www.

n
ature.c
om/
scienti
ficrepo
rts

BUKA

diterima: 12 Oktober 2015 diterima: 10 Desember 2015 Diterbitkan: 14

Januari 2016
Supercoiling DNA,

sinyal kritis mengatur

ekspresi basal dari

lac operondi

Escherichia coli

Geraldine Fulcrand , Samantha Dages , Xiaoduo Zhi , Prem

1,2 1,2 1,2

Chapagain ,1,3

Bernard S. Gerstman , David Dunlap & Fenfei Leng

1,3 4 1,2

Escherichia coli lac repressor (LacI) adalah faktor transkripsi

paradigmatik yang mengontrol ekspresi lacZYA di lac operon.
Protein tetrameric ini secara spesifik berikatan dengan O1, O2 dan
O3 operator
dari lac operondan membentuk loop DNA untuk menekan
transkripsi dariberdekatan lac yang promotor. Pada artikel ini, kami
menunjukkan bahwa setelah mengikat ke O1 dan O2 operatordi
posisi asalnya LacI
membatasi tiga (-) supercoil dalam loop DNA 401-bp dari lac
promotordan membentuktopologi penghalang. Stabilitas
hambatan topologi DNA yang dimediasi LacI berbanding lurus
denganDNA-nya
afinitas pengikatan. Namun, kami menemukan bahwa supercoiling
DNA memodulasi ekspresi basal dari lac operondi E. coli. Hasil kami
konsisten dengan hipotesis bahwa LacI berfungsi
sebagaitopologisupercoil
penghalanguntuk membatasibebas (tidak dibatasi-) yangdalam
loop DNA 401-bp dari lac promotor.dibatasi (-Supercoil yang) ini
meningkatkan afinitas pengikatan DNA LacI dan dengan demikian
represi promotor. Dengan demikian, pengikatan LacI dimodulasi
superhelically untuk mengontrol ekspresi lacZYA di operon lac
dalam berbagai kondisi pertumbuhan.
Escherichia coli lac operon adalah paradigma untuk transkripsi regul tiondi
prokariota Peraturan utama ulator adalah lac penekan(LacI) yang
1,2.
secara spesifik mengikat ke operator di daerah lac promoter dan
menghambat transkripsi dari lac promotordengan tidak adanya
induser . Ada tiga operator: O1 primer
4
operaloc located 11 bp
downstream dari situs transkripsi-mulai dari lac promotor dan dua
sebuahuxiliary O2 dan O3 opertors LOCsebuahted at 412 dan - 82 bp,
respectively, of itu promoter region . Sejak only about sepuluh copies of LacI
4
tetramer are simultaneously present di setiap E. coli sel , itu function of O2
5
dan O3 aku s untuk incrkemudahan itu lokal konsentrasiLacI di sekitar lac
promoter dan karenanya meningkatkan efisiensi represi . Bagian ond
6 4,7
regultoradalah cAMP-CRP kompleks (CRP mengacu pada protein
reseptor cAMP) thsebuahtmengikat CRPpengikatan situscentered posisit
- 61,5 bp hulu dari situs awal transkripsi lac promotor .
IkatanCAMkompleksP-CRP ke situs pengikatannya di lac
promotorsangat mengaktifkan inisiasi transkripsi dari promotor E.
coli lac . Penghapusan crp dari kromosom atau situs CRP mengikat
9
dari lac promotor greatly reduced sang promoter strength di presence of
Ilmiah RepoRts | 6: 19243 | DOI: 10.1038 / srep19243
sebuah inducer . Ini dual control of itu lac promoter by LacI dan CRP
10,11
Ensures yang maksimal reprEssion di itu ketiadaan of sebuah inducer . 12
However, kapan glucose tingkat aku s low dan laktosa tingkat aku s tinggi, itu
operon aku s sepenuhnya Activsebuahted13,14.
Dalam Escherichia coli, DNA biasanya (-) supercoiled . Bahkan, 15-17
DNA supercoil memainkan peran penting dalam
beberapa essential DNA metabolisme pathways, seperti DNA replication,
transcription, dan recombinsebuahtion15-17. DNA supercoil juga terlibat
dalam regulasi lac. operon Sebagai contoh, telah dibuktikan bahwa
negative supercoiling meningkatkan bINDING of LacI untuk lac operators 18,19
dan mempromosikan Lac-mediated DNA loop- ing20-22.
SebuahdditioNally, Laci induces supercoiling apakahsayakurus? itu LacI-
lac O1 complexes and retains certain superhelical energi di itu complexes
juga18,23,24. Recently, kita shomenikah that binding of LacI tetramer untuk
berduaan copies of lac O1 operators di different locsebuahtions of Sebuah
DNA molekul pisahkansebuahted Sebuah supercoiled DNA molekul
sayatidak dua topologi- dihabiskan independent, looped doinduk25. Ini
supercoiled doinduk are sangat stabil dan supercoils membaur thro ugh
3
LacI loop closure wengan Sebuah setengah hidup of 112 min . SEBUAH 25
topological pembatas model di yang nUcleoprotein complexes confine
DNA supercoils untuk terlokalisasi regions aku s consistent wengan ini
1,4
results . Ini results juga LED kami untuk pose follosayap questions: Sayas
25
LacI sanggup untuk form topologi hambatan dan constrain supercoils di itu
lac promotor region
1Institut Ilmu Biomolekuler, Universitas Internasional Florida, Miami, FL 33199.
2Departemen Kimia & Biokimia, Universitas Internasional Florida, Miami, FL
8
33199. Departemen Fisika, Universitas Internasional Florida, Miami, FL
3
33199. Departemen Fisika, Emory University, Atlanta, GA 30322.
4
Korespondensi dan permintaan materi harus ditujukan ke FL (email:
lengf@fiu.edu)
1
 www.nature.com/scientificreports/

