrol dan NAA 1mg/L tanpa BAP disebabkan karena medium tanpa
hormon tidak dapat menginduksi kalus secara optimal serta medium dengan
konsentrasi Auksin saja tanpa Sitokinin dapat menyebabkan kalus yang dihasilkan
kurang optimal walaupun dapat merespon pertumbuhan eksplan yang berasal dari
akar, batang, kotiledon dan tunas.
Tabel 6. Rerata Berat Kering Kalus Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum
Vahl.) Minggu Ke-5 dengan Berbagai Variasi Media
Rerata Berat
Perlakuan Kering
Minggu ke-5
Kontrol 0,019±0.01967a
N1 0,006±0.02317a
N0 0,003±0.019a
N12 0,026±0.04593a
N10 0,024±0.03587a
D1 0,014±0.03587a
D10 0,067±0.3325b
43
Selain berat segar kalus, juga dilakukan pengukuran berat kering kalus pada
hari ke-35 atau minggu ke-5. Pengukuran berat kering ini dilakukan untuk proses
selanjutnya yaitu ekstraksi dan uji metabolit sekunder dari kalus. Berdasarkan
pengukuran tersebut, diperoleh hasil berat kering kalus tertinggi pada tanaman cabe
puyang (Piper retrofractum Vahl.) sebesar 0,3325 g yang terdapat pada perlakuan
medium basal + D10 dan berbeda nyata dengan perlakuan medium yang lainnya.
Kemudian dilanjutkan perlakuan medium N12 dengan berat kering sebesar 0,04593
g, lalu perlakuan medium N 10., D1., kontrol, N1, dan yang paling rendah adalah N0
dengan berat kering sebesar 0,019 g. Adanya hasil berat kering tersebut
menunjukkan bahwa biomassa yang dihasilkan sejalan dengan laju pertumbuhan
kalus pada beberapa konsentrasi yang digunakan. Berat basah pada perlakuan
minggu terakhir atau minggu ke-5 tidak menunjukkan beda nyata antar perlakuan
kecuali pada perlakuan D 10 (Tabel 5) begitu juga pada laju pertumbuhan
(Gambar 9) dan hasil berat kering diatas (Tabel 6), hal ini dimungkinkan karena
kalus yang diperoleh setelah perlakuan lebih banyak mengandung air. Sehingga
pada proses pengeringan, air akan menguap dam mempengaruhi berat kering kalus.
Berdasarkan penelitian Junairiah dkk., (2018), diketahui bahwa hasil berat
segar yang tinggi tidak selalu menghasilkan berat kering yang tinggi pula.
Berdasarkan hasil penelitian ini, berat segar tertinggi terdapat pada kombinasi
konsentrasi NAA 1,0 mg/L dan BAP 0,5 mg/L sedangkan berat kering tertinggi
justru terdapat pada kombinasi konsentrasi NAA 1,0 mg/L dan BAP 2,0 mg/L
dengan rerata berat kering 18,00 mg. Hal ini berbeda dengan hasil penelitian yang
dilakukan yaitu berat segar yang tinggi mempengaruhi berat kering yang tinggi juga
pada sehingga hasil penelitian ini berat segar dan berat kering tertinggi yang
dihasilkan ada pada medium yang sama yaitu D 10 dan diikuti dengan medium
lainnya seperti N 12, N10, D1, N1, N0 dan kontrol. Perbedaan hasil tersebut
dikarenakan tiap sel memiliki kemampuan absorbansi air yang berbeda. Kalus yang
memiliki berat segar yang tinggi terdapat sel-sel yang mengandung banyak air
karena berat segar masih dipengaruhi oleh aktivitas metabolisme dan lingkungan
(Wardani et al., 2004). Sedangkan berat kering yang jauh lebih kecil disebabkan
karena saat pengeringan, air di dalam sel akan menguap habis sehingga berat kering
yang dihasilkan rendah (Sitompul dan Guritno, 1995).
44
3. Profil metabolit sekunder pada fase pertumbahan eksponensial
generasi pertama (G 0 ) kalus tanaman cabe puyang medium optimal
dibandingkan dengan daun ex vitro tanaman cabe puyang
Proses ekstraksi kalus dan daun ex vitro tanaman Cabe Puyang (Piper
retrofractum Vahl.) dilakukan dengan metode maserasi. Metode maserasi adalah
metode ekstraksi dingin karena tidak menggunakan pemanasan seperti metode
sokhletasi. Kalus berumur 35 hari dan daun ex vitro ditimbang kemudian
dikeringkan dengan oven untuk memperoleh berat kering. Setelah itu, kalus
ditumbuk menggunakan mortar dan alu kemudian direndam dalam konikel tube
menggunakan pelarut ethanol absolute untuk variasi medium D 10 dan methanol
untuk variasi medium N 12 sedangkan daun ex vitro direndam dalam pelarut
kloroform, ethanol dan methanol sebagai pembanding. Pelarut yang digunakan
tersebut disesuaikan dengan berat kering kalus dan daun yaitu menggunakan
perbandingan (1:10). Berat kalus yang dihasilkan pada media N 12 adalah 0,55 g
sehingga pelarut methanol yang digunakan adalah 5,5 mL sedangkan berat kalus
pada media D10 adalah 1,0992 g sehingga pelarut ethanol yang digunakan adalah
10mL. Pada daun ex vitro berat kering yang dihasilkan adalah 1,3221 g sehingga
pelarut kloroform yang digunakan adalah 13 mL. Perendaman sampel dengan
pelarut dilakukan selama 24 jam dan dihasilkan ekstrak kental. Hasil ekstrak kental
kemudian diuapkan pada lemari maserasi. Berikut adalah hasil ekstraksi dengan
maserasi:
(A) (B) (C)
Gambar 10. Ekstrak Daun ex vitro dan Kalus Tanaman Cabe Puyang
(P. retrofractum Vahl.) dengan berbagai pelarut. Gambar A
adalah hasil ekstrak daun ex vitro pelarut kloroform (A), hasil
ekstrak kalus daun ex vitro pelarut ethanol absolute dan methanol
(B), hasil ekstrak kalus pelarut ethanol absolute (C).
45
Berdasarkan penelitian Faramayuda et al., (2016), ekstraksi kalus cabe puyang
(Piper retrofractum Vahl.) dengan maserasi menggunakan pelarut bertingkat
seperti n-heksan, etil asetat dan ethanol absolute. n-heksan adalah senyawa untuk
menarik senyawa non polar, etil asetat untuk menarik senyawa yang lebih bersifat
semi polar dan ethanol absolute untuk menarik senyawa yang lebih bersifat polar.
Selain itu, pada penelitian Hikmawanti et al., (2016), dijelaskan bahwa ekstraksi
buah cabe jawa dan buah lada hitam menggunakan pelarut 95 % ethanol absolute
karena sifatnya yang mampu menarik senyawa bioaktif seperti Tannin, Polifenol,
Flavonol, Terpenoid dan Alkaloid termasuk piperine.
Selain metode ekstraksi dengan maserasi, dilakukan metode ekstraksi sonikasi
agar pelarut dan ekstrak kental dapat terpisah dengan baik. Metode sonikasi
dilakukan dengan gelombang ultrasonik (Ultrasonik water bath) atau metode
sonikasi tidak langsung menggunakan medium air. Metode sonikasi ini disebut
tidak langsung karena tidak bersentuhan langsung dengan larutan yang diekstraksi.
Gelombang ultrasonik adalah gelombang suara yang memiliki frekuensi diatas
pendengan manusia (≥ 20 kHz). Metode ekstraksi ini digunakan untuk memperoleh
kandungan antioksidan yang lebih tinggi dengan waktu yang relatif singkat. Dengan
bantuan ultrasonik, proses ekstraksi senyawa organik tanaman dengan
menggunakan pelarut organik dapat berlangsung lebih cepat, dinding sel dari bahan
dipecah dengan getaran ultrasonik sehingga kandungan metabolit yang ada
didalamnya dapat keluar dengan mudah (Sholihah et al., 2017).
Analisis uji metabolit sekunder dilakukan dengan metode Kromatografi Lapis
Tipis (KLT). Metode ini menjadi pilihan dalam uji metabolit sekunder karena dapat
memberikan resolusi pemisahan yang baik sehingga memungkinkan identifikasi
simultan dari berbagai zat dalam sekali elusi. Profil sidik jari KLT dapat digunakan
untuk mengetahui ada atau tidaknya senyawa fitokimia tertentu.
46
Berikut adalah hasil uji metabolit sekunder alkaloid, flavonoid dan
terpenoid dengan berbagai eluen yang telah dilakukan:
1. Uji Alkaloid
a. Jenis eluen ; Etil asetat : Toluena (1 : 1) dalam 10 mL larutan

