Halaman 528-550

Sel Induk Memiliki Kemampuan untuk Membagi dan Membedakan menjadi

Berbagai Jenis
Sel induk memasok sel-sel yang membangun tubuh kita dari telur yang
dibuahi.Pada orang dewasa,sel induk juga mengisi kembali sel yang sudah usang atau
rusak.Untuk menyelesaikan tugas ini,sel induk memiliki dua karakteristik
umum.Pertama,memiliki kapasitas untuk membelah, dan kedua,mereka dapat
berdiferensiasi menjadi satu atau lebih jenis sel khusus.Sebagai dua sel anak yang
dihasilkan dari pembelahan sel induk dapat memiliki nasib yang berbeda. Salah satu
sel mungkin tetap menjadi sel induk yang tidak berdiferensiasi,sedangkan sel anak
lainnya dapat berdiferensiasi menjadi jenis sel khusus.Dengan jenis pola
pembelahan/diferensiasi asimetris ini, populasi sel punca tetap konstan, namun sel
punca menyediakan populasi sel khusus. Pada orang dewasa, jenis mekanisme ini
diperlukan untuk mengisi kembali sel-sel yang memiliki rentang hidup terbatas,
seperti sel epitel kulit dan sel darah merah.
Pada mamalia, sel induk umumnya dikategorikan menurut tahap
perkembangannya dan kemampuannya untuk berdiferensiasi (Gambar 19.13).Sel
induk utama adalah sel telur yang telah dibuahi,melalui banyak pembelahan seluler,
dapat menimbulkan suatu organisme utuh.Telur yang dibuahi dianggap
totipotensi,karena dapat memunculkan semua jenis sel pada organisme
dewasa.Embrio mamalia awal mengandung sel punca embrionik (sel ES),yang
ditemukan dalam massa sel dalam blastokista. Blastokista adalah tahap perkembangan
embrio sebelum implantasi uterus-embrio praimplantasi.Sel induk embrionik bersifat
pluripoten, yang berarti mereka dapat berdiferensiasi menjadi hampir semua jenis sel
tubuh. Namun,satu sel induk embrionik telah kehilangan kemampuan untuk
menghasilkan individu yang utuh dan utuh.
Selama tahap awal perkembangan janin, sel germ-line yang ditemukan di
gonad juga bersifat pluripoten.Sel-sel ini disebut sel germinal embrio (EG
sel).Menariknya, beberapa jenis kanker manusia yang disebut teratocarcinomas
muncul dari sel-sel yang berpotensi majemuk.Tumor aneh ini mengandung berbagai
jaringan termasuk tulang rawan,neuroektoderm,otot,tulang,kulit,struktur ganglion,dan
kelenjar primitif.Karena asal sel teratokarsinoma yang tampaknya embrionik, sel-sel
ini disebut sel karsinoma embrionik (sel EC).
 Seperti disebutkan,orang dewasa juga mengandung sel induk,tetapi dianggap
multipoten atau unipotensi.Sebuah multipoten sel induk dapat berdiferensiasi menjadi
beberapa jenis sel tetapi jauh lebih sedikit dari sel induk embrio.Misalnya,sel induk
hematopoietik (HSC) yang ditemukan di sumsum tulang dapat mensuplai sel-sel yang
mengisi dua jaringan berbeda,yaitu jaringan darah dan limfoid (Gambar
19.14).Selanjutnya,masing-masing jaringan ini mengandung beberapa jenis sel.Sel
punca hematopoietik multipoten dapat mengikuti jalur di mana pembelahan sel
menghasilkan sel pro genitor mieloid,yang kemudian dapat berdiferensiasi menjadi
sel darah merah,basofil,monosit,eosinofil,neutrofil,atau sel dendritik.Sebagai
alternatif,HSC dapat mengikuti jalur di mana ia menjadi sel progenitor limfoid,yang
kemudian berdiferensiasi menjadi sel T,sel B,sel pembunuh alami,atau sel
dendritik.Sel induk lain yang ditemukan pada orang dewasa tampaknya
unipoten.Misalnya,sel germinal primordial di testis hanya berdiferensiasi menjadi satu
jenis sel,yaitu sperma.
Apa potensi penggunaan sel induk?Ketertarikan pada sel induk berpusat
di sekitar dua area utama.Karena sel induk memiliki kapasitas untuk berdiferensiasi
menjadi beberapa jenis sel,studi tentang sel induk dapat membantu kita memahami
mekanisme genetik dasar yang mendasari proses perkembangan,yang rinciannya
dijelaskan dalam Bab 23.Alasan kuat kedua mengapa orang memiliki tertarik pada sel
induk adalah potensinya untuk mengobati penyakit atau cedera manusia yang
menyebabkan kerusakan sel dan jaringan.Aplikasi ini telah menjadi kenyataan dalam
kasus-kasus tertentu.Misalnya, transplantasi sumsum tulang digunakan untuk merawat
pasien dengan bentuk kanker tertentu. Pasien tersebut dapat diberikanradiasi
perawatanyang merusak sistem kekebalan mereka.Ketika pasien ini disuntik dengan
sumsum tulang dari orang yang sehat,kemampuan untuk berkembang biak dan
berdiferensiasi di dalam tubuh mereka dan memberi mereka sistem kekebalan yang
berfungsi.
Ketertarikan baru dalam penggunaan sel punca dalam pengobatan
potensial banyak penyakit lain dipupuk pada tahun 1998 oleh studi dari dua tim
terpisah, dipimpin oleh James Thomson dan John Gearhart, menunjukkan bahwa sel
embrio,baik sel ES atau EG, dapat berhasil disebarkan di laboratorium.Seperti
disebutkan,sel ES dan EG bersifat pluripoten dan oleh karena itu memiliki kapasitas
untuk menghasilkan berbagai jenis jaringan.Seperti yang ditunjukkan pada Tabel
19.4,sel-sel embrionik berpotensi digunakan untuk mengobati berbagai macam
penyakit yang berhubungan dengan kerusakan sel dan jaringan.Sebagai perbandingan
akan sulit berdasarkan pengetahuan modern kita,untuk mengobati penyakit ini dengan
sel induk dewasa karena ketidakmampuan untuk menemukan sebagian besar jenis sel
induk dewasa di dalam tubuh dan berhasil menumbuhkannya di laboratorium. Bahkan
sel induk hematopoietik sulit dipahami.Di sumsum tulang,sekitar satu sel dalam
10.000 adalah sel induk,namun itu cukup untuk mengisi seluruh darah dan sel limfoid
tubuh.Sel induk dari sebagian besar jaringan dewasa lainnya sama sulitnya untuk
ditemukan, jika tidak lebih dari itu.Selain itu, kecuali sel punca dalam darah, jenis sel
induk lain dalam tubuh orang dewasa sulit dihilangkan dalam jumlah yang cukup
untuk transplantasi.Sebagai perbandingan,sel ES dan EG mudah diidentifikasi dan
memiliki keuntungan besar dari pertumbuhan yang cepat di laboratorium. Untuk
alasan ini,sel ES dan EG menawarkan potensi yang lebih besar untuk transplantasi,
berdasarkan pengetahuan kita saat ini tentang biologi sel induk.
Untuk sel ES atau EG yang akan digunakan dalam transplantasi,peneliti
perlu mendapatkan metode yang menyebabkan mereka berdiferensiasi menjadi jenis
jaringan yang sesuai.Misalnya, jika tujuannya adalah untuk memperbaiki cedera
tulang belakang,sel ES atau EG akan membutuhkan isyarat yang tepat yang akan
menyebabkan mereka berdiferensiasi menjadi jaringan saraf.Saat ini, banyak
penelitian diperlukan untuk memahami dan berpotensi mengendalikan nasib sel ES
atau EG.Saat ini,para peneliti berspekulasi bahwa berbagai faktor kompleks
menentukan nasib perkembangan sel punca. Ini termasuk faktor internal di dalam sel
induk itu sendiri, serta faktor eksternal seperti sifat sel tetangga dan adanya hormon
dan faktor pertumbuhan di lingkungan.
Dari perspektif etika,isu utama yang menimbulkan perdebatan adalah
sumber sel induk untuk penelitian dan perawatan potensial. Sebagian besar sel ES
telah diturunkan dari embrio manusia yang dihasilkan dari fertilisasi in vitro dan
kemudian tidak digunakan. Sebagian besar sel EG diperoleh dari janin yang
diaborsi.Beberapa orang merasa bahwa secara moral adalah salah untuk menggunakan
jaringan tersebut dalam penelitian dan/atau pengobatan penyakit atau takut bahwa
teknologi ini dapat menyebabkan aborsi yang disengaja dengan tujuan semata-mata
untuk mendapatkan jaringan janin untuk transplantasi.Atau,yang lain merasa bahwa
embrio dan janin yang menyediakan sel ES dan EG tidak akan menjadi individu yang
hidup,dan oleh karena itu, bermanfaat untuk mempelajari sel-sel ini dan
menggunakannya dengan cara yang positif untuk mengobati penyakit dan cedera
manusia.positif untuk mengobati penyakit dan cedera manusia. Tidak jelas apakah
kedua sudut pandang yang berlawanan ini dapat mencapai titik temu.
Sebagai kompromi, banyak pemerintah telah memberlakukan undang-
undang yang membatasi atau melarang penggunaan embrio atau janin untuk
mendapatkan sel induk,namun mengizinkan penggunaan jalur sel punca yang sudah
tersedia di laboratorium penelitian.Di Amerika Serikat,misalnya,interpretasi terbaru
dari undang-undang federal melarang penggunaan dana pemerintah untuk proyek
penelitian yang melibatkan penghancuran embrio untuk mendapatkan sel induk.
Mulai tahun 2007, penelitian yang disponsori pemerintah dapat dilakukan
pada 60 atau lebih lini sel induk yang dibuat sebelum undang-undang ini, dan
penelitian yang tidak disponsori pemerintah tidak tunduk pada batasan ini. Jika sel
induk dapat diperoleh dari sel dewasa dan disebarkan di laboratorium, dilema etika
dapat dihindari karena kebanyakan orang tidak memiliki keberatan moral yang serius
terhadap prosedur saat ini seperti transplantasi sumsum tulang. Pada tahun 2006,
karya Shinya Yamanaka dan rekan menunjukkan bahwa fibroblas tikus dewasa
(sejenis sel jaringan ikat) dapat menjadi pluripoten melalui injeksi empat gen berbeda
yang mengkode faktor transkripsi. Pada tahun 2007, laboratorium Yamanaka dan dua
kelompok penelitian lainnya mampu menunjukkan bahwa sel induk pluripoten yang
diinduksi (iPS) tersebut dapat berdiferensiasi menjadi semua jenis sel ketika
disuntikkan ke dalam blastokista tikus dan ditumbuhkan menjadi bayi tikus.
Meskipun penelitian lebih lanjut masih diperlukan, hasil terbaru ini menunjukkan
bahwa sel dewasa dapat diprogram ulang untuk menjadi sel induk embrionik.
19.3 TANAMAN YANG DIMODIFIKASI GENETIKA
Seperti yang telah kita lihat, para peneliti telah berhasil membuat hewan
yang dimodifikasi secara genetik karena berbagai alasan. Pada bagian ini, kita akan
mengkaji metode yang diikuti para ilmuwan untuk membuat tanaman transgenik.
Bidang penelitian yang relatif baru adalah penggunaan spesies transgenik
di bidang pertanian. Selama berabad-abad, pertanian mengandalkan program
pemuliaan selektif untuk menghasilkan tanaman dan hewan dengan karakteristik yang
diinginkan. Untuk spesies yang penting secara pertanian, ini sering berarti produksi
galur yang lebih besar, memiliki ketahanan terhadap penyakit, dan menghasilkan
makanan berkualitas tinggi.pertanian Ilmuwansekarang dapat melengkapi strategi
pemuliaan tradisional dengan pendekatan genetik molekuler modern. Pada
pertengahan 1990-an, tanaman rekayasa genetika pertama kali dikomersialkan. Sejak
saat itu, penggunaannya semakin meningkat. Pada tahun 2006, sekitar 20% dari
semua tanaman pertanian adalah transgenik. Di seluruh dunia, lebih dari 100 juta
hektar (247 juta hektar) tanaman transgenik ditanam. Pada bagian ini, kita akan
membahas beberapa penggunaan tanaman transgenik saat ini dan potensinya di
bidang pertanian.
Agrobacterium tumefaciens dan Metode Lain Dapat Digunakan untuk Membuat
Tanaman Transgenik
Seperti yang telah kita lihat, pengenalan gen kloning ke dalam sel embrio
dapat menghasilkan hewan transgenik. Produksi tanaman transgenik agak lebih
mudah, karena sel-sel tanaman tertentu bersifat totipoten, yang berarti mereka mampu
berkembang menjadiutuh organisme yang. Oleh karena itu, tanaman transgenik dapat
dibuat dengan memasukkan gen hasil kloning ke dalam jaringan somatik, seperti
jaringan daun. Setelah sel-sel daun menjadi transgenik, seluruh tanaman dapat
diregenerasi dengan pengobatan daun dengan hormon pertumbuhan tanaman, yang
menyebabkannya membentuk akar dan tunas.
Ahli biologi molekuler dapat menggunakan bakteri Agrobacterium
tumefaciens, yang secara alami menginfeksi sel tanaman, untuk menghasilkan
tanaman transgenik.Plasmid dari bakteri, yang dikenal sebagai Ti plasmid (Tumor-
inducing plasmid), secara alami menginduksi pembentukan tumor setelah tanaman
terinfeksi (Gambar 19.15a). Segmen DNA plasmid, yang dikenal sebagai T DNA
(untuk DNA yang ditransfer), ditransfer dari bakteri ke sel tanaman yang terinfeksi.
DNA T dari plasmid Ti menjadi terintegrasi ke dalam DNA kromosom sel tumbuhan
melalui rekombinasi. Setelah ini terjadi, gen dalam DNA T yang mengkode hormon
pertumbuhan tanaman menyebabkan pertumbuhan sel tanaman yang tidak terkendali.
Ini menghasilkan pertumbuhan tanaman kanker yang dikenal sebagai tumor mahkota
empedu (Gambar 19.15b).
Karena A.tumefaciensA. tumefaciens memasukkan DNA T-nya ke dalam
DNA kromosomal sel tumbuhan, makadapat digunakan sebagai vektor untuk
memasukkan gen hasil kloning ke dalam tanaman. Ahli genetika molekuler telah
mampu memodifikasi plasmid Ti untuk membuat proses ini menjadi efisien. Gen T
DNA yang menyebabkan perkembangan empedu telah diidentifikasi. Untungnya bagi
para insinyur genetika, ketika gen-gen ini dihapus, DNA T masih diambil ke dalam
sel-sel tumbuhan dan diintegrasikan ke dalam DNA kromosom tumbuhan. Namun,
empedu tidak terbentuk. Selain itu, ahli genetika telah menyisipkandapat dipilih gen
penanda yang ke dalam DNA T untuk memungkinkan pemilihan sel tumbuhan yang
telah mengambil T DNA. Gen yang memberikan resistensi terhadap antibiotik
kanamisin adalah penanda terpilih yang umum digunakan. Plasmid Ti yang digunakan
dalam percobaan kloning juga dimodifikasi untuk mengandung situs restriksi unik
untuk penyisipan gen apapun dengan nyaman.
Gambar 19.16 menunjukkan strategi umum untuk memproduksi tanaman
transgenik melalui transfer gen yang diperantarai DNA T. Sebuah gen yang
diinginkan dimasukkan ke dalam plasmid Ti rekayasa genetika dan kemudian diubah
menjadi A. tumefaciens. Sel tumbuhan terkenaditransformasi A. tumefaciens yang.
Setelah memberikan waktu untuk infeksi ,sel-sel tanaman terkena antibiotik
kanamisin dan karbenisilin. Karbenisilin membunuh A. tumefaciens, dan kanamisin
membunuh sel tumbuhan yang belum mengambil T DNA dengan gen resistensi
antibiotik. Oleh karena itu, satu-satunya sel yang bertahan adalah sel tumbuhan yang
telah mengintegrasikan T DNA ke dalam genomnya. Karena DNA T juga
mengandung gen kloning yang diinginkan,sel tanaman yang dipilih diharapkan telah
menerima gen kloning ini juga. Sel-sel tersebut kemudian dipindahkan ke media yang
mengandung hormon pertumbuhan tanaman yang diperlukan untuk regenerasi seluruh
tanaman. Tanaman ini kemudian dapat dianalisis untuk memverifikasi bahwa mereka
adalah tanaman transgenik yang mengandung gen kloning.
A.tumefaciens menginfeksi berbagai spesies tanaman, termasuk sebagian
besar tanaman dikotil, sebagian besar gymnospermae, dan beberapa tanaman
monokotil. Namun, tidak semua spesies tanaman terinfeksi oleh bakteri ini.
Untungnya,metode lain tersedia untuk memasukkan gen ke dalam sel tumbuhan. Cara
lain yang umum untuk menghasilkan tanaman transgenik adalah pendekatan yang
dikenal sebagai transfer gen biolistik. Dalam metode ini, sel tumbuhan dibombardir
dengan proyektil mikro berkecepatan tinggi yang dilapisi dengan DNA. Ketika
ditembakkan oleh "senjata gen" ini, proyektil mikro menembus dinding sel dan
membran dan dengan demikian memasuki sel tanaman. Sel-sel yang mengambil DNA
diidentifikasi dengan penanda yang dapat dipilih dan diregenerasi menjadi tanaman
baru.
Metode lain juga tersedia untuk memasukkan DNA ke dalam sel
tumbuhan (dan juga sel hewan). Misalnya, DNA dapat masuk ke dalam sel tumbuhan
dengan mikroinjeksi-penggunaan jarum berukuran mikroskopis—atau dengan
elektroporasi—penggunaan arus listrik untuk membuat pori-pori sementara di
membran plasma. Karena dinding sel tumbuhan yang kaku merupakan penghalang
yang sulit untuk masuknya DNA, pendekatan lain melibatkan penggunaan protoplas,
yaitu sel tumbuhan yang dinding selnya telah dihilangkan. DNA dapat dimasukkan ke
dalam protoplas menggunakan berbagai metode, termasuk pengobatan dengan
polietilen glikol dan kalsium fosfat. Produksi tanaman transgenik telah dicapai untuk
banyak spesies tanaman pertanian yang penting. Ini termasuk alfalfa, jagung, kapas,
kedelai, tembakau, dan tomat. Beberapa aplikasi tanaman transgenik dijelaskan
selanjutnya.
Tanaman Transgenik Dapat Diberikan Karakteristik Yang Berguna Secara
Pertanian
Berbagai sifat dapat dimodifikasi pada tanaman transgenik (Tabel 19.5).
Seringkali, penelitian transgenik telah berusaha untuk menghasilkan galur tanaman
yang tahan terhadap serangga, penyakit, dan herbisida. Sebagai contoh, tanaman
transgenik yang sangat toleran terhadap herbisida tertentu memiliki telah dibuat .
Perusahaan Monsanto telah memproduksi galur tanaman transgenik yang toleran
terhadap glifosat, zat aktif dalam bicide Roundup™ miliknya. Herbisida tetap efektif
melawan gulma,tetapi tanaman tahan herbisida terhindar (Gambar 19.17).
Pendekatan penting lainnya adalah membuat galur tanaman yang tahan
penyakit. Dalam banyak kasus, tanaman tahan virus telah dikembangkan dengan
memperkenalkan gen yang mengkode protein mantel virus. Ketika sel tumbuhan
mengekspresikan protein mantel virus, mereka menjadi resisten terhadap infeksi oleh
virus.