t (mnt)
1/2

–IPTG b
+ IPTG b

pCB126 1 0,87 ± -
0,33
pCB115 2 112 ± 0,38 ±
28 0,18
pCB116 4 120 ± 53 ±
39 14
pCB108 8 168 ± 225 ±
51 79
pCB109 16 134 ± 242 ±
57 82

Tmampu 1. Half-hidup (t1/2) dari Diantara media, DNA topologi hambatan untuk plasmid mengandung lac
O1
operators di dua berbeda LOCsebuahtions . Semua plasmid contain berduaan copies of lac O1 operator di
a

dua different locsebuahtions. b setengah hidup (t1/2) adalah ditentukan according untuk itu procedure seperti
yang dijelaskan di bawah Metode.

upon binding untuk itu O1, O2, dan O3 opertors at mereka native positions? Jika so, adalah seperti itu trapped
superhelicity biolog- ically significant? Here memanfaatkan combined seorangpprmenyambar of biookimia
pantatsebuah,ys bakteri genetika, dan atomic fatauce microscopy, kita show that upon simultaneously binding itu
O1 dan O2 opertors LacI forms Sebuah topological penghalang thatmembagi sebuah molekul DNA plasmid
superkoil mengandung lac daerah promotoruntukberbeda topologi domins. We juga iblisstrate that DNA
supercoiling aku s an important modulator of itu dr dasarnya level of gen expres- sion from itu lac operon dan that itu
Lac-mediated topologi pembatas plays sebuah essential role di ini process.
Hasil
Stabilitas hambatan topologi DNA yang dimediasi LacI berkorelasi dengan afinitas pengikatan
DNA mereka. Hasil kami sebelumnya shomenikah thduat tetramer Laci terikat pada fou rlac O1 opersebuahtor
dari plasmid pCB115 dan membentuk dua sangat stabilLacI- lacO1 nukleoprotein Kompleks Ini 25.

membentuktopologi penghalang dan terbagi itu supercoiled DNA molekul sayatidak dua topological doinduk,
Sebuah sobek & relaxed doutama dan domain supercoiled . Dengan menggunakanserupa
25

suatuyangpendekatan(Supplementary Gambar. S1), kami menentukan stabilitas LacI-. mediated topological

hambatan for plasmid pCB116, pCB108, dan pCB109 that contain, respectively, 8, 16, dan 32 lac O1 opertors di
dua different locsebuahtions berjarak ~ 1.2 nd 2.9 kb apart (Supplementary Ara. S2). Sayan itu ketiadaan of IPTG, itu
multiple Lac-mediated topologi hambatan hve sama t of ~ 120 min (Tmampu 1 dan Supplementary Gbr. S3a – c).
1/2

Only Excepti on adalah DNA topologi penghalang for plasmid pCB126 with di dari 0,87 ± 0,33 min yang
1/2

dihasilkan dari pengikatan satu molekul LacI ke dua operator O1 lac (Tabel 1). Intriguingl y,bahkan di
hadapan IPTG, Laci mampu membentuk beberapa LacI-lacO1 complexesdan difusi blok supercoil(Tmampu 1
dan Tambahan Gambar. S3D-g). Hasil ini menunjukkan bahwa IPTG tidak mampu memisahkan LacI dari
tandem copies of lac O1 operators, yang aku s consistent wengan previously diterbitkan results . Sayan atauder
26