• Sampel: ekstrak ethanol absolute kalus (media 2,4-D10)
dan larutan standar Piperine.
Gambar 11. Uji Alkaloid ekstrak Ethanol Absolute kalus (A dan B) Tanaman
Cabe Puyang (P. retrofractum Vahl.) dan larutan standar piperine
(C) disertai Gambar Diagram Bercak Noda pada (1) Visible/cahaya
tampak sebelum disemprot; (2) UV 254 nm sebelum disemprot; (3)
UV 366 nm sebelum disemprot; (4) Visible/cahaya tampak sesudah
disemprot; (5) penampak bercak pada UV 254 nm sesudah
disemprot; (6) penampak bercak UV 366 nm sesudah disemprot.
47
• Sampel: Ekstrak kloroform daun ex vitro cabai puyang
dengan larutan standar Piperine
Gambar 12. Uji Alkaloid ekstrak kloroform daun ex vitro (A dan B) Tanaman
Cabe Puyang (P. retrofractum Vahl.) serta larutan standar piperine
(C) disertai Gambar Diagram Bercak Noda pada (1) Visible/cahaya
disemprot; (5) penampak bercak pada UV 254 nm sesudah disemprot;
(6) penampak bercak UV 366 nm sesudah disemprot.
48
Berdasarkan uji alkaloid yang telah dilakukan, dihasilkan nilai Rf pada noda
yang tampak setelah diamati melalui UV 254 nm maupun UV 366 nm:
Tabel 7. Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Piperine dan Golongan Alkaloid lainnya
dengan Sampel Ekstrak kalus dan daun ex vitro tanaman cabe puyang
(Piper retrofractum Vahl.) menggunakan eluen toluena : etil asetat (1 : 1)
Sinar UV Keberadaan
No Ekstrak Rf Pereaksi
tampak 254 nm 366 nm Senyawa
1. Kalus Noda Tidak Fluoresensi A= Dragendroff +
dengan Tidak tampak merah 0,975
pelarut tampak muda dan 0,5
ethanol biru muda 0,3375
absolute, 0,0875
ulangan 1 Larutan
(K1) dan standar: B=
ulangan 2 fluoresensi 0,975
(K2) biru muda 0,6125
0,3125
0,6
Piperine=
0,6
2. Daun ex Noda Noda Fluoresensi A= Dragendroff +
vitro Merah 0,95
dengan Hijau Biru terang dan 0,7625
pelarut dan dan coklat, 0,7125
kloroform kuning Kuning Larutan 0,5875
ulangan 1 standar: 0,0875
(D1) dan biru muda
ulangan 2 B=
(D2) 0,9625
0,7625
0,6875
0,5625
0,075
Piperine=
0,55
Alkaloid merupakan senyawa yang mengandung nitrogen pada tumbuhan

dan memiliki efek fisiologi terhadap hewan maupun manusia. Kandungan
Alkaloid pada tumbuhan digunakan sebagai senyawa cadangan yang mampu
memasok nitrogen dan melindungi tanaman dari serangan mikroorganisme
serta virus. Senyawa alkaloid yang banyak ditemukan pada tumbuhan
golongan Piperaceae adalah Alkaloid Piperidina yang terdiri atas L-Lisin.
kelompok ekstra metiilen pada lisin menunjukkan bahwa asam amino
49
berpartisipasi dalam membentuk cincin enam atom karbon pada cincin
piperidina (Nugroho, 2017).
Berdasarkan uji metabolit sekunder yang dihasilkan, larutan standar
pembanding golongan Alkaloid yang digunakan adalah Piperine Merck 8.
21036.0010 for synthesis. Hasil uji metabolit sekunder golongan Alkaloid
yang telah dilakukan dengan eluen toluena dan etil asetat sebagai fase gerak
adalah positif Alkaloid pada kalus ekstrak ethanol dengan nilai Rf 0,975.,
0,6125., 0,3125., 0,3375., 0,875 (Tabel 8). Hasil nilai Rf yang menunjukkan
adanya senyawa Piperine adalah 0,6125 dan sejajar dengan nilai Rf larutan
standar yang digunakan yaitu sebesar 0,6. Sehingga pada penelitian ini kalus
tanaman Cabe Puyang positif mengandung metabolit sekunder Piperine.
Selain itu, hasil uji metabolit sekunder dengan eluen n-heksan dan etil asetat
menghasilkan nilai Rf kalus 0,225 dan 0,1875, nilai Rf daun ekstrak
kloroform yang sejajar dengan piperine 0,0875 dan nilai Rf larutan standar
0,0875.
Menurut penelitian Hikmawanti dkk., (2021) nilai Rf baku piperine pada
ekstrak buah cabe jawa dari masing-masing daerah adalah 0,592. Sedangkan
menurut penelitian Febriyanti dan Iswarin, (2018). Rf senyawa piperine pada
ekstrak buah cabe jawa adalah 0,49 dengan Rf larutan standar 0,5. Selain itu,
noda senyawa piperine yang diamati menghasilkan warna biru gelap dibawah
sinar UV 365 nm.
Noda bercak pada penelitian yang dilakukan juga dapat menunjukkan hasil
positif pada uji metabolit sekunder dengan metode KLT yang dilakukan.
Hasil bercak noda ekstrak kalus pada penelitian ini dengan eluen toluena dan
etil asetat hanya dapat terlihat pada UV 366 nm dengan fluoresensi warna
biru muda yang sama dengan larutan standarnya. Sedangkan noda bercak
ekstrak daun ex vitro menghasilkan warna hijau, kuning dan biru pada sinar
tampak. Selain itu, juga menghasilkan noda bercak kuning, biru dan hijau
pada UV 245 nm serta noda bercak merah terang dan cokelat pada UV 366
nm. Hasil senyawa piperin pada ekstrak daun ex vitro dapat terlihat hanya
pada sinar UV 254 nm sedangkan noda bercak lainnya menunjukkan senyawa
alkaloid yang lainnya. Pada eluen yang lain seperti n-heksan : etil asetat ( 7 :
50
3) dihasilkan noda bercak yang berbeda sebelum dan sesudah disemprot
pereaksi Dragendroff. Sebelum disemprot Dragendroff, bercak noda pada
ekstrak daun ex vitro menunjukkan warna hijau, cokelat dan kuning pada
sinar tampak., sedangkan pada sinar UV 254 nm menghasilkan warna cokelat,
biru dan kuning., selain itu pda UV 366 nm menunjukkan noda berwarna
merah muda, merah dan cokelat. Sesudah disemprot ekstrak daun berubah
menjadi cokelat dan kuning pada UV 254 nm dan berwarna cokelat tua serta
merah muda pada UV 366 nm. Pada ekstrak kalus sebelum disemprot larutan
Dragendroff pada UV 366 nm menghasilkan fluoresensi biru muda tetapi saat
sesudah disemprot tidak menghasilkan bercak noda. Ekstrak kalus juga positif
Alkaloid sebab menghasilkan noda biru muda yang sama dengan larutan
standar piperine yang digunakan.
51
2. Uji Flavonoid
a. Jenis eluen; n-hexane : etil asetat : Asam formiat (6 : 4 : 0,1)

dalam 10 mL larutan
• Sampel: Ekstrak kalus dan daun ex vitro tanaman Cabe
puyang dengan larutan standar Quersetin.
Gambar 13. Uji Flavonoid Ekstrak Methanol Kalus (A) dan Ethanol Absolute
Kalus (B) serta Ekstrak Daun ex vitro Tanaman Cabe Puyang (Piper
retrofractum Vahl.) (C) dengan larutan s tandar Quersetine (D)
disertai Gambar Diagram Bercak Noda pada (1) Visible/cahaya
52
• Sampel : Ekstrak kloroform dan ethanol absolute pada
daun ex vitro
Gambar 14. Uji Flavonoid Ekstrak Kloroform (A) dan Ethanol Absolute (B) Daun
Ex Vitro Tanaman Cabe Puyang (P. retrofractum Vahl.) dengan
Larutan Standar Quersetin (C) disertai Gambar Diagram Bercak Noda
pada (1) Visible/cahaya tampak sebelum disemprot; (2) UV 254 nm
sebelum disemprot; (3) UV 366 nm sebelum disemprot; (4)
Visible/cahaya tampak sesudah disemprot; (5) penampak bercak pada
UV 254 nm sesudah disemprot; (6) penampak bercak UV 366 nm
sesudah disemprot.
53
Tabel 8. Hasil Perhitungan Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Golongan Flavonoid
dengan Sampel Ekstrak Kalus dan Daun Ex Vitro Tanaman Cabe Puyang
(Piper retrofractum Vahl.) menggunakan eluen n-hexane : etil asetat :
Asam formiat (6 : 4 : 0,1)
No Ekstrak Sinar UV Rf Pereak Keberadaan
Tampak 254 366 si Senyawa
1. Kalus Kalus (A Kalus Kalus A= Sitro- +
dan dan B)= (A dan (A dan 0,4 borat
Daun Tidak B)= B)=
Ex Tampak Tidak Noda B=
Vitro tampak fluoresen- 0,3
Daun ex si biru 0,4
vitro (C)= Daun ex
Berwarna vitro Daun ex C=
biru, (C)= vitro 0,3067
hijau, abu- noda (C)= 0,3733
abu dan tampak Noda 0,48
kuning. berwarna fluoresen- 0,653
kuning, si merah 0,76
Larutan jingga, muda, 0,8933
Standar cokelat merah tua,
Piperine dan biru dan D=
(D)= muda cokelat. 0,3733
-Sblm
disemprot: Larutan Larutan
Kuning Standar Standar
(D)= (D)=
- Sesudah Sblm Sebelum
disemprot: disemprotdisemprot
Cokelat - kuning fluoresen-
sesudah si cokelat.
disemprotsesudah
-cokelat disemprot
tua. fluoresen-
si kuning
2. Daun Daun Daun Daun A= Sitro- +
ex vitro (A)= (A)= (A)= 0,35 borat
Klor. Sebelum= Sebelum Sebelum 0,4875
(A) Berwarna = = 0,7125
Daun hijau dan hijau dan Fluoresen 0,8375
ex vitro kuning. kuning si merah 0,9125
E. Sesudah= muda dan
abso- Berwarna Sesudah= cokelat. B=
lute kuning Berwarna 0,3
(B) dan kuning Sesudah= 0,425
cokelat. dan Fluoresen 0,8125
cokelat si merah, 0,875
Daun cokelat 0,925
(B)= Daun dan
Sebelum= (B)= merah C=
0,375
muda.
54
Hijau, Sebelum
biru dan = Daun
kuning. (B)=
Sesudah= Hijau, Sebelum
Kuning biru dan =
dan biru kuning. Sebelum
Sesudah= =Fluorese
Larutan Kuning nsi merah
Standar dan biru muda
(C): Sesudah=
Sebelum Larutan Fluoresen
disem- standar si merah
prot= (C)= muda.
kuning Sebelum
disem- Larutan
Sesudah prot= Standar
disem- kuning (C)=
prot= Sebelum:
cokelat Sesudah Kuning
disem-
prot= Sesudah:
cokelat Cokelat
Diketahui bahwa hasil penelitian uji metabolit sekunder Flavonoid yang