Banyak tanaman transgenik telah disetujui untuk konsumsi manusia.

Contoh pertama adalah tomat Flavr Savr (Gambar 19.18), yang dikembangkan oleh
Calgene Inc., yang sekarang menjadi bagian dari Monsanto. Dalam teknik ini,
tanaman tomat diberi gen yang mengkode RNA antisense yang melengkapi mRNA
yang mengkode enzim poligalakturonase. Enzim ini, yang diekspresikan selama
pematangan, mencerna ikatan gula di dalam pektin yang ditemukan di dinding sel
tanaman dan dengan demikian melunakkan tomat. RNA antisense mengikat mRNA
poligalakturonase, mencegahnya diterjemahkan.Sebagai tambahan,Selain itu, RNA
untai ganda ditargetkan untuk degradasi (gangguan RNA), seperti yang dibahas dalam
Bab 15 (Gambar 15.23). Karena ekspresi poligalakturonase dibungkam, keuntungan
praktisnya adalah tomat tidak melunak secepat tomat yang tidak dimodifikasi . Oleh
karena itu, tomat ini dapat dibiarkan matang pada pokok anggur untuk jangka waktu
yang lebih lama, meningkatkan rasa dan memperpanjang umur simpannya.
Peningkatan rasa merupakan pertimbangan penting di pasar tomat AS tahunan senilai
$5 miliar. Sebagai perbandingan, tomat komersial lainnya biasanya dipetik saat masih
hijau dan matang kemudian untuk mempertahankan kekencangannya lebih lama.
Tomat Flavr Savr tidak sukses secara komersial, dan penjualannya akhirnya
dihentikan.
Kegagalan Flavr Savr telah dikaitkan dengan berbagai masalah.
Khususnya,varietas tomat hasil rekayasa genetika mungkin bukan pilihan terbaik, dan
sifat anti pembusukannya tidak terlalu membantu untuk bisnis tomat seperti yang
telah diantisipasi Calgene. Dibandingkan dengan tomat hijau yang tidak dimodifikasi,
faktor lainnya adalah tomat Flavr Savr yang matang lebih lembut dan membutuhkan
pembelian peralatan penanganan yang mahal.
 Sebuah contoh yang jauh lebih sukses dari penggunaan tanaman
transgenik telah melibatkan pengenalan gen dari Bacillus thuringiensis (Bt). Seperti
dibahas sebelumnya dalam bab ini, bakteri ini menghasilkan racun yang membunuh
jenis ulat dan kumbang tertentu dan telah digunakan secara luas sebagai agen kontrol
biologis selama beberapa dekade. Racun ini adalah protein yang dikodekan dalam
genom B. thuringiensis. Para peneliti telah berhasil mengkloning gen toksin dari B.
thuringiensis dan mentransfer gen tersebut ke tanaman. Varietas tanaman Bt tersebut
menghasilkan racun itu sendiri dan oleh karena itu tahan terhadap banyak jenis ulat
dan kumbang. Contoh tanaman komersial termasuk jagung Bt (Gambar 19.19akapas)
danBt. Sejak diperkenalkan pada tahun 1996, penggunaan komersial kedua tanaman
Bt ini terus meningkat (Gambar 19.19b).
Pengenalan tanaman transgenik ke dalam pertanian telah ditentang keras
oleh beberapa orang. Apa risiko yang dirasakan? Salah satu risiko potensial adalah
bahwa transgen pada tanaman komersial dapat membahayakan spesies asli.Misalnya,
tanaman Bt dapat membunuh penyerbuk spesies asli. Kekhawatiran lain adalah bahwa
penanaman tanaman transgenik berpotensi menyebabkan perkembangbiakan.