untuk mendeteksi dan tentukan itu stability of Lac-mediated topologi hambatan for plasmid pCB126 that telah
tunggal copies of lac O1 opersebuahtor (Gbr. 1a), significantly more Nt.BbVCI digunakan, yang mampu nick more
dari 90% dari supercoiled pCB126 molekul apakahsayakurus? 5 seconds (Ara. 1b dan Supplementary Ara. S4a, b).
Sayan ini way, kita ditentukan itu t1/2 o f topologi pembatas mediated by satu LacI tetramer untuk menjadi 52 ± 12
dtk (0,87 ± 0,33 min) (Ara. 1c, d dan Tmampu 1). Sebuahpemikiran itu t1/2 of itu Lac-mediated topologi penghalang
on pCB126 aku s significantly lower dari tht of itu mul- tiple Laci-mediated hambatan topologi, one Laci
tetramer ada hubungan yang signifikan tly diblokir supercoil diffusion, yang oth- keliru akan menjadi on itu
atauder of milidetikonds27,28.
Selain itu, kami membuat serangkaianDplasmidtemplatNAyang berisi pasangan O1, O2, O3, dan Os yang
berbeda. operator (Tambahan Gambar. S2; Os mewakilisimetris lac operator ). Kami kemudian menentukan
29

t1/2 val- ues dari hambatan topologi yang dimediasi LacI untuk template DNA ini. Hasil kami di T mampu 2
jelas menunjukkan Strat bahwa stabilitas hambatan topologi Laci-dimediasi berkorelasi dengan afinitas
Laci mengikat untuk different lac opersebuahtor (supplementary Gambar S4C, d dan SupplemeS5;.. ntary Gambar
Supplementary Tmampu S1) . Fatau contoh, t1/2 hambatan topologi Laci-dimediasi pada mengikat dua Os
operatorpada pOsOs ditentukan untuk menjadi 29.1 ± 4.6 min (Supplementary Ara. S5 dan Supplementary
Tmampu S1). Sayan contrast, itu t1/2 of penghalang topologi Laci-dimediasi untuk duaO3 operatorpada
pO3O3 bertekad untuk menjadi hanya sekitar 5,5 ± 1.2 detik. Kami juga menentukan nilai t1/2
dariDNhambatan topologiA yang dihasilkan dari pengikatanLacI mutan LacI-Gly + , LacI-Gly + , LacI-
30 58 1 60 1

Gly + , dan LacI-Gly + ke duaOs situsdi pOsOs. Sekali lagi,kami hasilmenunjukkan thtt1/2 nilai-nilai Laci-
60 2 60 3
 mediated hambatan topologi skala proporsional dengan DN A bINDING Affiniikatan of ini LacI mutants
(Supplementary Tmampu S2).
LacI membentuk penghalang topologi DNA pada pengikatan operator lac di lac operon. We
con- terstruktur three unique plasmid harboring itu ntUral lac promoter termasuk dalamg eithere active or mutated
O1, O2, nd O3 t mereka native positidis (Ara. 2 nd Supplementary Ara. S6). We juga sayanserted Sebuah nicking
endonuclease Nt.BbVCI situs pengakuan antara O1 dan O2 opersebuahtor. Mbijihotelahr, kami membuat dua
plasmid DNA teMPLsebuahtes, pOsOs401 dan pOsOs493, dengan dua Os opersebuahtor menggantikan baik
O1 & O2 opersebuahtor dari plasmid pO1O2n atau O2 & O3 opersebuahtor dari plasmid pO3O2n
(TambahanGambar Gbr. S6). Setelah pembangunan plasmid ini, kita employed DNA-nicking uji untuk menguji
stabilitas hambatan topologi Laci-dimediasi dan untuk menentukan bagaimana manusia y superkumparan
kamire trapped di 401 dan 493 bp DNA loop pada bentuktionhambatan topologi (dalamiesensial supercoiling
sarangity of ini plasmid DNA templates adalah approximsebuahtely - 0,06). Kami results are shown dalam Fig. 2b,
Supplementary Ara. S7, dan Tmampu 2. As diharapkan, LacI adalah sanggup untuk form topological hambatan upon
binding untukO1, O2,dan O3 di posisi asli mereka dan membagisuperkoil DN molekulA menjadi dua
independen topological domains, Sebuah supercoiled domain nd Sebuah nicked, relaxed domain (Ara. 2c). LacI
adalah juga able untuk trap ~ 3 ke 4 (-) supercoils apakahsayakurus? itu 401 dan 493 bp DNA loop, rkhusus
(Ara. 2b dan Supplementary Ara. S7; Tmampu 2).