dilakukan dengan berbagai eluen seperti n-heksan : Asam formiat : etil setat (6:
4 : 0,1) ., eluen etil asetat : tolena (1 : 1) dan n-heksan : etil asetat (7:3)
menghasilkan warna bercak noda yang berbeda beserta nilai Rf yang berbeda
pula. Ekstrak kalus pada eluen n-heksan : Asam formiat : etil setat (6: 4 : 0,1)
tidak menghasilkan bercak noda pada sinar tampak, tetapi menghasilkan bercak
noda berwarna biru tua pada UV 254 nm dan bercak biru muda pada UV 366
nm. Sedangkan, ekstrak daun ex vitro pada eluen yang sama menghasilkan
bercak noda kuning, hijau dan biru pada sinar tampak dan UV 254 nm sedangkan
pada UV 366 nm menghasilkan bercak noda berwarna merah dan cokelat.
Larutan standar yang digunakan dalah Quersetin dengan warna bercak noda
kuning sebelum disemprot dan bercak noda cokelat setelah disemprot dengan
reagen Sitroborat. Hasil bercak noda pada kalus dan daun ex vitro menunjukkan
hasil positif. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Faramayuda dkk., (2016)
yang menyatakan bahwa adanya senyawa flavonoid pada semua ekstrak kalus
dan eksplan cabe jawa ditunjukkan dengan memancarkan warna lebih terang
pada UV 366 nm setelah disemprot dengan Sitroborat.
55
Selain penampak bercak noda yang dihasilkan, uji metabolit sekunder juga
menghasilkan nilai Rf. Nilai Rf hasil uji metabolit golongan Flavonoid dengan
menggunakan eluen n-heksan : Asam formiat : etil setat (6: 4 : 0,1) adalah 0,373
pada ekstrak kalus dan daun ex vitro yang sama dengan larutan standar Quersetin.
Nilai Rf yang sama dihasilkan karena standar Quersetin sejajar dengan noda
bercak kalus dan daun ex vitro. Selain itu, nilai Rf bercak yang lain pada ekstrak
adalah 0,4., 0,3733., 0,48., 0,653., 0,76 dan 0,8933. Nilai Rf yang beragam
menunjukkan bahwa senyawa golongan Flavonoid lainnya juga terdeteksi pada
uji metabolit sekunder yang dilakukan. Hal ini sesuai dengan Ihsan et al., (2019)
tentang validasi analisis Quersetin pada ekstrak produk jamu, yaitu nilai Rf yang
sejajar dengan Quersetin adalah 0,32 pada fase gerak (kloroform : aseton : asam
format 10:2:1) serta nilai Rf lainnya 0,42 pada fase gerak (kloroform : aseton :
metanol : asam format 28:9:2:1).
Berbeda dengan hasil eluen n-heksan : Asam formiat : etil setat (6: 4 : 0,1),
warna bercak noda ekstrak kalus dengan eluen etil asetat : tolena (1 : 1) pada UV
366 nm adalah merah muda dan biru sehingga hasil uji metabolit sekunder positif.
sedangkan pada ekstrak daun menghasilkan noda yang sama berwarna kuning,
biru dan hijau. Nilai Rf dengan fase gerak etil asetat : toluena (1 :1) adalah 0,4
yang sejajar dengan larutan standar Quersetin sedangkan nilai Rf yang lain
adalah 0,92 dan 0,65 pada ekstrak kalus serta 0,9875., 0,78., 0,075., 1 dan 0,1
pada ekstrak daun ex vitro.
Eluen atau fase gerak lainnya yang digunakan untuk analisis senyawa
golongan Flavonoid adalah n-heksan : etil asetat (7:3) yang menghasilkan warna
bercak noda biru muda pada ekstrak kalus pada UV 366 nm dan warna bercak
noda kuning, abu-abu, cokelat dan biru pada UV 254 nm dan visual sedangkan
pada UV 366 nm menghasilkan fluoresensi merah terang dan cokelat. Hasil Rf
dengan fase gerak ini adalah 0,2 yang sejajar dengan larutan standar Quersetin
sedangkan hasil Rf lainnya adalah 0,1125., 0,325., 0,425., 0,5., 0,725 dan 0,9275
pada ekstrak daun ex vitro sedangkan pada ekstrak kalus 0,935., 0,6 dan 0,8.
Hasil Rf yang tidak sama dengan Quersetin menunjukkan bahwa ekstrak kalus
dan daun ex vitro tanaman cabe puyang menghasilkan senyawa Flavonoid jenis
lainnya.
56
3. Uji Terpenoid
- Eluen: Toluena : Etil Asetat (9,3 : 0,7) dengan Larutan Standar