19.4 TERAPI GEN MANUSIA

Sepanjang buku teks ini, kami telah mempertimbangkan contoh di mana
gen mutan menyebabkan penyakit manusia. Seperti dibahas dalam Bab 22, ini
termasuk kelainan bawaan yang langka dan penyakit yang lebih umum seperti kanker.
Karena gen mutan menyebabkan penyakit, ahli genetika secara aktif mengejar tujuan
menggunakan gen yang tidak normal, kloning untuk mengkompensasi cacat pada gen
mutan. Terapi gen adalah pengenalan gen kloning ke dalam sel hidup dalam
pengobatan penyakit. Ini adalah metode potensial untuk mengobati berbagai macam
penyakit.
Banyak upaya penelitian saat ini dalam terapi gen ditujukan untuk
mengurangi penyakit manusia yangditurunkan. Lebih dari 4.000 penyakit genetik
manusia diketahui melibatkan kelainan gen tunggal. Contoh familiar termasuk cystic
fibrosis, penyakit sel sabit, dan hemofilia. Selain itu, terapi gen juga ditujukan untuk
mengobati penyakit seperti kanker dan penyakit kardiovaskular, yang mungkin terjadi
di kemudian hari. Beberapa ilmuwan bahkan melakukan penelitian yang akan
menggunakan terapi gen untuk memerangi penyakit menular seperti AIDS. Meskipun
terapi gen masih dalam tahap awal pengembangan, sejumlah besar penelitian telah
dilakukan. Sayangnya, keberhasilannya terbatas, dan relatif sedikit pasien yang
diobati dengan terapi gen.Namun demikian, beberapa hasil agak menjanjikan Tabel
19.6 menjelaskan beberapa jenis penyakit yang sedang diselidiki sebagai target
potensial untuk terapi gen. Pada bagian ini, kita akan mengkaji pendekatan terapi gen
dan bagaimana terapi gen dapat digunakan untuk mengobati penyakit manusia.

Terapi Gen Melibatkan Pengenalan Gen Kloning ke dalam Sel Manusia

Sebuah kunci dalam terapi gen adalah pengenalan gen kloning ke dalam
sel manusia. Teknik untuk mentransfer gen kloning ke dalam sel manusia dapat
dikategorikan sebagai metode transfer gen nonviral dan virus. Teknik nonviral yang
paling umum melibatkan penggunaan liposom, yang merupakan vesikel lipid
(Gambar 19.20a). DNA yang mengandung gen yang diinginkan dikomplekskan
dengan liposom yang membawa muatan positif (yaitu, liposom kationik).Kompleks
DNA-liposom dibawa ke dalam sel melalui endositosis, di mana sebagian dari
membran plasma berinvaginasi dan menciptakan vesikel intraseluler yang dikenal
sebagai endosom; liposom terdegradasi dalam endosom. DNA kemudian dilepaskan
ke dalam sitosol, diimpor ke dalam nukleus, dan kemudian diintegrasikan ke dalam
kromosom sel target. Keuntungan darigen transfermelalui liposom adalah bahwa
liposom tidak menimbulkan respon imun.Kerugiannya adalah efisiensi transfer gen
mungkin sangat rendah.Cara kedua untuk mentransfer gen ke dalam sel manusia
adalah melalui virus. Virus yang umum digunakan untuk terapi gen termasuk virus
retro, adenovirus, dan parvovirus.Modifikasi genetik genom virus ini telah
menyebabkan pengembangan vektor terapi gen dengan kapasitas untuk menginfeksi
sel atau jaringan, seperti kemampuan virus tipe liar untuk menginfeksi sel. Namun,
berbeda dengan virus tipe liar, vektor virus terapi gen telah direkayasa secara genetis
sehingga kehilangan kapasitasnya untuk bereplikasi di sel target. Namun demikian,
virus rekayasa genetika secara alami diambil oleh sel melalui endositosis (Gambar
19.20b).Mantel virus dibongkar, dan genom virus dilepaskan ke dalam sitosol. Dalam
kasus retrovirus, genomnya adalah RNA, yang ditranskripsikan secara terbalik
menjadi DNA. DNA virus, yang membawa gen yang diinginkan, berjalan ke dalam
nukleus dan kemudian diintegrasikan menjadi kromosom sel target.
Keuntungan utama dari vektor virus adalah kemampuannya untuk secara
efisien mentransfer gen kloning ke berbagai jenis sel manusia. Namun,kerugian utama
dari terapi gen yang dimediasi virus adalah potensi untuk membangkitkan respon
imun yang tidak diinginkan ketika disuntikkan menjadi pasien. Respon inflamasi yang
disebabkan oleh partikel virus adeno, misalnya, bisa sangat kuat dan bahkan
fatal.Oleh karena itu, banyak upaya telah ditujukan untuk mencegah respons inflamasi
yang dimediasi oleh partikel virus.Ini termasuk penerapan obat imunosupresif dan
generasi vektor virus yang kurang imunogenik dengan modifikasi genetik lebih lanjut
dalam genom virus.
Defisiensi Adenosin Deaminase Adalah Yang Pertama Penyakit Keturunan yang
Diobati dengan Terapi Gen
Adenosin deaminase (ADA) adalah enzim yang terlibat dalam purin
metabolisme. Jika kedua salinan gen ADA rusak, deoksi adenosin akan menumpuk di
dalam sel individu. Pada konsentrasi tinggi, deoxyadenosine sangat beracun bagi
limfosit limfosit dalam sistem kekebalan, yaitu, sel T dan sel B. Diindividu yang
terkena, penghancuran sel T dan B menyebabkan bentuk penyakit imunodefisiensi
gabungan yang parah (SCID). Jika tidak diobati, SCID biasanya fatal pada usia dini
(umumnya,satu sampai dua tahun), karena sistem kekebalan individu ini sangat
terganggu dan tidak dapat melawan infeksi.
Tiga pendekatan dapat digunakan untuk mengobati defisiensi ADA.
Dalam beberapa kasus, pasien mungkin menerima transplantasi sumsum tulang dari
donor yang kompatibel. Metode kedua adalah merawat pasien SCID dengan ADA
murni yang digabungkan dengan polietilen glikol (PEG). PEG-ADA ini diambil oleh
limfosit dan dapat memperbaiki kekurangan ADA. Sayangnya, kedua pendekatan ini
tidak selalu tersedia dan/atau berhasil. Pendekatan ketiga yang lebih baru adalah
untuk mengobati pasien ADA dengan terapi gen.
Pada 14 September 1990, terapi gen manusia pertama disetujui untuk
seorang gadis muda yang menderita defisiensi ADA. Pekerjaan ini dilakukan oleh tim
besar peneliti yang terdiri dari R. Michael Blaese, Kenneth Culver, W. French
Anderson, dan rekan. Sebelum uji klinis ini, gen normal untuk ADA telah diklon ke
dalam vektor retroviral yang dapat menginfeksi limfosit . Tujuan umum dari terapi ini
adalah untuk menghilangkan limfosit dari darah gadis muda dengan SCID,
memasukkannormal ADA genke dalam selnya, dan kemudian mengembalikannya ke
aliran darahnya.
 Gambar 19.21 menguraikan protokol untuk pengobatan eksperimental.
Limfosit (yaitu, sel T) dikeluarkan dan dibiakkan di laboratorium. Limfosit kemudian
ditransfeksi dengan retrovirus nonpatogenik yang telah direkayasa secara genetik
untuk mengandungnormal ADA gen. Selama siklus hidup ret norovirus, materi
genetik retroviral dimasukkan ke dalam DNA sel inang. Oleh karena itu, karena
retrovirus ini mengandung gen ADA normal, gen ini juga dimasukkan ke dalam
kromosom DNAlimfosit gadis itu. Setelah ini terjadi di laboratorium, sel-sel itu
diperkenalkan kembali ke pasien. Pendekatan ini disebut pendekatan ex vivo karena
manipulasi genetik terjadi di luar tubuh, namun produknya dimasukkan kembali ke
dalam tubuh.
Dalam uji klinis ini, dua pasien didaftarkan, dan pasien ketiga kemudian
dirawat di Jepang. Apakah pengobatannya berhasil? Hasil uji coba ini menunjukkan
bahwa transfer DNA ke dalam sejumlah besar sel manusia layak dilakukan. Pada
setidaknya satu pasien, sel T yang membawa gen kloning masih dapat dideteksi 8
sampai 10 tahun setelah mereka dipindahkan. Namun, sebagian besarberedar sel T
yangtidak ditemukan mengandung gen kloning.Karena individu juga menerima
pengobatan PEG-ADA dosis rendah, peneliti tidak dapat menentukan apakah transfer
gen ke dalam sel T itu sendiri memiliki manfaat klinis yang signifikan atau tidak.
 Bentuk lain dari SCID, disebut SCID-X1, diwariskan sebagai sifat
terkait-X. SCID-X1 ditandai dengan hambatan dalam pertumbuhan dan diferensiasi
sel T. Blok ini disebabkan oleh mutasi pada gen yang mengkode γc reseptor sitokin,
yang memainkan peran kunci dalam pengenalan sinyal yang diperlukan untuk
mendorong pertumbuhan, kelangsungan hidup, dan diferensiasi sel T.Terapi genmirip
dengan percobaan yang ditunjukkan pada Gambar 19.21 dimulai pada tahun 2000 di
mana normal γc gen reseptor sitokin diklon ke dalam vektor retroviral dan kemudian
dimasukkan ke dalam limfosit pasien SCID X1. Limfosit kemudian diperkenalkan
kembali kembali ke dalam tubuh mereka.Pada 10-bulan menindaklanjuti,sel T
mengungkapkan normal γc reseptor sitokin terdeteksi pada dua pasien. Yang
terpenting, jumlah sel T pada kedua pasien ini telah meningkat ke tingkat yang
sebanding dengannormal individu. Uji klinis ini adalah demonstrasi pertama yang
jelas bahwa terapi gen dapat menawarkan manfaat klinis, memberikan dalam kasus ini
apa yang tampaknya menjadi koreksi lengkap dari fenotipe penyakit. Namun, dalam
sebuah penelitian di Prancis yang melibatkan 10 pasien SCID-X1, terjadi efek
samping yang tidak terduga dan serius. Dalam tiga tahun pengobatan terapi gen, tiga
dari 10 anak yang dirawat mengembangkan leukemia-suatu bentuk kanker yang
melibatkan proliferasi sel darah putih. Dalam kasus ini, penyakit ini disebabkan oleh
integrasi vektor retrovirus sebelah gen tertentu dalam genom pasien. Perkembangan
leukemia pada pasien ini telah menghentikan banyak uji klinis yang melibatkan terapi
gen.
Semprotan Aerosol Dapat Digunakan untuk Mengobati Cystic Fibrosis
Fibrosis kistik (CF) adalah gangguan resesif langka dengan melemahkan
konsekuensi.Sekitar 1 dari 3.000 bayi yang orang tuanya keturunan Eropa utara
terkena gangguan ini. CF disebabkan oleh defek pada gen yang disebut cystic fibrosis
transmembran regulator (CFTR),yang mengkode protein yang berfungsi dalam
pengangkutan ion klorida melintasi plasma membran sel epitel, seperti sel yang
melapisi saluran pernapasan dan saluran usus.Cacat dalam transportasi membran
menyebabkan kelainan keseimbangan garam dan air,yang menyebabkan berbagai
gejala,terutama akumulasi lendir yang berlebihan di paru-paru.Meskipun langkah
besar telah dibuat dalam pengobatan gejala CF,penyakit ini tetap dikaitkan dengan
infeksi paru-paru berulang dan rentang hidup yang lebih pendek.Dalam kebanyakan
kasus, hasil kematian dari infeksi paru-paru kronis.
 CF telah menjadi subyek banyak penelitian terapi gen.Uji klinis telah
menguji kemampuan terapi gen untuk memperbaikikondisi pasien yang menderita
CF. Untuk menerapkan terapi gen CF,gen normal CFTR harus dikirim ke sel paru-
paru. Tidak seperti ADA terapi gen,dimana limfosit dapat diobati secara ex vivo,sel-
sel epitel paru tidak dapat diangkat dan kemudian dimasukkan kembali ke dalam
individu. Sebaliknya,peneliti harus merancang pendekatan inovatif yang dapat
menargetkan CFTR gen langsung ke sel paru-paru.
melibatkan penggunaan semprotan aerosol inhalasi.Dalam satu
protokol,normal CFTR gen diklon ke adenovirus,virus yang biasanya menginfeksi sel
epitel paru-paru dan menyebabkan infeksi paru-paru.Adenovirus ini, bagaimanapun,
telah direkayasa sehingga akan masuk ke dalam sel epitel tetapi tidak menyebabkan
infeksi paru-paru.Selain itu, adenovirus telah direkayasa untuk mengandung normal
CFTR gen. Dalam pendekatan kedua,normal CFTR gen dikomplekskan dengan
liposom.Ketika dihirup oleh pasien melalui semprotan aerosol,sel-sel epitel paru-paru
mengambilini liposom kompleks.
Seperti ADA terapi gen, terapi gen CF berada pada tahap awal
perkembangan. Para peneliti berharap terapi gen pada akhirnya akan menjadi metode
yang efektif untuk meringankan gejala yang terkait dengan penyakit ini.