Ilmiah RepoRts | 6: 19243 | DOI: 10.1038 / srep19243 2

 www.nature.com/scientificreports/

Angka 1. Satu molekul dari LacI tetramer terbagi Sebuah supercoiled DNA molekul plasmid pCB126 dito
dua independen topologi domain. (a) Plasmid pCB126 membawa dua lac O1 operators di dua different
loctions adalah constructed sebagai rinci dalam M.ethod (b) Itu nicking enzim Nt.BbvCI adalah sanggup untuk
rapiseng intisari pCB126. Time tentu saja of enzim digestion of pCB126 menggunakan 16 units of Nt.BbvCI di
1 × NEBuffer 4 at 37 ° C.
Jalur 1 contained itu tidak tercerna scDNA. (c) Time tentu saja of DNA supercoiling diffusion di itu presence of
LacI. Itu DNA-nicking pantatsebuahys kamire Performed seperti yang dijelaskan di bawah Methods. Setiap reaction
mixture (320) μ L)
contained 0,156 nM of pCB126, 2.5 nM of LacI, dan 16 units of Nt.BbvCI. Itu reactions kamire incubated at
37 ° C for itu waktu indeks telah tercapai. Kemudian Sebuah besar kelebihan of Sebuah beruntai ganda
oligonukleotida contain sebuah Nt.BbvCI
recognition site adalah ditambahkan untuk itu reaction mixture untuk inhibit itu restriction enzim
aktivitassayamengikat. Itu dijuluki
DNA templates kamire ligated by T4 DNA ligase di itu presence of 1 mM of SebuahTP at 37 ° C for 5 min dan
reactions kamire terminated by fenol extraction. Itu DNA molekul kamire isolated dan mengalami untuk agarose
gel memilihrophorESIS. (d) Quantificsebuahtion analisis of itu waktu tentu saja Itu Pertcentage of supercoiled DNA
adalah berkomplot melawan itu reaction waktu. Itu melengkung adalah generated by fitting itu data untuk Sebuah
1statauder rmakan equation untuk menghasilkan Sebuah rate constant of 0,016 detik-1 dan Sebuah t1/2 of 52 detik.

Supercoils
terkendala di
DNA-
lingkaran
pOsOs49 493 56.1 ± 3.79 ± 0,31
3 bp 7.6
pOsOs40 401 46.8 ± 2.5 ± 0,27
1 bp 7.9
pO3O2O1 493 1.10 ± 3.38 ± 1.17
bp 0,15
pO3O2n 493 0,35 ± 3.45 ± 1.10
bp 0,02 b

pO1O2n 401 1.41 ± 2.77 ± 0,65

bp 0,24
 Tmampu 2. Ukuran dari itu DNA loop dan itu jumlah dari supercoils dibatasi oleh itu LacI-mediated DNA
Topologi penghalang. a ukuran of itu DNA-loop refers untuk itu shorter DNA-loop antara itu dua lac operators.

b t1/2 menggunakan pO3O2n adalah estimasiated according untuk itu DNA nicking metode seperti yang dijelaskan di

bawah Metode.
Considering itu efisiensi of restriction digestion dan DNA ligation reactions, itu standard devisebuahtion my
menjadi much lebih besar dari that reported di ini meja.

Sayantriguingly, itu stability of itu Lac-mediated topological hambatan quantified by itu expsatuntial decay
constants for itu diffusion of supercoiling (t ) kamire inversely related untuk itu ukuran of itu sobek doutama. For
1/2

contoh, itu t dari Laci-mediated penghalang topologi untuk pO1O2n dengan 401 bp sobek domain secara
1/2

signifikan gredaripadater thtuntuk pO1O2 dengan 1,2 kb sobek domain (Tmampu 2 dan Supplementary Tmampu
S1). Hasil ini consistent wengan kami recent results for λ repressor mediated topologi hambatan .31

Kami juga menggunakan mikroskop kekuatan atom (AFM) untuk memeriksa bagaimana satu molekul
LacI membagi molekul DNA superkoil menjadi dua domain topologi independen. Kami menggunakan
plasmid pOsOs401 supercoiled danpemberian metodeDNA untuk penelitian AFM kami. Setelah
supercoiled pOsOs401 dijuluki olehNt.BbvCI dalam Setelah LacI, kompleks LacI-plasmid diendapkan pada
permukaan mika yang baru saja dibelah dan dicitrakan. Hasil kami, diringkas dalam Gambar. 2c dan Tabel
3, jelas menunjukkan bahwa satu molekul LacI mengikat ke lac