Linalool
• Sampel: Ekstrak kloroform dan ethanol absolute daun
ex vitro serta Ekstrak ethanol absolute kalus
Gambar 15. Uji Terpenoid Ekstrak Kloroform (A) dan Ethanol Absolute (B) Daun
Ex Vitro serta Ekstrak Ethanol Absolute Kalus (C) Tanaman Cabe
Puyang (Piper retrofractum Vahl.) dengan Larutan Standar Linalool
(D) disertai Gambar Diagram Bercak Noda pada (1) Visible/cahaya
57
Tabel 9. Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Golongan Terpenoid dengan Sampel
Ekstrak kalus dan daun ex vitro tanaman cabe puyang (Piper
retrofractum Vahl.) menggunakan eluen Toluena : etil asetat (9,3:0,7)
dengan larutan standar Linalool.
Sinar UV Keberadaan
1. Ekstrak A= A= A= A= Vanillin +
kloroform Kuning, Kuning, Fluoresensi
Asam
0,1125
daun ex cokelat cokelat merah, Sulfat
vitro (A) dan hijau dan biru. cokelat dan 0,225
ekstrak merah
0,325
ethanol muda, dan
absolute B= B= ungu. 0,425
daun ex
Noda Noda 0,55
vitro (B)
tidak tidak
dan B= 0,725
tampak tampak
ethanol
Fluoresensi
absolute 0,9375
merah dan
kalus (C) C= C= merah B=
muda.
Larutan Noda Noda 0,2
Standar tidak tidak
Linalool tampak tampak 0,975
C=
(D)
0,6
Tidak
Larutan Larutan tampak. 0,8
Standar= Standar=
Tidak Tidak
Larutan
tampak tampak
Standar=
Tidak
tampak
58
- Eluen: = Toluena : Etil Asetat (9,3 : 0,7) dengan Larutan Standar
Cajuput
• Sampel : Ekstrak Kloroform daun ex vitro dan LS
Gambar 16. Uji Terpenoid Ekstrak Kloroform Daun Ex Vitro (A) dengan Larutan
Standar Cajuput (B) disertai Gambar Diagram Bercak Noda pada (1)
Visible/cahaya tampak sebelum disemprot; (2) UV 254 nm sebelum
disemprot; (3) UV 366 nm sebelum disemprot; (4) Visible/cahaya
tampak sesudah disemprot; (5) penampak bercak pada UV 254 nm
sesudah disemprot; (6) penampak bercak UV 366 nm sesudah
disemprot.
59
• Sampel : Ekstrak Kloroform daun ex vitro dan kalus
tanaman cabe puyang dengan larutan standar Cajuput
Gambar 17. Uji Terpenoid Ekstrak Kloroform (A) dan Ethanol Absolute (B) Daun
Ex Vitro ekstrak ethanol absolute kalus (C) Tanaman Cabe Puyang
(Piper retrofractum Vahl.) serta dengan Larutan Standar Cajuput (D)
disertai Gambar Diagram Bercak Noda pada (1) Visible/cahaya
disemprot; (5) penampak bercak pada UV 254 nm sesudah
disemprot; (6) penampak bercak UV 366 nm sesudah disemprot.
60
Tabel 10. Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Golongan Terpenoid dengan Sampel
Ekstrak kalus dan daun ex vitro tanaman cabe puyang (Piper
retrofractum Vahl.) menggunakan eluen Toluena : etil asetat (9,3:0,7)
dengan larutan standar Cajuput.
Sinar UV Keberadaan
1. Ekstrak A= A= A= A= Vanilin +
kloroform Noda Noda Fluoresensi 0,075 Asam
daun ex tampak tampak merah muda, 0,1875 Sulfat
vitro berwarna berwarna merah,ungu 0,325
dengan abu-abu, kuning, dan cokelat 0,425
larutan kuning, cokelat 0,475
standar hijau. dan biru. B=
Cajuput. Fluoresensi B=
B= B= putih. 0,45
Noda Noda
Tidak tampak
tampak ungu
2. Daun A= A= A= A= Vanilin +
pelarut Noda Noda Fluoresensi 0,05 Asam
Kloroform tampak tampak cokelat dan 0,1375 Sulfat
(A), berwarna berwarna merah muda. 0,2625
daun kuning dan kuning dan 0,3375
pelarut abu-abu. abu-abu. B= 0,3875
ethanol Fluoresensi
absolute B= B= merah muda. B=
(B), Noda Noda 0,2625
tampak tampak C= 0,1375
Kalus Fluoresensi
pelarut berwarna berwarna 0,325
kuning kuning biru dan
ethanol merah muda. C=
absolute C= C= 0,15
(C) Noda tidak noda tidak D= 0,3375
dan larutan tampak tampak fluoresensi
standar putih. D=
cajuput D= D= 0,325
(D). Noda tidak noda
tampak tampak
berwarna
ungu
muda.
61
Terpenoid menurut Nugroho (2017), merupakan kelompok senyawa yang terbagi
atas metabolit primer dan metabolit sekunder. Senyawa metabolit primer yang
termasuk metabolit primer adalah (sterol, karotenoid, zat pengatur tumbuh dan
subtituen poliprenol dan dolichols serta protein), sedangkan metabolit sekunder
terdiri atas (monoterpen, seskuiterpen, diterpenes, dan triterpen).
Pada penelitian ini digunakan Linalool sebagai larutan standar. Linalool
termasuk monoterpenes yang diklasifikasikan berdasarkan tingkat oksidasinya dari
alkohol sehingga disebut monoterpenes alkohol. Selain itu juga digunakan Cajuput.
Nama lain Cajuput adalah Minyak kayu putih yang merupakan salah satu minyak
atsiri yang diperoleh dari hasil penyulingan daun kayu putih. Komponen utama dari
minyak kayu putih merupakan golongan terpenoid. Komponen terbesarnya
merupakan 1,8-sineol yang merupakan monoterpena (Batubara dkk., 2016).
Pada penelitian uji golongan senyawa terpenoid dilakukan dengan fase gerak
toluen : etil asetat (9,3 : 0,7) dengan larutan standar Linalool menghasilkan bercak
sebelum dan sesudah disemprot reagen Vanilin Asam Sulfat adalah sama. Bercak
noda yang dihasilkan kuning cokelat dan biru pada visual dan kuning pada ekstrak
daun ex vitro, biru dan cokelat pada ekstrak daun ex vitro dengan UV 254 nm serta
warna bercak noda ungu, merah terang, merah muda dan cokelat pada UV 366 nm.
Sedangkan pada ekstrak kalus tidak tampak pada visual dan 254 nm, sedangkan
pada UV 366 nm menghasilkan fluoresensi biru muda dan merah muda. Hasil Rf
pada ekstrak daun dan kalus yang sejajar dengan larutan standar Linalool adalah
0,2 sehingga kedua ekstrak mengandung metabolit sekunder terpenoid jenis
senyawa Linalool.
Selain itu, dilakukan uji golongan senyawa terpenoid lainnya dengan fase gerak
yang sama tetapi larutan standar yang digunakan adalah Cajuput atau ekstrak
minyak kayu putih. Hasil bercak noda yang tampak sebelum disemprot vanilin
asam sulfat pada larutan standar adalah tidak tampak pada visual sedangkan
sesudah disemprot tampak berwarna ungu di UV 254 nm sedangkan pada UV 366
nm berfluoresensi putih. Hasil bercak ekstrak daun berwarna kuning, abu-abu dan
hijau pada visual dan 254 nm sedangkan pada UV 366 nm menghasilkan fluoresensi
merah muda, cokelat dan ungu. Pada ekstrak kalus dihasilkan fluoresensi merah
muda dan biru. Hasil Rf yang sejajar dengan larutan standar adalah 0,4 pa da ekstrak
62
daun dan 0,3 pada ekstrak daun ethanol dan kalus. Hasil Rf yang sejajar dengan
Cajuput merupakan hasil positif sedangkan Rf lainnya menunjukkan senyawa
terpenoid lain.
63
BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:
1. Media yang paling berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus adalah
media dengan kombinasi 1 mg/L 2,4-D dan 0,5 mg/L BA yang
menunjukkan berat segar dan berat kering tertinggi. Media lain yang
menghasilkan tekstur kalus terbaik adalah ZPT 1 mg/L NAA dan 2 mg/L
BA.
2. Variasi media yang paling berpengaruh terhadap kurva pertumbuhan lag
dan eksponensial kalus adalah 1 mg/l 2,4-D dan 0,5 mg/l BA dengan
berat segar dan berat kalus tertinggi serta kurva yang meningkat pada
fase eksponensial dibandingkan medium lainnya.
3. Profil metabolit sekunder kalus tanaman cabe puyang dengan medium
optimal ZPT 2 mg/l NAA dan 1,0 mg/L BA serta 1 mg/l 2,4-D dan 0,5
mg/l BA pada fase pertumbuhan dibandingkan ekstrak daun ex vitro
menghasilkan metabolit sekunder Alkaloid Golongan Piperine dengan
fase gerak toluena : etil asetat (1:1) pada nilai Rf 0,6125. Selain itu, juga
menghasilkan metabolit sekunder Flavonoid pada fase gerak n-heksan:
Asam formiat: etil setat (6: 4 : 0,1) dengan nilai Rf 0,2 serta
menghasilkan metabolit sekunder golongan Terpenoid pada fase gerak
Toluena: etil asetat (9,3:0,7) dengan nilai Rf Linalool 0,2 serta Cajuput
0,3 dan 0,4.
B. Saran
Adapun saran yang dapat diberikan untuk penelitian berikutnya antara lain:
1. Medium yang digunakan untuk induksi kalus perlu ditambahkan arang
aktif (Charcoal) dan dilakukan subkultur secara berkala dengan
penambahan beberapa konsentrasi BA pada medium atau medium yang
sama agar dapat mengurangi kadar fenolik yang dapat menyebabkan
browning.
2. Pada penelitian ini, beberapa medium menunjukkan fase stationer lebih
cepat pada minggu ke-3 hingga minggu ke-5 sehingga mempengaruhi
64
berat kering yang dihasilkan. Hal tersebut perlu dilakukan pengkajian
ulang terkait berat segar yang dihasilkan agar diperoleh kurva yang
meningkat pada fase eksponensial kalus.
3. Perlu dilakukan penelitian analisis metabolit sekunder secara kuantitatif
dengan GC-MS atau LC-MS agar diketahui jumlah kadar metabolit
sekunder Piperine, Quersetin, Linalool, Cajuput serta jenis golongan
senyawa Alkaloid, Flavonoid, dan Terpenoid lain yang dihasilkan.
65
DAFTAR PUSTAKA
Abidin. 1990. Dasar-dasar Pengetahuan tentang Zat Pengatur Tumbuh. Angkasa.
Bandung. Hal: 85.
Admojo, L., dan A. Indrianto. 2016. “Pencegahan Browning Fase Inisiasi Kalus
Pada Kultur Midrib Daun Klon Karet (Hevea Brasiliensis Muell. ARG) PB
330.” Penelitian Karet 3: 25–34.
Aitken-Christie, J., Kozai, T., and Smith, M. A. L. (Eds.). (2013). Automation and
environmental control in plant tissue culture. Springer Science & Business
Media.
Ariati, Sri Niken, Waeniati, Muslimin, dan I Nengah Suwastika. 2012. “Induksi
Kalus Tanaman Kakao (Theobroma Cacao L.) Pada Media MS dengan
Penambahan 2, 4-D, BAP dan Air Kelapa.” Jurnal Natural Science 1 (1): 38–
41. http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/ejurnalfmipa/article/view/1022.
Batubara, Irmanida, Irma Herawati Suparto, dan Fiqa Annisa Rakhmatika. 2016.
“Sineol dalam Minyak Kayu Putih sebagai Pelangsing Aromaterapi.” Jurnal
Jamu Indonesia 1 (3): 12–17. https://doi.org/10.29244/jjidn.v1i3.30639.
Cahyono, Bambang, Eli Fatihatul Hasanah, Judiono, Meiny Suzery, and Widayat.
2019. “Analysis of Piperine Content in Cabe Jawa Extracts (Piper
Retrofractum Vahl) Using UV Spectrophotometry and HPLC.” IOP
Conference Series: Materials Science and Engineering 509 (1).
https://doi.org/10.1088/1757-899X/509/1/012025.
Dwimahyani, Ita. 2007. “Metode Suspensi Sel Untuk Membentuk Spot Hijau Pada
Kultur In-Vitro Galur Mutan Tanaman Jarak Pagar (Jatropha Curcas L).”
Jurnal Ilmiah Aplikasi Isotop Dan Radiasi 3 (2): 55–79.
Evacuasiany, Endang, Slamet Santosa, dan Maike Irwan. 2010. “Efek Analgesik
Ekstrak Ethanol Piper Retrofractum Vahl Pada Mencit Galur Swiss-Webster.”
Jurnal Medika Planta.
Evizal, Rusdi. 2013. “Status Fitofarmaka dan Perkembangan Agroteknologi Cabe
Jawa (Piper retrofractum Vahl.).” Jurnal Agrotropika 18 (1): 34–40.
Faramayuda, F., Elfahmi dan Ramelan, R.S. 2016. “Optimasi Induksi Kalus
Tanaman Cabe Jawa (Piper retrofractum Vahl) dengan Berbagai Variasi Zat
Pengatur Tumbuh.” Ilmiah Farmasi 4 (2): 21–25.
Faramayuda, Fahrauk, Jaka Permana, Akhirul Kahfi Syam, and Elfahmi Elfahmi.