RINGKASAN KONSEPTUAL DAN EKSPERIMENTAL

Bioteknologi,penerapan teknologi yang melibatkan penggunaan
organisme hidup dalam pengembangan produk dan layanan yang bermanfaat bagi
manusia, semakin dikaitkan dengan genetika molekuler.Misalnya,alat genetika
molekuler dapat merekayasa mikroorganisme rekombinan yang digunakan dalam
produksi produk yang penting secara medis. Produksi somatostatin oleh bakteri
rekombinan membuka jalan bagi penciptaan genetik obat-obatan yang direkayasa
secara khusus, termasuk insulin dan hormon pertumbuhan manusia.Mikroorganisme
rekombinan juga telah digunakan sebagai agen pengendalian biologis penyakit
tanaman dan untuk bioremediasi untuk memodifikasi polutan beracun.
Alat molekuler juga digunakan untuk membuat organisme transgenik,
yang mengandung DNA rekombinan darilain spesies yang telah diintegrasikan ke
dalam genom mereka. Kami mengeksplorasi teknik saat ini yang digunakan untuk
membuat hewan transgenik dan potensi penggunaannya. Pengenalan DNA kloning ke
dalam sel dapat menyebabkan penggantian gen atau penambahan gen. Dengan cara
ini, para peneliti dapat menghasilkan knockout dan knockin gen, yang merupakan alat
yang ampuh untuk mengeksplorasi fungsi gen dan penyakit manusia. Penelitian
sedang mengembangkan spesies ternak transgenik yang menghasilkan protein penting
secara medis. Dalam beberapa tahun terakhir,kloning dari sel somatik telah dicapai
pada beberapa spesies mamalia,dimulai dengan domba kloning pertama, Dolly.
Studipenelitian sel punca dapat membantu kita memahami mekanisme genetik dasar
yang mendasari proses perkembangan. Lebih lanjut, sel punca memiliki potensi untuk
mengobati penyakit atau cedera manusia yang menyebabkan kerusakan sel dan
jaringan.
Bidang penelitian yang relatif baru adalah penggunaan spesies transgenik
di bidang pertanian.Tanaman transgenik dapat diproduksi melalui penggunaan bakteri
Agrobacterium tumefaciens sebagai vektor atau melalui teknik transfer gen biolistik.
Tujuan penting adalah membuat galur tanaman yang tahan penyakit atau
herbisida .Sementara banyak orang memiliki kekhawatiran atas penggunaan
organisme hasil rekayasa genetika di bidang pertanian,penggunaannya terus
meningkat.Dimasa mendatang,diharapkan produksi dan keberhasilan komersial
organisme transgenik akan semakin meningkat.
Banyak upaya ilmiah dilakukan untuk terapi gen, pengenalan gen kloning
ke dalam sel hidup untuk mengobati berbagai macam penyakit manusia. Dalam
pendekatan ini, gen kloning diperkenalkan melalui liposom atau virus ke dalam sel
somatik sebagai cara untuk mengkompensasi gen yang rusak. Sementara keberhasilan
terbatas dan risiko serius telah diidentifikasi, beberapa hasil agak menjanjikan. Di
masa depan, ini mungkin menjadi cara penting untuk meringankan banyak gangguan
manusia.
SET MASALAH & WAWASAN
Masalah Terpecahkan
S1. Protokol yang diikuti untuk memproduksi somatostatin dalam rekombinan E. coli
selakan sulit dilakukan jika somatostatin merupakan polipeptida panjang. Jelaskan
mengapa.
Jawaban: Para peneliti menyusun urutan pengkodean omatostatin dengan membuat
beberapa oligonukleotida pendek yang saling melengkapi satu sama lain dan
membentuk urutan pengkodean somatostatin. Ini akan sulit dicapai jika urutan
polipeptida lebih panjang, katakanlah, panjangnya 100 asam amino, karena akan
membutuhkan sintesis banyak oligonukleotida pendek.
S2. Manakah dari berikut ini yang tepat untuk digambarkan sebagai organisme
transgenik?
A. Domba “Dolly,” yang diproduksi oleh kloning
B. Sebuah domba yang menghasilkanmanusia α-1-antitrypsin dalam
susu nya
C. Flavr Savr strain tomat
D. Sebuah hibrida galur jagung yang dihasilkan dari persimpangan dua strain inbrida
dari jagung (Strain inbrida tidak transgenik.)
Jawaban:
A. Tidak, Dolly tidak diproduksi menggunakan teknik rekombinan. Potongan DNA
dengan cara baru.tidak dipotong dan digabungkan
B. Ya
C. Ya
D. Tidak,hibrida hanya mengandung gen kromosom dari dua galur induk yang
berbeda.
S3. Jelaskan strategi untuk memproduksi protein manusia dalam susu ternak.
Jawaban: Protein susu dikodekan oleh gen dengan promotor dan urutan pengatur yang
mengarahkan ekspresi gen ini di dalam sel kelenjar susu. Untuk mendapatkan protein
lain yang diekspresikan dalam kelenjar susu, strateginya adalah menghubungkan
promotor dan sekuens pengatur dari gen spesifik susu ke sekuens pengkodean gen
yang mengkode protein manusia yang diinginkan. Dalam beberapa kasus, perlu juga
menambahkan urutan sinyal ke ujung terminal amino dari protein target. Urutan
sinyal adalah polipeptida pendek yang mengarahkan sekresi protein dari sel. Jika
protein target belummemiliki urutan sinyal, adalah mungkin untuk menggunakan
urutan sinyal dari gen khusus susu untuk mempromosikan sekresi protein target dari
sel-sel susu dan ke dalam susu.Selama proses ini, urutan sinyal dibelah dari protein
yang disekresikan.
S4. Berkenaan dengan organisme hasil rekayasa genetika, jelaskan dua yang belum
berhasil dan dua yang berhasil.
Jawaban: Dua contoh yang gagal adalah bakteri pemakan minyak dan tomat Flavr
Savr.Dua contoh yang sangat suksestermasuk bakteri yang membuat insulin manusia
dan varietas Bt dari tanaman pertanian.
Pertanyaan Konseptual
C1. Apa itu mikroorganisme rekombinan? Mendiskusikan contoh mikroba
rekombinan.
C2. Strainkekurangan konjugasi A. radiobacter yang digunakan untuk memerangi
penyakit empedu mahkota. Jelaskan bagaimana bakteri ini mencegah penyakit dan
keuntungan dari strain yang kekurangan konjugasi.
C3. Apa itu bioremediasi? Apa perbedaan antara biotransformasi dan biodegradasi?
C4. Apa yang dimaksud dengan agen pengendali hayati? Jelaskan secara singkat tiga
contoh.
C5. Seperti dijelaskan dalam Tabel 19.2, beberapa agen medis sekarang diproduksi
secara komersial oleh mikroorganisme rekayasa genetika. Diskusikan keuntungan dan
kerugian membuat agen ini dengan cara ini.
C6. Apa model tikus untuk penyakit manusia?
C7. Apa itu organisme transgenik? Jelaskan tiga contoh.
C8. Bagian mana dari A. tumefaciens yang DNAditransfer ke genom sel tumbuhan
selama infeksi?
C9. Jelaskan perbedaan antara penambahan gen dan penggantian gen. Apakah uraian
berikut ini merupakan contoh penambahan gen atau penggantian gen?
A. Model tikus untuk mempelajari cystic fibrosis
B. Pengenalan gen resistensi pestisida ke dalam jagung menggunakan plasmid Ti dari
A. tumefaciens
C10. Seperti dijelaskan dalam Bab 7, tidak semua sifat yang diturunkan ditentukan
oleh gen inti (yaitu, gen yang terletak di inti sel) yang diekspresikan selama
kehidupan individu. Secara khusus, gen efek ibu dan gen mitokondria adalah
pengecualian. Dengan pemikiran ini, mari kita pertimbangkan kloning domba
(misalnya, Dolly).
A. Berkenaan dengan gen efek ibu, apakah fenotipe hewan kloning seperti itu
ditentukan oleh hewan yang menyumbangkan sel telur yang dienukleasi atau oleh
hewan yang menyumbangkan inti sel somatik?Menjelaskan.
B. Apakah hewan kloning mewarisi sifat ekstranuklear dari hewan yang
menyumbangkan telur atau dari hewan yang menyumbangkan sel somatik?
Menjelaskan.
C. Dengan cara apa Anda mengharapkan hewan kloning ini serupa atau berbeda dari
hewan yang menyumbangkansel somatik? Apakah adil untuk menyebut hewan seperti
itu sebagai "klon" dari hewan yang menyumbangkan nukleus?
C11. Diskusikan beberapa sifat berharga yang dapat dimodifikasi pada tanaman
transgenik.
C12. Diskusikan keprihatinan beberapa orang sehubungan dengan penggunaan
organisme hasil rekayasa genetika.