Ilmiah RepoRts | 6: 19243 | DOI: 10.1038 / srep19243 3

 www.nature.com/scientificreports/

Angka 2. LacI adalah sanggup untuk bentuk Sebuah DNA topologi pembatas atas mengikat untuk itu O1 dan O2
operators at
mereka native posisi dan memaksa 3 supercoils untuk itu 401 bp DNA lingkaran. (a) Plasmid pO1O2n
membawa yang lac O1 dan O2 operators at mereka native positions of itu lac promotor adalah constructed
sebagai rinci dalam Metode.
(b) Itu DNA-nicking pantatsebuahys (waktu tentu saja) menggunakan supercoiled plasmid pO1O2n (σ = ~- 0,06)
kamire Performed
seperti yang dijelaskan di bawah Methods. Itu reaction mixtures di itu presence of LacI kamire incubated at 37 ° C for
itu waktu indekstercapai. Itu DNA topoadalahomers kamire isolated dan mengalami untuk agarose gel
terpilihrophorESIS di itu presence of
1.5 μ g / ml of klorokuin. LacI adalah sanggup untuk constrain 2.8 ± 0,7 supercoils apakahsayakurus? itu 401 bp
Lac-mediated DNA loop. (c) AFM gambar demonstrmakan that LacI terbagi Sebuah supercoiled DNA molekul
(plasmid pOsOs401) inke
dua independent topologi doinduk: Sebuah 401 bp relaxed doutama dan Sebuah besar supercoiled doutama. Itu
AFM
Pencitraan experiments kamire Performed seperti yang dijelaskan di ref.25. Itu baiklaht panel aku s Sebuah dilacak
gambar alongside
original gambar (kiri panel) indeksating itu supercoiled doutama (blue jejak), itu 401 bp relaxed doutama (red
melacak), dan itu LacI molekul (berteriakow oval).

DNA

urutan
panjan
g
nm bp bp
Full 1584.4 ± 4660 ± 4595
panjangnya 78.2 230 a

Rx domain b
1441.2 ± 4239 ± 4194
50.3 148 a

Sc domainc 140.9 ± 414 ± 401

23.8 70a
 Tmampu 3. DNA contur panjangnya dari pOsOs401 di itu kehadiran atau ketiadaan dari LacI. a measured DNA
contour panjangnya di bp kamire hitungated wengan itu Assumption of itu standard Bform DNA for itu plasmid;
yaitu
menggunakan Sebuah naik of 0,34 nm per mendasarkan pair. Rx doutama represents itu relaxed DNA doutama.
b
Sc
c

domain represents supercoILED doutama.

opertors at itu native positions terbagi Sebuah supercoiled DNA molekul sayatidak dua independent topological
domain. Akun tidak adanya Laci, corata-ratapanjangntourdariDNmolekulA diukur untuk menjadi 1,584.4 ± 78.2 nm
(Tmampu 3). Untuk B-form DNA dengan 0,34 nm per bp, panjang inidihitung menjadi 4.660 ± 230 bp,yang
msebuahtches panjang urutan plasmid dari 4595 bp. Molekul LacI membagi molekul DNA menjadi 1.441.2 ± 50.3 nm
(4.239) ± 148 bp) supercoiled doutama dan Sebuah 140.9 ± 23.8 nm (414 ± 70 bp) relaxed doutama. Ini panjangnya are
con- sistent wengan Estimsebuahtes berdasarkan on itu DNA urutan of itu dua topologi doinduk (Tmampu 3).
Supercoiling DNA adalah sinyal penting untuk mengontrol ekspresi basal lac operonpada E.
coli. Although LacI aku s known untuk secara sterik repress transcription, saya t aku s not obviokita that saya t
should bertindak sebagai a topolog- ical barrier. Satu possibility aku s that LacI menggunakan ini unique
functionality untuk trap free, unconstrained supercoils within

Ilmiah RepoRts | 6: 19243 | DOI: 10.1038 / srep19243 4

www.nature.com/scientificreports/

Angka 3. Itu dr dasarnya ekspresi dari β-galactosidase di itu ketiadaan dari sebuah induser untuk E. coli tipe liar
regangan
MG1655 dan itu isogenik topA ketegangan VS111. (a) Itu β -galactosidase aktivitassayamengikat of MG1655 dan
VS111
di ketiadaan of sebuah indrUCE. Overnight cultures of E. coli sel kamire diencerkan 100 kali lipat di LB dan grown untuk
sebuah
OD600 of 0,2, dan keledaiayed for β -galactosidase aktivitassayamengikat (Miller's units). Hitam squares dan circles
represent
β -galactosidase aktivitassayamengikat of MG1655 dan VS111, respectively. (b) Western mengotori for itu dr dasarnya
expression of
β -galactosidase for MG1655 (teratas panel) dan VS111 (bottom panel) di itu ketiadaan of sebuah indrUCE. Di atast

cultures of E. coli sel kamire diencerkan 100 kali lipat dan grown untuk sebuah OD600 of 0,5. Itu barat mengotori
experiments kamire Performed seperti yang dijelaskan di bawah Methods. (c) Plasmid pZXD133 adalah
constructed seperti yang dijelaskan dalam Metode. Itu lacZ dan cemaraefly luciferase (luc) gen kamire dibawah
itu control of P dan P respectively. Itu bersayap segitiga represent itu Rho-indepepndent E. coli rrnB T1
T7A1 / O4 leu-500