2021. “Identification Secondary Metabolites From Callus Piper Retrofractum
Vahl.” Elkawnie 7 (1): 197–214. https://doi.org/10.22373/ekw.v7i1.8630.
Fatmawati, L. 2019. Induksi Kalus dari Eksplan Daun Sambiloto (Andrographis
paniculata) dengan Pemberian Kombinasi Zat Pengatur Tumbuh 2, 4-
Dichlorophenoxy Acetic Acid (2, 4-D) dan 6-Benzyl Amino Purine
(BAP) (Doctoral dissertation, Universitas Airlangga).
Febriyanti, P. dan S. J. Iswarin. 2018. “Penetapan Kadar Piperin dalam Ekstrak
Buah Lada Hitam (Piper Nigrum Linn.) menggunakan Liquid
Chromatography Tandem Mass Spectrometry ( LC – MS / MS ).” Ilmiah
Farmasi Farmasyifa 1 (2): 69–80.
Haryudin, W. dan Rostiana, O. 2011. “Stabilitas Karakter Morfologi 10 Aksesi
Cabe Jawa (Piper retrofractum Vahl.) di Kebun Percobaan Cikampek.” Bul.
Littro 22 (1): 13–22.
Haryudin, W. dan Rostiana, O. 2009. “Karakteristik Morfologi Tanaman Cabe
Jawa.” Bul. Littro 20 (1): 1–10.
66
Hikmawanti, N.P.E., E. Hanani, S. Maharani, dan A.I.W. Putri. 2021. “Kadar
Piperin Ekstrak Buah Cabe Jawa Dan Lada Hitam Dari Daerah Dengan
Ketinggian Berbeda.” Jurnal Jamu Indonesia 6 (1): 16–22.
https://doi.org/https://doi.org/10.29244/jji.v6i1.176.
Hikmawanti, Ni Putu Ermi, Hariyanti Hariyanti, Cahya Aulia, and Vesya Putri
Viransa. 2016. “Kandungan Piperin dalam Ekstrak Buah Lada Hitam d an
Buah Lada Putih (Piper Nigrum L.) yang Diekstraksi dengan Variasi
Konsentrasi Etanol Menggunakan Metode KLT-Densitometri.” Media
Farmasi: Jurnal Ilmu Farmasi 13 (2): 173. https://doi.org/10.1292.
Iffat, Wajeeha. 2019. “Effect of Tissue Culture Conditions on Production of
Secondary Metabolites” 7 (1): 10–16.
Ihsan, B. R.P, Rahmani, P.A, and Shalas, A.V. 2019. “Validation Method of a TLC-
Densitometry for Determination of Quercetin in Extract and Herbal Products
of Leaves Guava ( Psidium Guajava L .).” Metode Validasi 5 (1): 45–51.
Indah, Putri Nur dan Ermavitalini, Dini. 2013. “Induksi Kalus Daun Nyamplung
(Calophyllum inophyllum Linn.) Pada Beberapa Kombinasi Konsentrasi 6-
Benzylaminopurine (BAP) Dan 2,4D-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D).”
Sains Dan Seni Pomits 2 (1): 1–6.
Indria, Wahyu, Mansyur, dan Ali Husni. 2016. “Pengaruh Pemberian Zat Pengatur
Tumbuh 2,4-Dikhlorofenoksiasetat (2,4-D) Terhadap Induksi Kalus Dan
Penambahan Zat Pengatur Tumbuh Benzyl Adenine (BA) Terhadap Induksi
Kalus mbriogenik Rumput Gajah Varietas Hawaii (Pennisetum Purpureum Ev.
Hawaii) (In Vi.” Fakultas Peternakan Universitas Padjajaran, 1–12.
Jadid, Nurul, Byan Arraniry, Dewi Hidayati, Kristanti Purwani, Wiwi Wikanta,
Sylviana Hartanti, and Rizka Rachman. 2018. “Proximate Composition,
Nutritional Values and Phytochemical Screening of Piper Retrofractum Vahl.
Fruits.” Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 7 (1): 37–43.
https://doi.org/10.4103/2221-1691.221136.
Jamal, Yuliasri, Pipit Irawati, Ahmad Fathoni, dan Andria Agusta. 2013.
“Mekanisme Kimiawi & Efek Antibakteri Minyak Atsiri Daun Cabe Jawa,”
65–72.
Jumiarni,. W. O.dan O. Komalasari. 2017. “Eksplorasi Jenis Dan Pemanfaatan
Tumbuhan Obat Pada Masyarakat Suku Muna Di Permukiman Kota Wuna.”
Traditional Medicine Journal 22 (1): 45–56.
Junairiah, Sibyandhita Erhaa Amalia, Ni’matuzahroh, and Tri Nurhariyati. 2020.
“Identification of Phytocemical Compounds in Ethanol and N-Hexane Leaf
Extracts of Piper Retrofractum Vahl. by Gas Chromatography Mass
Spectrometry.” Moroccan Journal of Chemistry 8 (S1): 32–37.
https://doi.org/10.48317/IMIST.PRSM/morjchem-v8i1.19122.
Junairiah, J., A. Mahmuda, Y. S.W. Manuhara, Ni’Matuzahroh, and L. Sulistyorini.
2019. “Callus Induction and Bioactive Compounds from Piper Betle L. Var
Nigra.” IOP Conference Series: Earth and Environmental Science 217 (1).
https://doi.org/10.1088/1755-1315/217/1/012026.
Junairiah, Dewi Amelia Sofiana, Yosephine Sri Wulan Manuhara, dan Surahmaida.
2018. “Induksi Kalus Piper Retrofractum Vahl. dengan Zat Pengatur Tumbuh
Auksin dan Sitokinin.” Journal of Pharmacy and Science 3 (2): 41–46.
https://doi.org/10.53342/pharmasci.v3i2.116.
Karjadi, A.K dan Buchory, A. 2008. “Sifat Inovasi dan Aplikasi Teknologi
67
Pengelolaan Terpadu Kebun Jeruk Sehat Dalam Pengembangan Agribisnis
Jeruk Di Kabupaten Sambas, Kalimantan Barat.” Jurnal Hortikultura 18 (4):
82730. https://doi.org/10.21082/jhort.v18n4.2008.p.
Lestari, Endang Gati. 2011. “Peranan Zat Pengatur Tumbuh Dalam Perbanyakan
Tanaman Melalui Kultur Jaringan.” Jurnal AgroBiogen 7 (1): 63.
https://doi.org/10.21082/jbio.v7n1.2011.p63-68.
Melati, M., & Soleh, I. (2012). Pertumbuhan cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.)
perdu dengan berbagai teknik pemupukan. Jurnal Agrivigor, 11(2), 195-201.
Melissa, Catherine. 2017. “Biolearning Journal” 04 (1): 27–39.
Mgbeahuruike, E. E., T. Yrjönen, H. Vuorela, and Y. Holm. 2017. “Bioactive
Compounds from Medicinal Plants: Focus on Piper Species.” South African
Journal of Botany 112: 54–69. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2017.05.007.
Muharini, Rini, Zhen Liu, Wenhan Lin, and Peter Proksch. 2015. “New Amides
from the Fruits of Piper Retrofractum.” Tetrahedron Letters 56 (19): 2521–25.
https://doi.org/10.1016/j.tetlet.2015.03.116.
Mujahid, R, Santoso, and Fitriana. 2010. “Pengaruh Jenis Media Terhadap
Kandungan Piperin Kalus Daun Cabe Jawa ( Piper Retrofractum Vahl . )
Vahl . ) Leaves Callus.” Peneliti Balai Litbang Tanaman Obat Dan Obat
Tradisional 3 (1): 42–46.
Muliati, T. Nurhidayah, dan Nurbaiti. 2017. “Pengaruh NAA, BAP dan
Kombinasinya pada Media MS Terhadap Perkembangan Eksplan Sansevieria
macrophylla secara In Vitro.” Jom Faperta 4 (1): 1–13.
Ngomuo, Munguatosha, Emerald Mneney, and Patrick Ndakidemi. 2013. “The
Effects of Auxins and Cytokinin on Growth and Development of
(<I>Musa</I> Sp.) Var. ‘Yangambi’ Explants in Tissue Culture.”
American Journal of Plant Sciences 04 (11): 2174–80.
https://doi.org/10.4236/ajps.2013.411269.
Nugroho, L. H. (2021). Struktur dan Produk Jaringan Sekretori Tumbuhan. UGM
PRESS. Hal: 80,123 dan 139.
Parizot, B and Beeckman, T. (2012). Genomics of root development (pp. 3-28).
Wiley-Blackwell.
Patil, Vaishali M., Sukanya Das, and Krishnan Balasubramanian. 2016. “Quantum
Chemical and Docking Insights into Bioavailability Enhancement of
Curcumin by Piperine in Pepper.” Journal of Physical Chemistry A 120 (20):
3643–53. https://doi.org/10.1021/acs.jpca.6b01434.
Phillips, Gregory C., and Martina Garda. 2019. “Plant Tissue Culture Media and
Practices: An Overview.” In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant
55 (3): 242–57. https://doi.org/10.1007/s11627-019-09983-5.
Pratidina, Nike Virgita Ayu, Anang Syamsunihar, and Sugeng Winarso. 2006.
“Pertumbuhan Bibit Cabe Jawa ( Piper Retrofractum Vahl .) sebagai Respon
Terhadap Dosis dan Jenis Pupuk Nitrogen” Berkah Ilmiah Pertanian, 1–5.
Purnamaningsih, R dan M. Ashrina. 2011. “Pengaruh BAP Dan NAA Terhadap
Induksi Kalus Dan Kandungan Artemisinin Dari Artemisia Annua L.” Berita
Biologi 10 (4): 481–89.
Rasud, Yulianti, and Bustaman Bustaman. 2020. “In Vitro Callus Induction from
Clove (Syzigium Aromaticum L.) Leaves on Medium Containing Various
Auxin Concentrations.” Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia 25 (1): 67–72.
https://doi.org/10.18343/jipi.25.1.67.
68
Salisbury, F. B., & Ross, C. W. (1995). Fisiologi tumbuhan. Institut Teknologi
Bandung. Hal: 12.
Sari, Yanti, Eko Kusumawati, Chairul Saleh, Wawan Kustiawan, and
Sukartiningsih Sukartiningsih. 2018. “Effect of Sucrose and Plant Growth
Regulators on Callogenesis and Preliminary Secondary Metabolic of Different
Explant Myrmecodia Tuberosa.” Nusantara Bioscience 10 (3): 183–92.
https://doi.org/10.13057/nusbiosci/n100309.
Setiawan, E, S Suryawati, dan Subchan. 2013. “Efek Ragam Tiang Panjat Terhadap
Produksi Cabe Jamu.” Agrovigor: Jurnal Agrovivor 6 (1): 57–62.
https://journal.trunojoyo.ac.id/agrovigor/article/view/1479.
Shi, Y., and Yang, S. (2014). ABA regulation of the cold stress response in plants.
In Abscisic acid: metabolism, transport and signaling (pp. 337-363). Springer,
Dordrecht.
Sholihah, Mar’atus, Usman Ahmad, and I Wayan Budiastra. 2017. “Application of
Ultrasonic Wave to Increase Extraction Yield and Effectiveness of
Antioxidant from Mangosteen Rind.” Jurnal Keteknikan Pertanian 05 (2): 1–
11. https://doi.org/10.19028/jtep.05.2.161-168.
Sitompul, S. M., dan Guritno, B. (1995). Analisis Pertumbuhan Tanaman. Unsimar.
Hal: 25.
Tunjung, Woro Anindito Sri, Vita Fatonah, Ghea Putri Christy, Sugeng Triono,
Lisna Hidayati, Dwi Priyanto, Yekti Asih Purwestri, et al. 2020. “Effect of
Growth Factor in Callus Induction and Bioactive Compounds in Seed Explant
of Kaffir Lime (Citrus Hystrix DC.).” Indonesian Journal of Pharmacy 31 (2):
61–68. https://doi.org/10.14499/indonesianjpharm31iss2pp61.
Utami, Ning Wikan., Ninik Syarif, Fauzia dan Setyowati. 2016. “Respon
Pertumbuhan Setek Cabe Jawa (Piper Retrofractum Vahl.) Pada Media Cair
Dengan Penambahan IBA dan Vitamin C” Bul Littro 27: 11–18.
Vinay, S., Renuka, K., Palak, V., Harisha, C R and Prajapati, P. K. 2012.
“Pharmacognostical and Phytochemical Study of Piper Longum L. and Piper
retrofractum Vahl.” Journal of Pharmaceutical and Scientific Innovation 1 (1):
62–66.
Wardani, Dian Pramita, Solichatun Solichatun, and Ahmad dwi Setyawan. 2004.
“Growth and Saponin Production of Talinum Paniculatum Gaertn. Callus
Culture on Various Addition with 2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid (2,4-D)
and Kinetin.” Biofarmasi Journal of Natural Product Biochemistry 2 (1): 35–
43. https://doi.org/10.13057/biofar/f020106.
Wattimena, G. A., Armini, N. M., dan Gunawan, L. W. (1991). Bioteknologi
tanaman. Pusat Antar Universitas. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
William, G. Hopskin and Noorman, P. Hopskin. 2009. Introduction to Plant
Physiology. Wiley. USA . P: 311 and 341.
Zuchri, Amin. 2008. “Habitus Dan Pencirian Tanaman Cabe Jamu (Piper
Retrofractum Vahl.) Spesifik Madura.” Agrovigor 1 (1): 39–44.
https://journal.trunojoyo.ac.id/agrovigor/article/view/230/212.
Zulkarnain, Z. 2009. “Kultur Jaringan Tanaman: Soulsi Perbanyakan Tanaman
Budi Daya,” no. January 2009. https://repository.unja.ac.id/6231/.
69
LAMPIRAN
Lampiran 1. Komposisi Medium Murashige and Skoog's (1962)
Komponen Konsentrasi (mg/L)