Soal Eksperimen
E1. Bakteri rekombinan dapat menghasilkan hormon yang biasanya diproduksi pada
manusia. Jelaskan secara singkat bagaimana hal ini dicapai.
E2. Dalam percobaan Gambar 19.1, mengapa plasmid dengan somatostatin dalam
orientasi yang salah gagal menghasilkan somatostatin?
E3. Bacillus thuringiensis dapat membuat racun yang membunuh serangga. Toksin ini
harus diterapkan beberapa kali selama musim pertumbuhan untuk mencegah
kerusakan serangga. Sebagai alternatif aplikasi berulang, salah satu strateginya adalah
dengan mengaplikasikan bakteri langsung ke daun. Namun, B. thuringiensis tidak
bertahan lama di lapangan. Bakteri lain, seperti Pseudomonas syringae, lakukan.
Mengusulkan cara untuk mengubah P. syringae sehingga dapat digunakan sebagai
insektisida. Diskusikan keuntungan dan kerugian dari pendekatan ini dibandingkan
dengan aplikasi berulang insektisida dari B. thuringiensis.
E4. Dalam percobaan Gambar 19.1, jelaskan bagaimana urutan pengkodean untuk
somatostatin dibangun. Mengapa perlu untuk menghubungkan urutan coding ini ke
urutan untuk β-galactosidase? Bagaimana Apakah dua polipeptida ini dipisahkan
setelah protein fusi disintesis di E.coli?
E5. Jelaskan bagaimana mungkin untuk memilih rekombinasi homolog pada tikus.
Penanda fenotipik apa yang digunakan untuk mengidentifikasi tikus chimeric dengan
mudah?
E6. Untuk menghasilkan tanaman transgenik, jaringan tanaman dipapar A.
tumefaciens kemudian ditumbuhkan pada media yang mengandung kanamisin,
karbenisilin, dan hormon pertumbuhan tanaman. Jelaskan tujuan di balik masing-
masing dari ketiga agen ini. Apa yang akan terjadi jika Anda meninggalkan
kanamisin?
E7. Sebutkan dan jelaskan secara singkat lima metode untuk introduksi gen kloning
ke dalam tanaman.
E8. Apa itu knockout gen? Apakah hewan atau tumbuhan dengan gen knockout
heterozigot atau homozigot? Apa yang dapat Anda simpulkan jika KO gen tidak
memiliki efek fenotipik?
E9. Saat ini, sudah umum bagi para peneliti untuk mengidentifikasi gen menggunakan
metode kloning yang dijelaskan dalam Bab 18 dan 19. Gen dapat diidentifikasi
menurut fitur molekulernya. Misalnya, segmen DNA dapat diidentifikasi sebagai gen
karena mengandung kombinasi urutan yang tepat: promotor, ekson, intron, dan
terminator.Atau gen dapat diidentifikasi karena ditranskripsi menjadi mRNA. Dalam
studi tumbuhan dan hewan, relatif umum bagi para peneliti untuk mengidentifikasi
gen menggunakan teknikmolekuler tanpa mengetahui fungsi gen tersebut.
Dalamkasus tikus, fungsi gen dapat diselidiki dengan membuat knockout gen. Jika
knockout menyebabkan perubahan fenotipik pada tikus, ini dapat memberikan
petunjuk penting mengenai fungsi gen. Misalnya, jika KO gen menghasilkan tikus
albino, ini akan menunjukkan gen tersingkir mungkin memainkan peran dalam
pembentukan pigmen. Strategi eksperimental yang pertama-tama mengidentifikasi
gen berdasarkan sifat molekulernya dan kemudian menyelidiki fungsinya dengan
membuat KO disebut genetika terbalik.Jelaskan bagaimana pendekatan ini
berlawanan (atau"berlawanan") dengan cara konvensional yang dilakukan ahli
genetika untuk mempelajari fungsi gen.
E10. Menurut metode yang dijelaskan pada Gambar 19.7,dapatkah rekombinasi
homolog yang menghasilkan penggantian gen menyebabkan integrasi TK dan NeoR?
gen? Jelaskan mengapa atau mengapa tidak. Jelaskan bagaimana TK gendan NeoR
gen digunakan dalam skema seleksi yang mendukung penggantian gen.
E11. Apa itu chimera? Bagaimana chimera dibuat?
E12. Bukti (lihat Shiels et al., “Analisis panjang telomer pada domba kloning,” Nature
399, 316–17) menunjukkan bahwa Dolly mungkin “lebih tua secara genetik” daripada
yang disarankan oleh usia sebenarnya. Seiring bertambahnya usia mamalia,
kromosom dalam sel somatik cenderung memendek dari telomer. Oleh karena itu,
individu yang lebih tua memiliki kromosom yang lebih pendek dalam sel somatiknya
dibandingkan dengan yang lebih muda. Ketika peneliti menganalisis kromosom dalam
sel somatik Dolly ketika dia berusia sekitar tiga tahun, panjang kromosomnya
konsisten dengan domba yang jauh lebih tua, katakanlah,sembilan atau sepuluh tahun.
(Catatan: Seperti yang dijelaskan dalam bab ini, domba yang menyumbangkan sel
somatik yang menghasilkan Dolly berusia enam tahun, dan sel susunya telah
ditumbuhkan dalam kultur untuk beberapa penggandaan sel sebelum sel susu dilebur
dengan oosit.)
A. Berikan penjelasan mengapa kromosom Dolly tampak begitu tua.
B. Misalkan Dolly pada usia 11 tahun melahirkan seekor domba bernama Molly;
Molly diproduksi secara alami (dengan mengawinkan Dolly dengan jantan normal).
Ketika Molly berusia delapan tahun, sampel sel somatik dianalisis. Berapa umur
kromosom Molly yang Anda harapkan,berdasarkan fenomena pemendekan telomer?
Jelaskan jawabanmu.
C. Diskusikan bagaimana pengamatan pemendekan kromosom, yang diamati di
Dolly, dapat mempengaruhi popularitas kloning reproduktif.
E13. Ketika organisme transgenik dibuat, transgen dapat berintegrasi ke beberapa
situs dalam genom. Selanjutnya,situs integrasi dapat mempengaruhi ekspresi gen.
Misalnya,jika transgen berintegrasi ke dalam daerah heterokromatik (yaitu, sangat
padat) dari kromosom, transgen tidak dapat diekspresikan. Untuk alasan ini, penting
bagi ahli genetika untuk menganalisis organisme transgenik sehubungan dengan
jumlah penyisipan transgen dan tingkat ekspresi transgen. Bab 18 menjelaskan tiga
metode (Southern blotting, Northern blotting, dan Western blotting) yang dapat
digunakan untuk mendeteksi gen dan produk gen. Manakah dari teknik ini yang akan
Anda gunakan untuk menentukan jumlah transgen pada tanaman atau hewan
transgenik? Mengapa penting untuk mengetahui jumlah transgen?
(Petunjuk: Anda mungkin ingin menggunakan hewan atau tumbuhan transgenik
sebagai bibit untuk menghasilkan lebih banyak hewan atau tumbuhan transgenik.)
Teknik mana yang akan Anda gunakan untuk menentukan tingkat ekspresi transgen?
E14. Apa itu molekuler pharming? Dibandingkan dengan produksi protein oleh
bakteri, mengapa hal itu bisa menguntungkan?
E15. Apa itu kloning reproduksi? Apakah kembar identik pada manusia dianggap
klon? Berkenaan dengan spesies pertanian, apa keuntungan potensial dari kloning
reproduktif?
E16. Para peneliti telah mengidentifikasi gen pada manusia yang (ketika mutan)
menyebabkan dwarfisme parah dan keterbelakangan mental. Kelainan ini diturunkan
secara resesif autosomal, dan alel mutan dikenal sebagai mutasi kehilangan
fungsi. Gen yang sama telah ditemukan pada tikus, meskipun versi mutan dari gen
tersebut belum ditemukan pada tikus. Untuk mengembangkan obat-obatan dan terapi
yang efektif untuk mengobati gangguan ini pada manusia, akan berguna secara
eksperimental untuk memiliki model tikus. Dengan kata lain, akan diinginkan
untuk mengembangkan galur tikus yang membawa alel mutan dalam kondisi
homozigot. Secara eksperimental,bagaimana Anda mengembangkan ketegangan
seperti itu?
E17. Pengobatan defisiensi adenosin deaminase (ADA) adalah contoh terapi gen ex
vivo. Mengapa terapi ini disebut ex vivo?Dapatkah terapi gen ex vivo digunakan
untuk mengobati semua penyakit keturunan? Menjelaskan.
E18. Jelaskan metode penargetan yang digunakan dalam terapi gen cystic fibrosis.
Asalkan CFTR gensampai ke sel paru-paru pasien, apakah Anda berharap ini menjadi
penyembuhan permanen bagi pasien, atau perlukah melakukan terapi gen ini secara
teratur (misalnya,bulanan)?
E19. Beberapa penelitian sedang dilakukan yang melibatkan penggunaan terapi gen
untuk menghambat pertumbuhan sel kanker. Seperti dibahas dalam Bab 22, onkogen
adalah gen mutan yang diekspresikan secara berlebihan dan menyebabkan kanker.
Terapi gen baru ditujukan untuk membungkam onkogen dengan memproduksi RNA
antisense yang mengenali mRNA yang ditranskripsi dari onkogen.Berdasarkan
pemahaman Anda tentang RNA antisense(dijelaskan dalam Bab 14 dan 15), jelaskan
bagaimana strategi ini akan mencegah pertumbuhan sel kanker.
Soal Diskusi/Kolaborasi Siswa
1. Diskusikan kelebihan dan kekurangan terapi gen. Karena dana yang tersedia
terbatas untuk penelitian terapi gen, buatlah daftar prioritas dari tiga penyakit teratas
yang akan Anda danai. Diskusikan pilihan Anda.
2. Straintersedia secara komersial P. syringae yang dipasarkan sebagai Frostban B
digunakan untuk memerangi kerusakan akibat embun beku. Ini adalahterjadi secara
alami Es yang– tekanan. Diskusikan keuntungan dan kerugian menggunakan strain ini
dibandingkan dengan versi rekombinan.
3. Buatlah daftar jenis sifat yang ingin Anda lihat diubah pada tumbuhan dan hewan
transgenik. Sarankan cara (yaitu, gen apa yang akan Anda gunakan?) untuk mencapai
perubahan ini.
GENOMIK I ANALISIS DNA
Istilah genom mengacu pada komposisi genetik total suatu organisme
atau spesies. Misalnya, genom nuklir manusia terdiri dari 22 autosom yang berbeda
dan kromosom X dan Y. Selain itu, manusia memiliki genom mitokondria terdiri dari
satu kromosom melingkar.
 Seiring kemajuan teknologi genetika selama beberapa dekade terakhir,
para peneliti telah memperoleh peningkatan kemampuan untuk menganalisis
komposisi genom sebagai satu kesatuan. Istilah genomik mengacu pada analisis
molekuler dari keseluruhan genom suatu spesies. Analisis genom adalah proses
diseksi molekuler yang diterapkan untuk satu set lengkap kromosom. Segmen
kromosom dianalisis dalam potongan-potongan yang semakin kecil, lokasinya
diketahui secara utuh kromosom. Ini adalah fase pemetaan analisis genom. pemetaan
dari genom akhirnya berkembang ke penentuan DNA lengkap urutan, yang
memberikan deskripsi paling rinci tentang genom suatu organisme pada tingkat
molekuler.
Pada tahun 1995, tim peneliti yang dipimpin oleh Craig Venter dan
Hamilton Smith memperoleh urutan DNA lengkap pertama dari genom bakteri dari
Haemophilus influenzae. Genomnya terdiri dari satumelingkar dengan panjang
kromosom 1,83 juta pasangan basa (bp) dan mengandung sekitar 1.743 gen (Gambar
20.1). Pada tahun 1996, seluruh urutan DNA pertama eukariota, Saccharomyces
cerevisiae (ragi roti), selesai. Pekerjaan ini dilakukan oleh konsorsium yang dipimpin
Eropa dengan lebih dari 100 laboratorium, termasuk beberapa di Amerika Serikat,
Jepang, dan Kanada. Koordinator keseluruhan adalah Andre Gof feau di Belgia.
Genom ragi mengandung 16 kromosom linier; 16 kromosom ini memiliki panjang
gabungan sekitar 12,1 juta bp dan mengandung sekitar 6.300 gen. Sejak saat itu,
urutan genom dari banyak prokariota dan eukariota telah diselesaikan.
Dalam bab ini, kita akan fokus pada metode yang bertujuan untuk
menjelaskan organisasi urutan dalam genom spesies. Proses ini dimulai dengan
pemetaan daerah di sepanjang kromosom organisme dan diakhiri dengan penentuan
urutan DNA lengkap. Kami akan mempertimbangkan tigapemetaan
strategisitogenetik, keterkaitan, dan pemetaan fisik - dan pendekatan yang digunakan
untuk melaksanakannya. Kami kemudian akan beralih untuk menjelajahi proyek
pengurutan genom, upaya penelitian yang memiliki tujuan akhir untuk menentukan
urutan basa DNA dari seluruh genom spesies tertentu. Kami akan mempertimbangkan
metode, tujuan, dan hasil dari usaha besar ini, yang mencakup Proyek Genom
Manusia.
GAMBAR 20,1 Sebuah peta lengkap genom bakteri Haemophilusinfluenzae. Di
bagian luar kromosom sirkular, penomoran nukleotida dimulai di bagian atas
lingkaran dan berlanjut searah jarum jam dalam peningkatan 100.000 nukleotida. Peta
tersebut juga menunjukkan lokasi situs enzim restriksi untuk NotI, SmaI, dan RsrII.
Seperti yang ditunjukkan pada kunci, kategori umum gen diberi kode warna.
Setelah urutan genom diketahui, peneliti dapat memeriksa, pada tingkat
banyak gen, bagaimana komponen genom berinteraksi untuk menghasilkan ciri-ciri
suatu organisme. Pendekatan ini disebut genomik fungsional. Pada akhirnya, tujuan
jangka panjang para peneliti adalah untuk menentukan peran semua protein seluler,
serta interaksi yang dialami protein ini, untuk menghasilkan karakteristik jenis sel
tertentu dan ciri-ciri lengkap organisme. Ini adalah area penelitian yang dikenal
sebagai proteomik. Dalam bab ini, kita akan mengeksplorasi genomik pada tingkat
DNA segmen dan urutan.Dalam Bab 21, kita akan mempertimbangkan prospek
menarik yang harus dimiliki oleh genomik fungsional dan proteomik menawarkan
tentang pemahaman masa depan kita tentang genetika.

