LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TOKSIKOLOGI

DEPARTEMEN FARMAKOLOGI DAN FARMASI KLINIK

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA

LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM

FARMAKOLOGI EKSPERIMENTAL I

Judul Percobaan : Analisis Obat Dalam Cairan Hayati

Nama : Dwi Astri Pramudhyta Wardhani
NIM : 18/429540/FA/11805
Kelas/Golongan : C/1
Tanggal praktikum : 3 Juni 2020

A. Tujuan Praktikum
Agar mahasiswa dapat memahami langkah-langkah
analisis obat di dalam cairan hayati.

B. Metode
1. Analisis Sulfadiazin
a. Alat
- Labu takar 100 ml
- Pipet volume 0,1;0,2;1;2 ml
- Tabung reaksi atau flakon
- Pipet ukur 5 ml
- Spektrofotmeter dan kuvet
- Skalpel atau silet
- Sentrifuge dan stopwatch
- Kertas Grafik numerik dan semilog

b. Bahan
- Asam Trikloroasetat (TCA)
- Natrium nitrit 0,1%
- Amonium sulfamat 0,5%
- N(1-nifttil)etilebdiamin
- 0,1%Sulfadiazin (Na)
- Antikoagulan
- Darah (Kelinci)

2. Analisis Asam Salisilat

a. Alat
- Labu takar 100 ml
- Pipet volume 0,1;0,2;1;2 ml
- Tabung reaksi atau flakon
- Pipet ukur 5 ml
 - Spektrofotmeter dan kuvet
- Skalpel atau silet
- Sentrifuge dan stopwatch
- Kertas Grafik numerik dan semilog
- Kertas pH

b. Bahan
- Asam trikloroasetat (TCA)
- NaOH 1N
- Etil asetat
- Eter
- HCl pekat
- Na Salisilat
- Plasma (Kelinci)
- Anti koagulan

3. Analisis Parasetamol
a. Alat
- Labu takar 100 ml
- Pipet volume 0,1;0,2;1;2 ml
- Tabung reaksi atau flakon
- Pipet ukur 5 ml
- Spektrofotmeter dan kuvet
- Skalpel atau silet
- Sentrifuge dan stopwatch
- Kertas Grafik numerik dan semilog
- Kertas pH

b. Bahan
- Larutan Parasetamol dalam propilen glikol 40% atau tilosa 1%
- Asam klorida 6N
- Natrium nitrit 10% baru
- Asam sulfamat 15%
- NaOH 10%
- Darah kelinci
- Plasma (kelinci)
- Asam Trikloroasetat 10%

Hewan Uji: Kelinci

C. Cara Kerja
1. Sulfadiazin
- Prosedur penetapan kadar Bratton-Marshall
Dibuat larutan stok Na sulfadiazin dengan cara ditimbang
sulfadiazin secukupnya, dilarutkan dalam NaOH 1 N dan
diencerkan dengan akuades ad 100 ml sehingga diperoleh
kadar sulfadiazin 25;50;100;200;400 µg/ml

Dibuat kurva baku internal dengan cara ditambahkan ke

dalam blanko (250 µl) yang mengandung antikoagulen
dengan 250 µl larutan stok sulfadiazin sehingga kadarnya
0; 25; 50; 100; 200; 400 µg/ml darah. Dicampur homogen.
Ditambahkan 2,0 ml TCA 5% dengan vortexing

-Pemorsesan sampel darah in vivo:

Ditambah 250 µl akuades ke dalam 250µl
darah yang mengandung antikoagulan,
campur homogen. Ditambah 2,0 ml TCA
5% dengan votexing.

Dicampur pada langkah 2 dan 3, diputar

(5menit; 2500 rpm)

Diambil beningan (1,50 ml) dan encerkan

dengan akuades 2,0 ml

Ditambahkan laurtan NaNO2 (0,1 ml; 0,1 %)

ke dalam tiap tabung, diamkan selama 3
menit

Ditambahkan larutan amonium sulfamat

(0,2 ml; 0,5%), diamkan selama 2 menit

Ditambahkan larutan N(1-naftil)

etilendiamin (0,2 ml; 0,1%), campur,
diamkan 5 menit ditempat gelap.

Dipindahkan larutan kedalam kuvet, baca

intensitas warna pada spektrofotometer
(545 nm) terhadap blanko darah (kontrol)
yang telah diproses dengan cara yang sama
- Mencari Waktu Larutan Sulfadiazin dengan memberikan resapan tetap

Digunakan larutan sulfadiazin dengan

kadar 100 dan 400 µg/ml, diukur
resapannya

Dibuatlah kurva resapan versus waktu

pada kertas grafik numerik dan
tetapkan waktu resapan tetap pada 545
nm tiap menit selama minimal 1 jam

- Menetapkan panjang gelombang larutan sulfadiazine dengan resapan

maksimum. Intensitas warna larutan obat (100 dan 400 µ
- g/ml) diukur resapannya dari 500 s.d. 580 nm).
- Membuat Kurva Baku Sulfadiazin

Diukur resapan semua larutan sulfadiazin (25

s.d. 400 µg/ml) pada panjang gelombang
maksimum

Dibuat kurva antara resapan versus kadar

masing-masing. Dibuat persamaan garis
menggunakan persamaan kuadrat terkecil
y=ax + b, dan hitung nilai r2 dari plot tersebut
2. Na Salisilat
Metode Spektrofotometri
a. Prosedur Penetapan Kadar

Disediakan 2 larutan Na Salisilat dalam air suling (A = 1mg/ml

dan B = 4 mg/ml)

Dibuat zat seri larutan salisilat dalam plasma (1ml) dengan

kadar 10 dan 100 µg/ml menggunakan larutan A dan 800
µg/ml menggunakan larutan B

Ditambahkan larutan TCA (1 ml; 20%) ke dalam plasma dan

pusingkan (10menit; 3000 rpm)