Makronutrien
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2O 370
KH2PO4 170
Na2-EDTA 37,3
FeSO4.7H2O 27,8
Mikronutrien
H3BO3 6,2
MnSO4.4H2O 22,3
ZnSO4.4H2O 8,6
KI 0,83
Na2MoO4.2H2O 0,25
CuSO4.5H2O 0,025
CoCl2.6H2O 0,025
Unsur Organik
Sukrosa 30.000
Edamin (opsional) 1000
Glisin 2,0
Indolacetic acid 0,04-10
Kinetin 10.000
Myo-inositol 100
Nicotinic acid 0,5
Pyridoxin-HCl 0,5
Thiamin-HCl 0,1
70
Lampiran 2. Hasil Induksi Kalus dengan berbagai Zat Pengatur Tumbuh selama
35 hari Kultur
A. Induksi Kalus dengan Medium N 12
71
B. Induksi Kalus dengan Medium D10
72
C. Induksi Kalus dengan Medium N 10
73
Lampiran 3. Analisis Statistik Berat Segar Kalus Hari Ke-0
BERAT SEGAR KALUS HARI KE-0
Oneway Anova
Descriptives
VAR00002
95% Confidence Interval for
Std. Mean Minimu

N Mean Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound m Maximum
Kontrol 3 .02737 .007670 .004428 .00831 .04642 .022 .036
N1 3 .01570 .008246 .004761 -.00478 .03618 .010 .025
N0 3 .02210 .009632 .005561 -.00183 .04603 .014 .033
N12 3 .03573 .013842 .007992 .00135 .07012 .020 .045
N10 3 .02943 .014958 .008636 -.00772 .06659 .019 .047
D1 3 .00323 .000611 .000353 .00172 .00475 .003 .004
D10 3 .05997 .022763 .013142 .00342 .11651 .034 .075
Total 21 .02765 .019944 .004352 .01857 .03673 .003 .075
Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig.
VAR00002 Based on Mean 4.173 6 14 .013

Based on Median .427 6 14 .849
Based on Median and with .427 6 6.850 .840
adjusted df
Based on trimmed mean 3.500 6 14 .025
ANOVA
VAR00002
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups .006 6 .001 5.713 .003
Within Groups .002 14 .000
Total .008 20
74
Post Hoc Tests
Homogeneous Subsets
VAR00002
Duncan a
Subset for alpha = 0.05
VAR00001 N 1 2 3
D1 3 .00323
N1 3 .01570 .01570
N0 3 .02210 .02210
Kontrol 3 .02737 .02737
N10 3 .02943
N12 3 .03573
D10 3 .05997
Sig. .051 .104 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
75
Lampiran 4. Analisis Statistik Berat Segar Kalus Minggu Pertama
BERAT SEGAR MINGGU PERTAMA
Oneway Anova
Descriptives
VAR00002
Std. Mean
N Mean Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum
Kontrol 3 .03920 .004987 .002879 .02681 .05159 .035 .045
N1 3 .02400 .005603 .003235 .01008 .03792 .019 .030
N0 3 .03033 .002601 .001501 .02387 .03679 .028 .033
N12 3 .06643 .021222 .012252 .01372 .11915 .052 .091
N10 3 .02987 .013952 .008055 -.00479 .06452 .018 .045
D1 3 .01613 .000814 .000470 .01411 .01816 .015 .017
D10 3 .06713 .029323 .016930 -.00571 .13998 .047 .101
Total 21 .03901 .022901 .004997 .02859 .04944 .015 .101

VAR00002 Based on Mean 6.750 6 14 .002
adjusted df
ANOVA
VAR00002
Between Groups .007 6 .001 5.468 .004