transcription terminators. (d) Itu β -galactosidase

activiikatan of MG1655 (DE3)Δ lacZ dan VS111 (DE3)Δ lacZ dilakukan plasmid pZXD133, pZXD145, or
pZXD146 dalam itu ketiadaan of sebuah indrUCE. Plasmid pZXD133, 145, dan 146 membawa satu of itu IPTG-
diinduksi promoters (in itu atauder of turun strength) P , P , dan P , respectively, yang control itu
T7A1 / O4 tac lacUV5

expression of
lacZ. Overnight cultures of E. coli sel kamire diencerkan 100 kali lipat dan grown untuk sebuah OD600 of 0,2, dan
keledaiayed for
β -galactosidase aktivitassayamengikat. Itu hitam dan Buka columns represent itu β -galactosidase
aktivitassayamengikat of MG1655
dan VS111, respectively. Itu promotor that control itu expression of lacZ are berlabel (e) Western blotting
for itu dr dasarnya expression of β -galactosidase for MG1655 (DE3)Δ lacZ/ pZXD133 (teratas panel) dan VS111
(DE3)
Δ lacZ/ pZXD133 (bottom panel) di itu ketiadaan of IPTG. Itu barat mengotori experiments kamire Performed
seperti yang dijelaskan dalam M.ethod (f) Itu dr dasarnya expression of β -galactosidase di itu ketiadaan of sebuah
inducer for E. coli saring FL1130 (MG1655 (DE3)Δ lacZ attnT7 :: P -lacZ P -luc) dan FL1131 (VS111
T7A1 / O4 leu-500

(DE3)Δ lacZ attnT7 :: P O4-lacZ Pleu-500-luc). Overnigh t cultures of E. coli sel kamire diencerkan 100 kali lipat
T7A1 /

dan grown untuk sebuah OD600 of 0,2,

dan keledaiayed for β -galactosidase aktivitassayamengikat. Hitam squares dan red circles represent β -
galactosidase aktivitassayamengikat of
FL1130 dan FL1131, respectively.
 401 bp DNA loopyang lac mempromosikanr,meningkatkan Laci DNA-binding afinitas dan karena itu 18-20,26,

meningkatkan promotor inhibition. Sayan ini way, Laci my modulmakan itu expression of lACZYA di itu lac operon
across Sebuah berbagai macam untuk respond untuk bervariasi grodengan conditions. Sayan lain watauds, DNA
supercoiling my regulmakan itu dr dasarnya expres- Sion dari lac operon in vivo. Akufini hypothesis benar, ekspresi
basal lacZ(β -galactosidase) harus lebih tinggi for Sebuah tipe liar E. coli ketegangan (MG1655) dari for Sebuah
topA mutant ketegangan (VS111) sejak kedua chromosomal dan plasmid DNAsare more(-)supercoILED
dimutastrainnt daripada di tipe liar strain .kami rEsults pada Gambar. 3a, b clearly demonstrated that itu dr
32,33

dasarnya tingkat expression of β -galactosidase di itu ketiadaan of an inducer (seperti IPTG) memang lebih tinggi
untuk MG1655. Dalamtriguingly,ekspresi basal β -galactosidase lebih tinggi untuk E. coli sel at itu akumakan
expsatuntial tahap than that at itu early expsatuntial tahap untukr both MG1655 nd VS111 (Ara. 3a, b). Akuf above
hypothesis adalah corrdll, DNA harus more(-)supercoILED texp awalsatufase ntial dari tht t itu late bukantial
phase. Sayan order untuk sebuahswer ini question, we exaranjau itu supercoiling status of several plas- mids, yaitu,
pBR322, pUC18, pACYC177, dan pACYC184 di MG1655 dan VS111 di awal dan akhir exponenTial

Ilmiah RepoRts | 6: 19243 | DOI: 10.1038 / srep19243 5

www.nature.com/scientificreports/

Angka 4. Time kursus dari DNA supercoiling stpadakita di MG1655 (a,b) dan VS111 (c,d). Overnight cultures
of E. coli sel membawa plasmid pBR322, pUC18, pACYC177, or pACYC184 kamire diencerkan 100 kali lipat di
LB dan
grown untuk itu waktu points indeks telah tercapai. Itu DNA molekul kamire isolated menggunakan itu basa
lisis pantatsebuahys menggunakan
QIAprep Spin Miniprep Kitu. Itu DNA samples kamire mengalami untuk 1% agarose gel terpilihrophorESIS di itu
presence of 5 μ g / mL of klorokuin. Itu DNA supercoiling sarangsayaikatan kamire ditentukan secara terperinci
dalam M.ethod
simbol of (-) represents hypernegsebuahtively supercoiled DNA.