20.1 SITOGENETIK PEMETAAN DAN KETERKAITAN

Dalam genetika, istilah pemetaan mengacu pada eksperimental proses
untuk menentukan lokasi relatif gen atau segmen DNA lain di sepanjang kromosom
individu.Peneliti dapat mengikuti tiga pendekatan umum untuk memetakan
kromosom: sitogenetika, keterkaitan, dan strategi pemetaan fisik.Sebelum kita
membahas pendekatan ini secara rinci, mari kita bandingkan satu sama lain. Pemetaan
sitogenetika (juga disebut pemetaan sitologi) bergantung pada lokalisasi urutan gen
dalam kromosom yang dipetakan secara sitogenetik relatif terhadap lokasi pita.
Sebagai perbandingan, dalam Bab 5 kami menggunakan frekuensigenetik
rekombinasi antara gen yang berbeda untuk menentukan jarakrelatifnya di dan
keteraturansepanjang kromosom. Pada eukariota, pemetaan keterkaitan melibatkan
persilangan di antara organisme yang heterozigot untuk dua atau lebih gen. Jumlah
keturunan rekombinan memberikan ukuran relatif dari jarak antara gen, yang dihitung
dalam unit peta (atau centiMorgans). Akhirnya, pendekatan ketiga adalah pemetaan
fisik. Teknik kloning DNA digunakan untuk menentukan lokasi dan jarak antara gen
dan daerah DNA lainnya.Dalam peta fisik, jarak dihitung sebagai jumlah pasangan
basa nukleotida antar gen.
Sebuah peta genetik adalah bagan yang menggambarkanrelatif lokasi dari
gen atau segmen DNA lainnya di sepanjang kromosom. Istilah lokus (jamak, lokus)
mengacu pada situs dalam peta genetik di mana gen tertentu atau segmen DNA
lainnya ditemukan. Gambar 20.2 membandingkan peta genetik yang menunjukkan
lokus untuk dua gen terkait X, sc (scute, gen yang mempengaruhi morfologi bulu) dan
w (gen yang mempengaruhi warna mata), pada Drosophila melanogaster. Pada peta
sitogenetik (atas), sc genterletak di pita 1A8, dan w genterletak di pita 3B6. Pada peta
keterkaitan, persilangan genetik menunjukkan bahwa kedua gen tersebut terpisah kira-
kira 1,5 unit peta (mu). Peta fisik menunjukkan bahwa kedua gen tersebut kira-kira
berukuran 2,4 × 106 bp terpisah satu sama lain sepanjang kromosom X. Korelasi
antara sitogenetik, keterkaitan, dan peta fisik seringkali berbeda dari spesies kespesies
dan dari satu wilayah kromosom ke wilayah lain.Misalnya, jarak mu 1 mungkin
sesuai dengan 1 hingga 2 juta pasangan basa di satu wilayah kromosom, tetapi
wilayah lain dapat bergabung kembali dengan kecepatan yang jauh lebih rendah, jadi
jarak 1 mu mungkin merupakan segmen fisik DNA yang jauh lebih panjang.
Pada bagian ini, kita akan mengeksplorasi beberapa teknik yang
ditujukan untuk menghasilkan peta sitogenetik dan keterkaitan dan
mempertimbangkan pemetaan fisik pada bagian berikut.
GAMBAR 20.2 Perbandingan peta sitogenetik, keterkaitan, dan fisik. Masing-masing
peta ini menunjukkan jarak antara sc dan w di gensepanjang kromosom X pada
Drosophila melanogaster. Peta sitogenetik adalah peta kromososm politen.

Tujuan Pemetaan Sitogenetik Adalah untuk Menentukan Lokasi Gen Sepanjang

Kromosom yang Utuh
Pemetaan sitogenetik umumnya digunakan pada eukariota, yang memiliki
kromosom sangat besar dibandingkan dengan bakteri. Secara mikroskopis, kromosom
eukariotik dapat dibedakan satu sama lain berdasarkan ukuran, lokasi sentromer, dan
pola pita (lihat Bab 8, Gambar 8.1). Dengan memperlakukan preparat kromosom
dengan pewarna tertentu, pola pita diskrit diperoleh untuk setiap kromosom. Ahli
sitogenetik menggunakan pola pita ini sebagai cara untuk menggambarkan daerah
tertentu di sepanjang kromosom.
Pemetaan sitogenetik mencoba untuk menentukan lokasi gen tertentu
relatif terhadap pola pita dari suatu kromo beberapa. Misalnya, gen manusia yang
mengkode regulator transmembran fibrosis kistik, protein yang rusak pada orang
dengan fibrosis kistik, terletak di kromosom 7, di tertentu situsdi wilayah q3.
 Pemetaan sitogenetik dapat digunakan sebagai langkah pertama dalam
lokalisasi gen pada tumbuhan dan hewan. Namun, karena itu bergantung pada
mikroskop cahaya, analisis sitogenetik memiliki batas yang cukup kasar resolusi.
Pada sebagian besar spesies, pemetaan sitogenetik hanya akurat dalam batas sekitar 5
juta bp sepanjang kromosom.Pada spesies yang memiliki kromosom polytene besar,
seperti Dro sophila, resolusinya jauh lebih baik. Strategi umum yang digunakan oleh
ahli genetika adalah secara kasar menemukan gen dengan analisis sitogenetik dan
kemudian menentukan lokasinya lebih tepat dengan fisik metode pemetaan dijelaskan
kemudian.