Total .010 20
76
Post Hoc Test
Homogeneous Subsets
VAR00002
a
Duncan
VAR00001 N 1 2
D1 3 .01613
N1 3 .02400
N10 3 .02987
N0 3 .03033
Kontrol 3 .03920
N12 3 .06643
D10 3 .06713
Sig. .108 .955
77
Lampiran 5. Analisis Statistik Berat Segar Kalus Minggu Kedua
Oneway Anova
Descriptives
VAR00002
Std. Mean Minimu

Kontrol 3 .03803 .018407 .010627 -.00769 .08376 .018 .055
N1 3 .02987 .013952 .008055 -.00479 .06452 .018 .045

N0 3 .03640 .017930 .010352 -.00814 .08094 .019 .055
N12 3 .06300 .039238 .022654 -.03447 .16047 .025 .103
N10 3 .03213 .009018 .005207 .00973 .05454 .023 .041

D1 3 .02300 .004770 .002754 .01115 .03485 .018 .026
D10 3 .07963 .031192 .018009 .00215 .15712 .044 .101
Total 21 .04315 .026875 .005865 .03092 .05539 .018 .103

VAR00002 Based on Mean 1.915 6 14 .148

adjusted df
ANOVA
VAR00002
Between Groups .008 6 .001 2.521 .072
Total .014 20
78
Post Hoc Tests
Homogeneous Subsets
VAR00002
Duncan a
VAR00001 N 1 2
D1 3 .02300
N1 3 .02987
N10 3 .03213
N0 3 .03640
Kontrol 3 .03803
N12 3 .06300 .06300
D10 3 .07963
Sig. .068 .376

79
Lampiran 6. Analisis Statistik Berat Segar Kalus Minggu Ketiga
Oneway Anova
Descriptives
VAR00002
Mean
N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum
Kontrol 3 .04197 .015726 .009079 .00290 .08103 .024 .054
N1 3 .03273 .015429 .008908 -.00559 .07106 .020 .050
N0 3 .02130 .006001 .003465 .00639 .03621 .017 .028
N12 3 .09060 .025630 .014797 .02693 .15427 .063 .113
N10 3 .03270 .002095 .001210 .02750 .03790 .031 .035

D1 3 .04733 .025033 .014453 -.01485 .10952 .025 .074
D10 3 .09457 .010041 .005797 .06962 .11951 .084 .104
Total 21 .05160 .030942 .006752 .03752 .06568 .017 .113

VAR00002 Based on Mean 2.257 6 14 .098

adjusted df
ANOVA
VAR00002
Between Groups .015 6 .003 9.362 .000
Total .019 20
80
Post Hoc Tests
Homogeneous Subsets
VAR00002
Duncan a
VAR00001 N 1 2
N0 3 .02130
N10 3 .03270
N1 3 .03273
Kontrol 3 .04197
D1 3 .04733
N12 3 .09060
D10 3 .09457
Sig. .101 .773

81
Lampiran 7. Analisis Statistik Berat Segar Kalus Minggu Keempat
Oneway Anova
Descriptives
VAR00002
Std. Mean Minimu
Kontrol 3 .04467 .027062 .015624 -.02256 .11189 .015 .068
N1 3 .05980 .000700 .000404 .05806 .06154 .059 .060
N0 3 .04050 .005730 .003308 .02627 .05473 .034 .044
N12 3 .13490 .024175 .013958 .07485 .19495 .112 .160
N10 3 .04697 .017769 .010259 .00283 .09111 .033 .067
D1 3 .07277 .033254 .019199 -.00984 .15537 .043 .109
D10 3 .21917 .196929 .113697 -.27003 .70837 .079 .444
Total 21 .08840 .089958 .019631 .04745 .12934 .015 .444

VAR00002 Based on Mean 10.299 6 14 .000
Based on Median 1.317 6 14 .313

Based on Median and with 1.317 6 2.172 .482
adjusted df
ANOVA
VAR00002
Between Groups .079 6 .013 2.211 .104
Total .162 20
82
Post Hoc Tests
Homogeneous Subsets
VAR00002
Duncan a
VAR00001 N 1 2
N0 3 .04050
Kontrol 3 .04467
N10 3 .04697
N1 3 .05980
D1 3 .07277
N12 3 .13490 .13490
D10 3 .21917
Sig. .199 .202
83
Lampiran 8. Analisis Statistik Berat Segar Kalus Minggu Kelima
Oneway Anova
Descriptives
VAR00002
Std. Mean
Kontrol 3 .05933 .029905 .017266 -.01496 .13362 .027 .086
N1 3 .09563 .009810 .005664 .07126 .12000 .087 .106
N0 3 .09863 .030833 .017802 .02204 .17523 .078 .134
N12 3 .18370 .069758 .040275 .01041 .35699 .103 .226
N10 3 .12160 .077562 .044781 -.07108 .31428 .057 .208
D1 3 .10493 .059415 .034303 -.04266 .25253 .037 .144
D10 3 2.77367 .369784 .213495 1.85507 3.69226 2.369 3.094
Total 21 .49107 .963522 .210258 .05248 .92966 .027 3.094

VAR00002 Based on Mean 5.767 6 14 .003

adjusted df
ANOVA
VAR00002
Between Groups 18.261 6 3.044 139.162 .000
Total 18.568 20
84
Post Hoc Tests
Homogeneous Subsets
VAR00002
Duncan a
VAR00001 N 1 2
Kontrol 3 .05933
N1 3 .09563
N0 3 .09863
D1 3 .10493
N10 3 .12160
N12 3 .18370
D10 3 2.77367
Sig. .369 1.000
85
Lampiran 9. Analisis Statistik Berat Kering Kalus Minggu Kelima
Oneway Anova
Descriptives
VAR00002
Std. Mean
Kontrol 3 .01967 .010904 .006295 -.00742 .04675 .008 .030
N1 3 .02317 .006799 .003925 .00628 .04006 .019 .031
N0 3 .01900 .003504 .002023 .01029 .02771 .015 .022
N12 3 .04593 .026166 .015107 -.01907 .11093 .018 .069
N10 3 .03587 .024664 .014240 -.02540 .09714 .018 .064
D1 3 .02403 .014551 .008401 -.01211 .06018 .008 .036
D10 3 .33250 .067174 .038783 .16563 .49937 .261 .395
Total 21 .07145 .112387 .024525 .02029 .12261 .008 .395

VAR00002 Based on Mean 3.377 6 14 .028

adjusted df
ANOVA
VAR00002
Between Groups .240 6 .040 45.245 .000
Total .253 20
86
Post Hoc Tests
Homogeneous Subsets
VAR00002
Duncan a
VAR00001 N 1 2
N0 3 .01900
Kontrol 3 .01967
N1 3 .02317
D1 3 .02403
N10 3 .03587
N12 3 .04593
D10 3 .33250
Sig. .335 1.000

87
Lampiran 10. Surat Keterangan Identifikasi Tanaman Cabe Puyang
88
Lampiran 11. Hasil Uji Metabolit Sekunder Alkaloid dan Flavonoid dengan eluen
lainnya.
1. Uji Alkaloid
a. Jenis eluen ; n-hexane : Etil Asetat (7 : 3) dalam 10 mL
larutan
o Sampel : Ekstrak Methanol dan Ethanol Kalus serta ekstrak

kloroform daun ex vitro Tanaman Cabe Puyang
DK KM KE P
DK KM KE P
DK KM KE P
(Visual Sebelum (UV 254 nm Sebelum (UV 366 nm

Disemprot) disemprot)
Sebelum disemprot)
DK KM KE P DK KM KE P DK KM KE P
(Visual Sesudah (UV 254 nm Sesudah (UV 366 nm Sesudah

Disemprot) Disemprot) Disemprot)
Gambar 18. Uji Alkaloid Ekstrak Daun ex vitro, Ekstrak Ethanol Absolute dan
Methanol Kalus Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.) dengan larutan
standar piperine. DK = ekstrak kloroform daun ex vitro, KM = ekstrak methanol
kalus, KE = ekstrak ethanol absolute kalus dan P = larutan standar piperine.
89
Tabel 11. Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Piperine dan Golongan Alkaloid lainnya
(Piper retrofractum Vahl.) menggunakan eluen n-hexane : etil asetat (7:3)
Sinar UV Keberadaan
1. Daun ex - Pada Sebelum Sebelum DK= Dragendroff +
vitro ekstrak disemprot: disemprot: 0,15 Piperine dan
dengan daun: -Daun - daun: 0,0875 Golongan
pelarut tampak kuning, biru Fluoresensi 0,2 Alkaloid
kloroform noda muda dan merah 0,2625 lainnya.
(DK) serta berwarna cokelat muda, 0,3875
kalus kuning, -kalus cokelat dan 0,675
dengan biru dan methanol merah. 0,725
pelarut cokelat dan ethanol: 0,925
methanol tidak tampak - kalus
(KM) dan - ekstrak - Standar: methanol KM=
ethanol kalus: Biru muda dan ethanol: 0,1875
absolute noda fluoresensi
(KE) tidak Sesudah merah muda KE=
dengan tampak disemprot: dan biru 0,225
larutan -Daun: muda
standar cokelat dan LS=
piperine kuning - standar: 0,0875
-kalus biru muda
methanol
dan ethanol: Sesudah
tidak tampak disemprot:
- Standar: -Daun:
Kuning fluoresensi
kecokelatan cokelat dan
merah
muda.
-Kalus
methanol
dan ethanol:
biru muda
- Standar:
Biru
kekuningan
90
2. Flavonoid
a. Jenis eluen; toluena : etil asetat (1 : 1)
KE KM Q
KE KM Q KE KM Q