fase. Hasil kami ditunjukkan pada Gambar. 4. Untuk MG1655, plasmid DN A templates lebih (-) supercoiled dant
awal expsatuntial tahap dari itu at itu akumakan expsatuntial tahap. For contoh, itu Ini sangatheboh sarangity of
plasmid pBR322 di expone awal nfaseesensial bertekad untuk menjadi - 0,076 dan berkurang ke - 0,062tlate expo-
fase fase (Gbr. 4a, b). Untuk VS111,seperti yang diharapkan, pada fase eksponensial awal, 80-90% dari
plasmid pBR322 dan pACYC184 menjadi hypernegsebuahtively supercoiled (Gambar. 4c, d), yang merupakan
consistent dengan sebelumnya diterbitkan results . However,kurang thn 50% of ini dua plasmid kamire
32,34

hypernegsebuahtively supercoiled at itu akumakan expsatunesensial fase (Ara. 4c, d). Ini results suggest that Sebuah
correlation ada taruhanween itu DNA supercoiling status nd itu basal expression of β -galactosidase di E. coli.
Untuk mempelajari lebih lanjut bagaimanaDN A mengatur ekspresi basal β supercoiling-galactosidase,
kami terstruktur two E. coli strains MG1655 (DE3)Δ lacZ nd VS111 (DE3)Δ lacZ di yang lacZ adalah dihapus from itu
chro- mososaya using itu λ Merah recombination sistem . SebuahdditioNally, ini two E. coli strains carry itu
35

lysogenic λ DE3 that harbors itu lacI gen dibawah itu control of itu strong lacI promoter untuk overexpress esLacI.
q

We juga constructed three plasmid pZXD133, 145, nd 146 carrying satu of itu IPTG-diinduksi promoters (di itu
order of descending strength) PT7A1 / O4, P , dan P , dengan hormaty, yangdapatmengendalikan ekspresi lacZ
tac lacUV5

(Gbr. 3c). We berubah MG1655 (DE3)Δ lacZ dan VS111 (DE3)Δ lacZ dengan tiga plasmid ini dan menguji β
kegiatan -galactosidase menggunakan Miller'spantaty dan Wblotting estern. Hasil kami ditunjukkan pada
Gambar. 3d, e. Mirip dengan hasil di atas,basal ekspresi β -galactosidase tanpa adanya induser lebih
tinggi untuk MG1655 daripada untuk VS111. Sejak promotor IPTG-inducible ini tidak mengandung CRP
(cproteintabolite represor) situs pengikatan, ini expe r Iments mengesampingkan kemungkinan bahwat ekspresi
basal ditingkatkan dari β -galactosidase adalah csuatuyang digunakan oleh pengikatankompleks CRP-cAMP
 ke situs pengikatan CRP hulu dariyang lac mempromosikanr. Sebuahdditionally,kita dimasukkan lacZ
bawah kendali PT7A1 / O4 di ttTN7 situs(84 min) dari kromosom MG1655 (DE3) Δ lacZ dan VS111 (DE3)Δ lacZ
using Sebuah transposon TBerbasisn7 metode nd diuji itu β -galactosidase bertindakivities using Miller's pantaty.
36

Sebuahkeuntungan, our results (Ara. 3f) shomenikah that itu dr dasarnya expression of β -galactosidase di itu
ketiadaan of sebuah inducer adalah lebih tinggi for MG1655 dari that for VS111.

Ilmiah RepoRts | 6: 19243 | DOI: 10.1038 / srep19243 6

www.nature.com/scientificreports/

Diskusi
Pada artikel ini kita demonstrtetht E. coli Laci mampu membentuk penghalang topologi pada mengikat O1,
O2, dan O3 operators of itu lac promotor at mereka native positions dan terpisahmakan Sebuah supercoiled DNA
molekul sayatidak dua domain topologi yang berbeda: 4.300 besar domain bp dan 401 kecil domain bp.
401 kecil domain bp adalah capable of constraining 3 (-) supercoils di itu Lac-mediated DNA lingkaran for itu
DNA teMPLmakan wengan Sebuah superheli- kal sarangity of ~- 0,06 (Ara. 2b nd Tmampu 2). Ini constrsebuahined
supercoils incr meringankan LacI's DNAbind sebuahffinity dan karenanya meningkatkan penghambatan lac
promoter tanpa adanya inducer. We juga demonstr sebuahteth t stability of Lac-mediated DNA topological
bapenghalang aku s propoRTIonal untuk its DNA binding affinity: itu lebih tinggi DNA mengikat
affinity,semakin stabil Laci-mediated topologi penghalang(Supplementary Tables S1 dan S2). Figure
5showsmodel molekul of physical interactions antara Laci dan lac opertors thtplyessenTial peran dalam
bentuktionpenghalang topologi DNA dengan 3 supercoils terbatas (-). Sebagai mentioned di atas, ini
constrained (-) supercoils are important for itu lac operon. Pertama, mereka bberdering O1 dan O2 dekat untuk
setiap oada dan meningkatkan kemungkinan membentuk Laci-medi ated DNA toiletp.Kedua, ini
dibatasi(-)superkoil memberikan free energy untuk menambah itu LacI's DNA binding sebuahffinity nd rere form
Sebuah highly stable repressorsome that efficiently inhibits itu gen expression of itu lac operon. DNA supercoiling
37