Dituangkan beningan ke dalam tabung reaksi, dibasakan

dengan NaOH 1N(dicek pH dengan kertas pH)

Ditambahkan 1,5 ml campuran etilasetat-eter (14:1), kocok

selama 2-3 menit, dan selanjutnya lapisan organik dibuang

Disari salisilat dengan 4 ml campuran etilasetat-eter dengan

pengocokan 2-3 menit setelah lapisan bagian bawah
diasamkan dengan HCl pekat (2-3 tetes)

Diambil lapisan organik, jika keruh harus dipusingkan (2menit;

1000 rpm), kemudian baca intensitas fluoresensi pada
spektrofotometer pada eksitasi 310 dan 435 nm. Catatan:
Penyarian asam salisilat dengan pelarut organik sebaiknya
dilakukan jika semua sampel telah siap diukur kadarnya
• Menetapkan panjang gelomban eksitasi dan emisi maksimum: Larutan Salisilat (10 dan
100 µg/ml) diukur intensitas fluoresensinya
Dicari panjang gelombang
eksitasi maksimum (nm) pada
emisi 0 nm

Di cari panjang gelombang emisi

maksimum (nm) pada panjang
gelombang eksitasi maksimum

• Cara Mencari Kadar Salisilat

Dimasukkan ke dalam kuvet larutan baku

salisilat yang telah diketahui kadarnya, atur
jarum spektrofluorometer pada skala 100

Diukur intensitas larutan salisilat yang akan

ditentukan kadarnya, misalnya larutan tersebut
memberikan defleksi pada skala 80. Jadi kadar
yang dicari = 80/100 x 10 µg/ml = 8 µg/ml.

Metode Spektrofluorometri dengan pereaksi Trinder

1) Reagensia yang digunakan
- Anti Koagulan: Larutan Kalium Oksalat 2% dengan dosis 20 mg Kalium Oksalat/10ml
darah
- Pengendapan protein dan pewarna
Pereaksi Trinder:
R/ HgCl2 8,0 mg
FeNO3 8,0 mg
HCl 1N 24,0 ml
Aquadest ad200,0 ml
 2) Prosedur Analisis Asam Salisilat dalam darah
Dimasukkan 0,5 mol darah yang sudah diberi
anti koagulan ke dalam tabung sentrifuge yang
berisi 5,0 ml pengendap protein dan pewarna
(perekasi Trinder). Dicampur dengan baik.

Disentrifugasi campuran tersebut selama 5

menit (2500 rpm).

Diambil supernatan yang jernih an resapannya

dibaca dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm.

Dilakukan cara analisis yang sama terhadap

sampel arah blanko

Ditetapkan kadar salisilat dari kurva baku yang

telah disiapkan

3. Parasetamol
• Prosedur Penetapan Kadar

Ditambah plasma (1ml) larutan TCA (1ml;

10%) di dalam tabung pemusing

Diusingkan selama 10 menit dengan

kecepatan 2000 rpm, dan tuang beningan ke
dalam tabung reaksi

Ditambahkan HCl (0,5 ml; 6 N) dan NaNO2 (1

ml; 10%), campur dengan baik, diamkan 5
menit.

Dengan hati-hati ditambahkan asam sulfamat

(1 ml; 15%), dan kemudian NaOH (2,5 ml;
10%), diamkan 3 menit di tempat dingin

Dibaca intensitas warnanya pada

spektrofotometer (435 nm)
 4. Menentukan perolehan kembali, kesalahan acak, dan kesalahan sistematik:
• Sulfadiazin
Disediakan larutan sulfadiazin dalam darah 50; 100; 300 g/ml. Tiap kadar dibuat 3
replikasi

Diambil masing-masing 0,1 ml dan masukkan ke dalam tabung reaksi berisi 3,9 ml air
suling. Selanjutnya diproses seperti pada butir 3 s.d. 8 pada analisis sulfadiazin.

Ditentukan kadar masing-masing berdasarkan persamaan garis (kurva baku

sulfadiazin). Dihitung kadar rata-rata dan simpangan bakunya.

• Salisilat
Disediakan larutan salisilat plasma 10 dan 200 µg/ml, masing-masing 3 replikasi

Ditambahkan larutan TCA ke dalam 1 ml plasma, dan seterusnya diproses seperti

pada butir 2 s.d. 6 pada penetapan kadar salisilat.

Dibandingkan dengan larutan baku salisilat, dan ditentukan kadar masing-masing.

DIhhitung kadar rata-rata dan simpangan bakunya.

• Parasetamol
Disediakan satu seri larutan parasetamol dalam plasma dengan kadar berlainan

Ditetapkan kadar masing-masing menggunakan kurva baku. Dihitung kadar rata-rata

dan simpangan bakunya

D. Analisis Data
1. Perolehan Kembali
Dihitung perolehan kembali dan kesalahan sistematik untuk tiap besaran kadar.

Perolehan Kembali = Kadar Terukur/Kadar Diketahui x 100% = PK %

Catatan: Perolehan kembali merupakan tolok ukur efisiensi analisis, sedangkan

kesalahan sistematik merupakan tolok ukur inakurasi penetapan kadar. Kesalahan ini
dapat berupa kesalahan konstan atau proporsional

2. Kesalahan Acak
Dihitung kesalahan acak untuk tiap besaran kadar.

Kesalahan Acak = Simpangan Baku/Harga Rata-rata x 100% = KA%

Catatan: Kesalahan acak merupakan tolok ukur inprecision suatu analisis, dan dapat
bersifat positif atau negatif. Kesalahan acak identik dengan variabilitas pengukuran dan
dicerminkan oleh tetapan variasi.