Sebelum disemprot)
KE KM Q KE KM Q KE KM Q

Gambar 19. Uji Flavonoid Ekstrak Ethanol Absolute dan Methanol Kalus
Tanaman Cabe Puyang (P. retrofractum Vahl.) dengan Larutan
Standar Quersetine.Keterangan: (KE= ekstrak ethanol absolute
kalus, KM= ekstrak methanol kalus dan Q = larutan standar
Quersetin).
91
• Sampel: Ekstrak ethanol dan methanol daun ex vitro
tanaman cabai puyang (Piper retrofractum Vahl.)
DE DM Q
DE DM Q
DE DM Q
(Visual Sebelum
(UV 254 nm Sebelum (UV 366 nm
Disemprot)
disemprot)
Sebelum disemprot)
DE DM Q DE DM Q DE DM Q

Gambar 20. Uji Flavonoid Ekstrak Ethanol dan Methanol Daun Ex Vitro Tanaman
Cabe Puyang (P. retrofractum Vahl.). Keterangan: Gambar diatas
merupakan hasil uji alkaloid ekstrak ethanol dan methanol daun ex
vitro (DE= ekstrak ethanol abslute daun ex vitro, DM= ekstrak
methanol daun ex vitro dan Q = larutan standar Quersetin).
92
Tabel 12. Hasil Perhitungan Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Golongan Flavonoid
(Piper retrofractum Vahl.) menggunakan eluen Toluena : Etil Asetat (1:1)
UV Keberadaan
Sinar
tampak Senyawa
254 nm 366 nm
1. Ekstrak Keduanya Keduanya Sebelum KE= Sitroborat + Golongan
Ethanol noda noda tidak dan 0,925 Flavonoid
absolute tidak tampak sesudah 0,6625
(KE) dan tampak disemprot 0,475
methanol KE=
Kalus -Larutan -Larutan Fluoresensi KM=
(KM) Standar: Standar: biru, merah 0,9275
Kuning Kuning muda dan 0,6525
merah. 0,4375
KM=
Fluoresensi Larutan
biru, merah Standar=
muda dan 0,4625
merah.
-Larutan
Standar:
Kuning
2. Ekstrak Keduanya Keduanya Sebelum DE= Sitroborat +

ethanol tampak tampak disemprot 1 Senyawa
absolute noda noda DE= 0,9 Golongan
dan berwarna: berwarna: Fluoresensi 0,765 Flavonoid
methanol kuning Kuning, merah, 0,6875 dan
daun ex dan biru, dan merah 0,1 Quersetin
vitro cokelat cokelat. muda dan DM=
cokelat. 0,9875
Larutan Larutan DM= 0,925
Standar: Standar: Fluoresensi 0,7875
kuning kuning merah, 0,725
cerah kecoklatan merah 0,075
muda dan Larutan
cokelat. Standar=
-Larutan 0,4625
Standar:
Cokelat
93
b. Jenis Eluen; n-heksan : etil asetat (7 : 3)
• Sampel: Ekstrak Kloroform daun serta Ekstrak methanol

dan ethanol absolute kalus
DK KM KE Q DK KM KE Q
DK KM KE Q

Sebelum disemprot)
DK KM KE Q DK KM KE Q
DK KM KE Q

Gambar 20. Hasil uji flavonoid ekstrak kloroform daun ex vitro serta ekstrak
methanol dan ethanol Absolute kalus Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum
Vahl.), Keterangan: (DK = ekstrak kloroform daun ex vitro, KM = ekstrak
methanol kalus, KE = ekstrak ethanol absolute kalus dan Q = larutan standar
Quersetin).
94
Tabel 13. Perhitungan Nilai Rf Uji Metabolit Sekunder Golongan Flavonoid
(Piper retrofractum Vahl.) menggunakan eluen n-heksan : etil asetat
(7:3)
UV
Sinar Keberadaan
1. Ekstrak DK= DK= DK= DK Sitroborat +

kloroform
Kuning, Kuning, Fluoresensi 0,1125
daun ex cokelat, cokelat, merah,
vitro (DK) abu-abu abu-abu cokelat dan 0,225
ekstrak dan hijau dan biru. merah
methanol muda.
0,325
(KM) dan 0,425
ethanol KM= KM=
absolute KM= 0,55
Noda tidak Noda tidak
kalus (KE) 0,725
tampak tampak Fluoresensi
biru dan
0,9375
merah
KE= KE= muda. KM=
Noda tidak Noda tidak 0,2
tampak tampak
KE= 0,975
Fluoresensi
0,6
Larutan Larutan biru muda.
Standar= Standar= 0,8
Kuning Cokelat KE=
Larutan
cerah
Standar= 0,2
- Sebelum: 0,975
cokelat
0,6
kekuningan
- Sesudah:
0,8
Kuning LS=
cerah 0,2375
95

Naskah Skripsi - Dyan Oktaviani - 09909 - Periode Januari

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Deskripsi Asli:

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Naskah Skripsi - Dyan Oktaviani - 09909 - Periode Januari

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

PROFIL METABOLIT SEKUNDER KALUS

HASIL PERBANYAKAN TANAMAN CABAI PUYANG

Untuk memenuhi sebagian persyaratan

Guna memperoleh derajad Sarjana Sains

Program Studi Biologi

Aries Bagus Sasongko, S.Si., M.Biotech.

PROFIL METABOLIT SEKUNDER KALUS

Telah diujikan di depan Tim Penguji pada tanggal 29 Desember 2021

Yogyakarta, 11 Januari 2022

Tim Penguji, Dekan,

Lisna Hidayati, S.Si., M. Biotech.

Prof. Dr. L. Hartanto Nugroho, M.Agr.

Yogyakarta, 20 Desember 2021

1. Komposisi Medium Murashige and 71

Keywords: Javanese Long Pepper (Piper retrofractum Vahl)., Callus, Murashige

Gambar 1. Habitus Tanaman Cabe Puyang (P. retrofractum Vahl.)

Cabe Puyang tumbuh diseluruh wilayah Indonesia pada daerah

Gambar 3. Struktur Kimia Piperine (Patil et al., 2016)

Sedangkan struktur kimia metabolit indol alkaloid yang lain adalah:

Gambar 4. Struktur Kimia Metabolit Sekunder Indole Alkaloid Cabe Jawa

Number of matched data 9

C_ID Metabolites Molecular Mw Organism or InChIKey

C00002065 Piperine C17H19NO3 285.136493 Piper retrofractum Vahl.

C00002066 Piperlongumi C17H19NO5 317.126322 Piper retrofractum Vahl.

C00003672 beta - C29H50O 414.386166 Piper retrofractum Vahl.

C00030436 Guineensine C24H33NO3 383.246043 Piper retrofractum Vahl.

C00037153 Filfiline C26H47NO 389.365765 Piper retrofractum Vahl.

C00037498 Methyl C13H12O4 232.073558 Piper retrofractum Vahl.

C00037873 Sylvatine C24H33NO3 383.246043 Piper retrofractum Vahl.

A. Waktu dan Tempat Penelitian

3. Induksi Kalus Daun Tanaman Cabe Puyang (P. retrofractum

Tahap sterilisasi pada eksplan dimulai dengan tahap prasterilisasi

Uji metabolit sekunder dengan kromatografi lapis tipis dilakukan

a. Untuk uji Alkaloid dilakukan dengan menggunakan pelarut:

iii. serta n-heksan : etil asetat (7:3) dalam 10 mL larutan.

c. Untuk uji Terpene dilakukan dengan menggunakan pelarut:

Beberapa eluen yang digunakan tersebut, dilakukan

Berdasarkan (Tabel 3) diatas, hasil yang diperoleh yaitu dari

Selain pengamatan waktu induksi kalus dan persentase kalus, dilakukan

Gambar 6. Kenampakan kalus yang mengalami browning saat disubkultur

Usia Kalus (minggu)

Gambar 7. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang setelah disubkultur pada

Pada (gambar 7) diatas, diketahui bahwa medium basal + Zat pengatur

Gambar 8. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang setelah disubkultur pada

Pertumbuhan kalus pada media basal MS + D 10 (gambar 8) juga optimal

Keterangan: notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan nyata signifikan pada

Berat Segar Kalus

Umur Kalus (Minggu)

Gambar 9. Pertumbuhan Kalus Tanaman Cabe Puyang (Piper retrofractum Vahl.)

(A) (B) (C)

a. Jenis eluen ; Etil asetat : Toluena (1 : 1) dalam 10 mL larutan

Alkaloid merupakan senyawa yang mengandung nitrogen pada tumbuhan

a. Jenis eluen; n-hexane : etil asetat : Asam formiat (6 : 4 : 0,1)

Diketahui bahwa hasil penelitian uji metabolit sekunder Flavonoid yang

- Eluen: Toluena : Etil Asetat (9,3 : 0,7) dengan Larutan Standar

Lampiran 1. Komposisi Medium Murashige and Skoog's (1962)

Komponen Konsentrasi (mg/L)

BERAT SEGAR KALUS HARI KE-0

Std. Mean Minimu

N1 3 .01570 .008246 .004761 -.00478 .03618 .010 .025

N0 3 .02210 .009632 .005561 -.00183 .04603 .014 .033

N12 3 .03573 .013842 .007992 .00135 .07012 .020 .045