In situ HibridisasiDapat Melokalisasi Gen di Sepanjang Kromosom Tertentu

Teknik in situ hibridisasi banyak digunakan untuk memetakan lokasi gen
atau sekuens DNA lain dalam kromosom eukariotik besar secara cytogenetic. Istilah
in situ (dari bahasa Latin untuk "di tempat") menunjukkan bahwa prosedur dilakukan
pada kromosom yang ditahan di tempat—ditempelkan ke permukaan.
Untuk memetakan gen melalui in situ hibridisasi, peneliti menggunakan
probe untuk mendeteksi lokasi gen dalam satu set kromosom. Jika gen yang
diinginkan telah dikloning sebelumnya, seperti yang dijelaskan pada Bab 18, DNA
dari gen yang dikloning dapat digunakan sebagai probe. Karena untai DNA dari gen
kloning, yang merupakan bagian yang sangat kecil dari DNA relatif terhadap
kromosom, akan berhibridisasi hanya untuk urutan komplementernya pada kromosom
tertentu, teknik ini memberikan kemampuan untuk melokalisasi gen yang diinginkan.
Sebagai contoh, mari kita perhatikan gen yang menyebabkanmata putihgen fenotipe
pada Drosophila ketikatersebut membawa mutasi kehilangan fungsi. Gen ini telah
dikloning. Jika sepotong DNA kloning ini dicampur dengan Drosophila kromosomdi
mana DNA telah didenaturasi, ia hanya akan mengikat kromosom X di lokasi yang
sesuai dengan lokasi gen warna mata.
GAMBAR 20.3 Teknik fluoresensi in situ hibridisasi(IKAN). Probe berhibridisasi
dengan DNA kromosom yang terdenaturasi hanya pada situs komplementer spesifik
dalam genom. Perhatikan bahwa kromosom adalah kromosom metafase yang sangat
padat yang telah bereplikasi. Oleh karena itu, setiap kromosom berbentuk X
sebenarnya mengandung dua salinan gen tertentu. Ini adalah kromatid
bersaudara.Karena kromatid bersaudara identik, probe yang mengenali satu kromatid
bersaudara juga akan berikatan dengan yang lain.
 Metode paling umum in situ yang hibridisasimenggunakan probe DNA
berlabel fluoresen dan disebut sebagai fluoresensi in situ hibridisasi(IKAN). Gambar
20.3 menjelaskan langkah-langkah prosedur FISH. Sel-sel disiapkan menggunakan
teknik yang menjaga kromosom tetap utuh. Sel-sel diperlakukan dengan agen yang
menyebabkan mereka membengkak, dan isinya diperbaiki ke slide. DNA kromosom
kemudian didenaturasi, dan probe DNA ditambahkan. Misalnya, probe DNA yang
ditambahkan mungkin berupa DNA untai tunggal yang melengkapi gen tertentu.
Dalam hal ini, tujuan percobaan IKAN adalah untuk menentukan lokasi gen dalam
satu set kromosom. Probe akan mengikat ke situs di kromosom di mana gen berada
karena probe dan gen kromosom akan berbaris dan hidrogen ikatansatu sama lain.
Untuk mendeteksi di mana probe telah mengikat rating nukleotida berlabel biotin ke
dalam probe. Biotin, molekul kecil yang tidak berpendar, memiliki afinitas yang
sangat tinggi terhadap protein yang disebut avidin. Avidin berlabel fluoresen
ditambahkan, yang mengikat erat pada biotin dan dengan demikian memberi label
pada probe juga.
Bagaimana probe berlabel fluoresen terdeteksi? Molekul fluoresen adalah
molekul yang menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu dan kemudian
memancarkan cahaya pada panjang gelombang yang lebih panjang. Untuk mendeteksi
cahaya yang dipancarkan oleh probe berlabel fluoresensi, mikroskop fluoresensi
adalah digunakan. Mikroskop semacam itu mengandung filter yang memungkinkan
lewatnya cahaya hanya dalam rentang panjang gelombang yang ditentukan. Sampel
disinari pada panjang gelombang cahaya yang diserap oleh molekul fluoresen.
Molekul fluoresen kemudian memancarkan cahaya pada panjang gelombang yang
lebih panjang. Mikroskop fluoresensi memiliki filter yang memungkinkan transmisi
cahaya yang dipancarkan. Karena hanya cahaya yang dipancarkan yang dilihat, latar
belakang sampel menjadi gelap, dan fluoresensi terlihat sebagai warna yang bersinar
terang pada latar belakang yang gelap. Untuk sebagian besar percobaan FISH,
kromosom umumnya diwarnai dengan pewarna fluoresen yang khusus untuk DNA.
Pewarna yang paling umum adalah DAPI (4', 6-diamidino-2-fenil-indol) yang
dieksitasi oleh sinar UV. Ini memberikan semua DNA dengan latar belakang biru.
Hasil eksperimen FISH kemudian dibandingkan dengan sampel kromosom yang telah
diwarnai dengan Giemsa untuk menghasilkan pita, sehingga lokasi probe dapat
dipetakan relatif terhadap pola pita.
GAMBAR 20.4 Hasil in situ percobaan hibridisasifluoresensi. Dalam percobaan ini,
enam probe berbeda digunakan untuk menemukan enam lokasi berbeda di sepanjang
kromosom 5. Warna-warna tersebut disebabkan oleh pencitraakomputer dari emisi
fluoresensi; itu bukan warna sebenarnya darilabel fluorescent. Dua bintik biasanya
terlihat di setiap lokasi karena probe mengikat kedua kromatid bersaudara.
 Gambar 20.4 mengilustrasikan hasil percobaan yang melibatkan enam
probe DNA yang berbeda. Keenam probe adalah untaian DNA yang sesuai dengan
enam segmen DNA yang berbeda dari kromosom manusia 5. Dalam percobaan ini,
setiap probe diberi label dengan molekul fluoresen yang berbeda. Hal ini
memungkinkan peneliti untuk membedakan probe ketika mereka menjadi terikat ke
sesuai lokasi yang pada probe warna yang berbeda. Dengan cara ini,fluoresensi in situ
hibridisasi membedakan situs-situs di sepanjang kromosom 5 yang sesuai dengan
enam probe yang berbeda. Secara visual, warna-warni, teknik ini digunakan di sini
untuk menentukan urutan dan jarak relatif antara beberapa situs tertentu di sepanjang
satu kromosom. IKAN umumnya digunakan dalam penelitian genetika dan biologi
sel, dan penggunaannya telah menjadi lebih luas dalam aplikasi klinis. Sebagai
contoh, klinisi dapat menggunakan FISH untuk mendeteksi perubahan kecil pada
struktur kromosom seperti delesi dan duplikasi, yang mungkin terjadi pada pasien
dengan kelainan genetik.

Pemetaan Keterkaitan Dapat Menggunakan Penanda Molekuler Sekarang

Mari kita beralih ke pemetaan pertautan,yang bergantung pada frekuensi
keturunan rekombinan untuk menentukan arak antara situs yang terletak di sepanjang
kromosom yang sama. Metode pemetaan keterkaitan yang dijelaskan dalam Bab 5 dan
6 menggunakan perbedaan alelik antara gen untuk memetakan lokasi relatif gen
tersebut di sepanjang kromosom. Sebagai alternatif untuk pemetaan gen, ahli genetika
telah menyadari bahwa daerah DNA yang tidak mengkodekan gen dapat digunakan
sebagai penanda di sepanjang kromosom. Sebuah penanda molekuler adalah segmen
DNA yang ditemukan di situs tertentu di sepanjang kromo sebuah beberapa dan
memiliki sifat yang memungkinkannya untuk diakui secara unik menggunakan alat
molekul seperti polymerase chain reaction (PCR) dan elektroforesis gel. Seperti
halnya alel, penanda molekuler mungkin polimorfik; yaitu, dalam suatu populasi,
mereka dapat bervariasi dari individu ke individu. Oleh karena itu, jarak antara
penanda molekuler terkait dapat ditentukan dari hasil persilangan.Dengan
menggunakan teknik molekuler, para peneliti merasa lebih mudah untuk
mengidentifikasi banyak penanda molekuler dalam genom spesies tertentu daripada
mengidentifikasi banyak perbedaan alelik diantara individu. Untuk alasan ini, ahli
genetika semakin beralih ke penanda molekuler sebagai titik referensi di sepanjang
peta genetik. Seperti yang dijelaskan pada Tabel 20.1, berbagai jenis penanda
molekuler digunakan oleh ahli genetika.
Para peneliti telah membangun peta genetik terperinci di mana
serangkaian banyak penanda molekuler telah diidentifikasi di sepanjang setiap
kromosom spesies tertentu. Spesies ini termasuk manusia, organisme model,
spesies pertanian, dan banyak lainnya. Mengapa penanda molekuler berguna? Salah
satu alasan utama adalah bahwa penanda molekuler dapat digunakan untuk
menentukan perkiraan lokasi dari gen yang tidak diketahui yang menyebabkan
penyakit pada manusia. Seperti yang akan kita lihat dalam Eksperimen 20A,
penanda molekuler tertentu (RFLP) dikaitkan denganHbS alel yang menyebabkan
penyakit sel sabit. Demikian pula, untuk penyakit keturunan di mana gen mutan
belum diidentifikasi, ahli genetika manusia terkadang dapat mengikuti pola
transmisi penanda molekuler polimorfik dalam silsilah keluarga. Penemuan
penanda tertentu pada mereka yang mengidap penyakit dapat menunjukkan bahwa
penanda tersebut dekat dengan alel penyebab penyakit. Ini dapat membantu peneliti
mengidentifikasi gen dengan metode kloning, seperti berjalan kromosom, yang
akan kita bahas nanti dalam bab ini.
Selain itu, penanda molekuler dapat membantu peneliti mengidentifikasi
lokasi gen yang terlibat dalam sifat kuantitatif, seperti hasil buah dan berat daging,
yang berharga dalam pertanian.Penggunaan penanda molekuler untuk
mengidentifikasi gen tersebut dijelaskan dalam Bab 25 (lihat Gambar 25.7). Peta
genetik dengan jumlah besar penanda juga dapat digunakan oleh ahli biologi
evolusioner untuk menentukan pola variasi genetik dalam suatu spesies dan
keterkaitan evolusioner dari spesies yang berbeda.
 Semua jenis penanda yang dijelaskan pada Tabel 20.1 telah digunakan
dalam studi pemetaan keterkaitan. Untuk mencontohkan penggunaannya, pertama-
tama kita akan mempertimbangkan polimorfisme panjang fragmen restriksi
(RFLPs), tetapi strategi pemetaan serupa dapat diikuti untuk jenis penanda lainnya.
Seperti yang dibahas dalam Bab 18, enzim restriksi mengenali sekuens DNA
spesifik dan membelah DNA pada sekuens tersebut. Sepanjang kromosom yang
sangat panjang, enzim restriksi tertentu akan mengenali banyak situs. Misalnya,
enzim restriksi yang umum digunakan,ramah lingkunganRI, mengakui 5'-
GAATTC-3'. Secara kebetulan, urutan enam nukleotida ini diharapkan terjadi (rata-
rata) setiap 4–6 pangkalan, atau sekali dalamsetiap 4.096 pangkalan. Kromosom
yang terdiri dari jutaan nukleotida mengandung banyak ramah lingkungan Situs RI,
yang akan didistribusikan secara acak di sepanjang kromosom. Karena itu,ramah
lingkunganRI akan mencerna sebuah kromosom menjadi banyak bagian yang lebih
kecil dengan panjang yang berbeda.
 Ketika membandingkan dua individu yang berbeda,pencernaan DNA
kromosom oleh enzim restriksi yang diberikan dapat menghasilkan fragmen
tertentu yang berbeda panjangnya, meskipun fragmen tersebut ditemukan di lokasi
kromosom yang sama pada dua individu (Gambar 20.5). Dalam hal ini, ahli
genetika akan mengatakan ada polimorfisme dalam populasi sehubungan dengan
panjang fragmen DNA tertentu. Variasi ini dapat muncul karena beberapa alasan.
Di antara individu yang berbeda, perubahan genetik seperti penghapusan kecil dan
duplikasi dapat mengurangi atau menambahkan segmen DNA ke wilayah tertentu
dari kromosom. Ini cenderung terjadi lebih sering jika suatu wilayah berisi urutan
berulang. Atau, mutasi dapat mengubah urutan DNA dengan cara yang mengubah
situs pengenalan untuk enzim restriksi. Misalnya, pada Gambar 20.5, penghapusan
situs restriksi telah terjadi pada kromosom individu 2. Ini telah mengubah ukuran
fragmen DNA tertentu yang dihasilkan dari pencernaan.
 Gambar 20.6 mempertimbangkan penerapan analisis RFLP ke wilayah
kromosom pendek di antara tiga individu diploid. Karena sedikit perbedaan dalam
urutan DNA mereka, individu-individu ini bervariasi sehubungan dengan keberadaan
anramah lingkunganSitus RI ditampilkan dalam warna merah. Pada individu tertentu,
mutasi dapat mengubah urutan di situs ini sehingga tidak lagi dikenali.Dalam diploid
pesies, setiap individu memiliki dua salinan dari wilayah ini. Pada individu 1,
keduanya ramah lingkungan,sedangkan pada individu 2,keduanya tidak ada. Sebagai
perbandingan, individu 3 adalah heterozigot. Di salah satu kromosom, situs itu ada,
tetapi di yang lain, itu tidak ada.Dalam percobaan ini,DNA diisolasi dan kemudian
dipotong dengan ramah lingkungan. DNA dari individu 1 dipotong di enam lokas,
sedangkan individu 2 hanya memiliki lima lokasi pemotongan DNA. Pada individu 2
karena urutan DNA di wilayah ini telah diubah sehingga tidak lagi GAATTC dan
tidak dikenali.
Ketika mengalami elektroforesis gel, perubahan urutan DNA pada ramah
lingkunganSitus restriksi RI menghasilkan variasi ukuran fragmen DNA homolog.
Istilah polimorfisme, yang berarti banyak bentuk, mengacu pada gagasan bahwa
individuindividu dalam suatu populasi berbeda sehubungan dengan fragmen-fragmen
DNA tertentu ini. Seperti dicatat pada Gambar 20.6, tidak semua situs restriksi
bersifat polimorfik. Ketiga individu tersebut berbagi banyak fragmen DNA yang
ukurannya identik. Ketika segmen DNA identik di antara semua anggota
populasi, itu dikatakanmonomorfik (berarti satu bentuk). Sebagai aturan praktis,
segmen DNA dianggap monomorfik ketika lebih dari 99% individu dalam populasi
memiliki urutan identik pada segmen tersebut.
Pembahasan sebelumnya dimaksudkan sebagai gambaran umum tentang
fenomena RFLP. Namun, percobaan Gambar 20.6 adalah penyederhanaan teknis,
karena hanya mempertimbangkan wilayah DNA kromosom yang sangat pendek.
Dalam analisis RFLP yang sebenarnya,Sampel NA yang mengandung semua DNA
kromosom akan diperoleh dari ketiga individu tersebut. Pencernaan DNA kromosom
denganramah lingkungan RI kemudian akan menghasilkan begitu banyak fragmen
yang hasilnya akan sangat sulit untuk dianalisis. Untuk menghindari masalah,
Southern blotting digunakan untuk mengidentifikasi RFLP tertentu.

Gambar 20.7 mengilustrasikan eksperimen yang mempertimbangkan

kembali kromosom dari tiga individu yang dijelaskan pada Gambar 20.6. Untaian
DNA dari potongan DNA kloning yang merespons daerah dekat bagian
keempatramah lingkunganSitus RI digunakan probe radiolabeled dalam blot Selatan
DNA kromosom. Ketika noda terkena film sinar-X, kita hanya akan melihat pita DNA
yang dapat berhibridisasi dengan obe berlabel radio. Seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 20.7, individu 1 menunjukkan satu pita 000 bp, dan individu 2 memiliki
panjang pita 4.500 bp. Seperti yang dibantah sehubungan dengan Gambar 20.6,
perbedaan ini disebabkan oleh rasaramah lingkunganSitus RI pada individu 2.
Individu 3 memiliki kedua nd karena heterozigositas untuk ini ramah lingkungansitus
RI. Dalam ordo lain, heterozigot akan memiliki dua pita berbeda yang lebih
tipis.panjang t, sedangkan homozigot hanya akan menampilkan satu pita, karena
prosedur RFLP mendeteksi produk molekulsetiap kromosom. Dalam analisis RFLP
yang sebenarnya, peneliti harus menganalisis ratusan atau ribuan RFLP dengan
menggunakan kumpulan probe yang mengenali RFLP di seluruh genom.
Jarak Antara Dua RFLP Tertaut dan Ditentukan
Setelah kita memahami apa itu RFLP, mari kita pertimbangkan bagaimana FLP
dipetakan dan digunakan sebagai penanda kromosom.Dalam eksperimen pemetaan
nkage yang dijelaskan di Bab 5, kita belajar w hasil persilangan genetik digunakan
untuk memetakan jarak antara dua gen. Dalam jenis analisis tersebut, proporsi
keturunan dengan fenotipe rekombinan digunakan untuk menghitung jarak peta
antar gen. Demikian juga, kita dapat memetakan jarak antara dua RFLP dengan
membuat persilangan dan menganalisis keturunannya. Namun, dalam analisis RFLP,
kami tidak melihat karakteristik fenotipik keturunannya (misalnya, mata putih atau
sayap mini). Sebagai gantinya, kami mengisolasi DNA dari sampel jaringan dan
melihat pita DNA pada gel.
Gambar 20.8 menunjukkan contoh bagaimana pemetaan RFLP dilakukan. Misalkan
dua RFLP terletak di situs yang berbeda dalam genom. Satu RFLP dideteksi dengan
probe 1 dan menghasilkan pita 4.500 bp atau pita 6.500 bp. RFLP kedua dideteksi
dengan probe 2 dan menghasilkan pita 2.000 bp atau pita 1.500 bp. Dalam percobaan
Gambar 20.8, tujuannya adalah untuk menentukan apakah situs 4.500/6.500 dan
2.000/1.500 terhubung di sepanjang kromosom yang sama dan, jika demikian, untuk
menemukan jarak peta di antara mereka. Peneliti memulai dengan dua galur yang
homozigot: 4.500 dan 2.000 versus 6.500 dan 1.500. Strain ini disilangkan satu sama
lain untuk menghasilkan heterozigot. Heterozigot kemudian dapat disilangkan
menjadi homozigot yang hanya membawa 4.500 dan 2.000 pita. Ini analog dengan uji
silang dihibrid yang dijelaskan dalam Bab 5, di mana F1 heterozigot disilangkan
menjadi homozigot (lihat Gambar 5.9). Hasil persilangan ini tergantung pada apakah
RFLP terkait erat atau tidak. Jika suatu keturunan mewarisi pasangan fragmen seperti
tetua (4.500 bp dan 2.000 bp; 6.500 bp dan 1.500 bp), keturunan tersebut akan
menunjukkan fenotipe parental yang terdiri dari empat pita 4.500 bp, 2.000 bp, 6.500
bp, dan 1.500 bp atau dua. pita 4.500 dan 2.000 bp. Fenotipe rekombinan adalah
4.500, 2.000 bp, dan 6.500 bp atau 4.500, 2.000, dan 1.500 bp. Jika RFLP tidak
terhubung, kita akan mengharapkan rasio 1:1:1:1 dari empat jenis di antara
keturunannya. Jika RFLP terhubung, kami mengharapkan persentase keturunan yang
lebih tinggi dengan kombinasi fragmen induk. Gambar 20.8 menggambarkan hasil
dari 100 keturunan. Lebih banyak keturunan orang tua yang diamati, yang
menunjukkan bahwa RFLP terkait erat.
Dalam analisis data RFLP yang sebenarnya, peneliti secara bersamaan
menganalisis banyak RFLP dan memutuskan kemungkinan keterkaitan antara dua
RFLP dengan menggunakan uji statistik yang disebut lo (aku ogaritma dari od ds)
metode skor. Metode ini dirancang oleh Newton Morton pada tahun 1955. Meskipun
dasar teoretis dari pendekatan ini berada di luar cakupan buku teks ini, program
komputer menganalisis data yang dikumpulkan dari sejumlah besar silsilah atau
persilangan yang melibatkan banyak RFLP. Program menentukan probabilitas, atau
peluang, bahwa dua penanda menunjukkan tingkat keterkaitan tertentu (yaitu, berada
dalam jumlah unit peta tertentu yang terpisah) dan juga probabilitas bahwa data akan
diperoleh jika kedua penanda tidak terhubung. . Skor lod kemudian dihitung sebagai
rasio dari nilai-nilai ini:
Probabilitas tingkat keterkaitan tertentu skor banyak 5 catatan10 Probabilitas
bermacam-macam independen

Gambar 20.8 mengilustrasikan jenis pendekatan umum yang dapat diikuti peneliti
untuk memetakan penanda RFLP. Jika skor lod menunjukkan bahwa kedua penanda
ini terhubung, mereka akan menghitung jarak peta dengan membagi keturunan
rekombinan (7 + 9 = 16) dengan jumlah total (100) dan mengalikannya dengan 100,
untuk mendapatkan jarak peta 16 mu .

Peta RFLP Menjelaskan Lokasi Banyak RFLP Berbeda di Seluruh Genom

Seperti yang telah kita lihat, jarak peta antara dua RFLP dapat ditentukan dengan
menganalisis transmisi penanda RFLP dari orang tua ke keturunannya. Analisis
semacam itu dapat dilakukan pada banyak RFLP yang berbeda untuk menentukan
lokasi relatifnya di seluruh sebuah genom. RFLP cukup umum di hampir semua
spesies, sehingga ahli genetika dapat dengan mudah memetakan lokasi banyak RFLP
dalam genom. Peta keterkaitan yang terdiri dari banyak penanda RFLP disebut peta
RFLP. Gambar 20.9 menunjukkan peta RFLP tanaman yang disederhanakan
Arabidopsis thaliana (tanaman kecil dalam keluarga mustard), yang merupakan salah
satu organisme model favorit ahli genetika molekuler tanaman. Banyak RFLP telah
dipetakan ke lokasi yang berbeda di sepanjang limaArabidopsis kromosom.

Peta RFLP, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 20.9, dapat digunakan
untuk menemukan gen fungsional dalam genom. Sebagai contoh, masalah S2 yang
diselesaikan menggambarkan bagaimana analisis RFLP dapat digunakan untuk
memetakan gen yang memberikan resistensi herbisida. Seperti yang dijelaskan
selanjutnya, analisis RFLP juga dapat digunakan untuk menentukan kemungkinan
seseorang membawa alel penyebab penyakit.
GAMBAR 20 .9 Peta keterkaitan RFLP dari Arabidopsis thaliana. Tumbuhan ini
memiliki lima kromosom yang berbeda. Sisi kiri setiap kromosom menggambarkan
lokasi penanda RFLP. Angka-angka di sepanjang sisi kanan setiap kromosom adalah
jarak peta dalam satuan peta. Misalnya, 219 dan 235 adalah RFLP yang terletak
terpisah 9,9 mu pada kromosom 1. Penanda teratas di akhir setiap kromosom
ditetapkan secara sewenang-wenang sebagai titik awal (nol) untuk setiap kromosom.
Selain itu, peta menunjukkan lokasi beberapa gen yang diketahui (ditunjukkan dengan
warna merah):Ph.Ara.1 = fitokrom, Pada-24 = nitrat reduktase, Pada1511a/b = RNA
kecil ditemukan dalam biji, clv-1 = klavata-1, di3012 = alkohol dehidrogenase, Atc4
= aktin, eh = ereksi, gl-1 = glabra-1, GH1 = asetolaktat sintase, ap-2 = apelata-2,
CHS2 = kalkon sintase, Pada2105 = Protein penyimpanan benih 12S, dan tz = alel
yang membutuhkan tiazol.genGSifat-sifat Sebagai langkah pertama dalam memetakan
lokasi gen organisme, peneliti awalnya dapat menentukan lokasi RFLP di sepanjang
kromosom. Dalam hal ini, peneliti menentukan lokasi dari banyak situs ini di
sepanjangArabidopsis kromosom. Dengan memetakan situs RFLP ini, menjadi lebih
mudah untuk menemukan gen di dalamArabidopsis genom. Identifikasi gen
membantu peneliti untuk menjelaskan hubungan antara gen dan sifat.