appears untuk menjadi an essential compo- nent of itu klasik lac operon di E. coli, a component that telah telah
okelihatan previously1,4,12. Nevertheless, saya t apakah sayamportant untuk memahami what milik or properties
of LacI menentukan its capacity untuk form Sebuah topologi penghalang dan blok suplairdifusi melingkar. We
shomenikah previously thtLaci mampu menginduksi superhelicity(ΔLuk)
24
dalamLaci-lac O kompleks.
Superhelicity yang diinduksi LacI ini mungkin penting untuk membentukDN topologiA penghalang dan
pemblokiran supercoiling diffusion.
Eksperimen ini juga menunjukkan bahwa supercoiling DN A memainkan peran penting dalam
regulasibasal ekspresi lac operonpada E. coli. Tidak hanya tipe liar strainMG1655 mengekspresikan lebih
banyak β -galactosidase comparing wengan itu isogenik topA ketegangan VS111 (Ara. 3a, b), but itu expression
tingkat of β -galactosidase of MG1655 dan VS111 lebih tinggi untuk sel-sel tawal exponefase ntial dibandingkan
mereka tlmakan exponenfase esensial juga (Gbr. 3a, b, e, f). exprTingkatessionadalah dirbaik langsung
correlsebuahted dengan DNAsarmelingkar status invivo (Gambar. 4). Results ini strongly support kami hyesis
that DNA supercoiling modulsebuahtes itu dr dasarnya expression of itu lac OPEron, efek semuaosayap E. coli sel
untuk merasakan itu Ini sangatheboh perubahan thkasar itu Lac-mediated topological pembatas for different
grodengan conditions.
E. coli adalah organisme sel tunggal dan telah mengembangkan kemampuan untuk ADA pt rsebuahpidly untuk
differentenvironmental con ditions, sepertirendah nutrien,ts tekanan osmotik tinggi, dan perubahan
teMPERsebuahmendatang Ketikakarbon utama glukosa sumberberlimpah, E. coli selmenghasilkancukup
38.

ATP yanguntuk fungsi normal dan biosintesis. Dalam hal ini, DNA gyrase sepenuhnya aktif dan
mendorong DNA kromosom ke lebih banyak (-) status superkoil (Gbr. 4). Kelebihan supercoILS constrained
39,40

di itu 401 bp DNA lingkaran by itu Lac-mediated topologi pembatas memajukan pembentukan repressorsome
sangat stabil yang mencegah ekspresi boros lacZYA dari lac. operon However, ketika E. coli sel hidup di
nutrient deficientenvironments, ATP/ ADP ratio atau energi biaya adalah low, yang secara signifikan
mengurangi kegiatan supercoil dari DN A gyrase Dalam wa iniy,DNA sekitaryang lac promotor santai
41,42. 39,40

(Gbr. 4), yang melemahkan pengikatan LacI untuk lac operators dan karenanya meningkatkan basal tingkat
expression of lacZYA. Ini mekanisme prepares E. coli sel untuk respond qcepat untuk itu presence of oada sumber
karbon, seperti laktosa dalam nutrien.t deficientenvironments Akun ini way,amountstertentulaktosa transported
dalam sel oleh permease laktosa dan converted untuk alolaktosa by β -galactosidase, natanian inducer of itu lac
operon. Kami results di Ara. 3 are consistent wengan ini explanation. Ini results juga provide Sebuah reasonable
explanation for itu long-waktu observsebuahtion di yang DNA supercoiling meningkatkan itu DNA binding Affinity of
Laci Lac opersebuahtor dan mempromosikan bentuktiondari Laci-mediloopted DNA The lac operon E.coli
18,19 20-22.

menggunakan Lac-mediated topologi pembatas untuk merasakan itu environmental perubahan through
merasakan itu DNA topologi perubahan round itu lac operon. Sayan ini way, yang sel bisa set itu dr dasarnya tingkat
of lACZYA expression.
Dalam kami baru-baru publiktion,kita demonstrthteddi bakteri fag λ menggunakan supercoil sebagai
sinyal untuk memutuskan apakah virus mengadopsi litik atau siklus hidup lisogenik ketika menginfeksi E.
coli sel31. Sangat mungkin bahwa virus telah berevolusi untuk menanggapi (-) supercoils DN A dengan
memfasilitasi perambatan diam melaluihidup lisogenik siklus selama favorable grodengan conditions for
bakteri . Sayan ini artikel kami results juga menyarankan that E. coli Genosaya msebuahyhveberevolusi untuk
31

regulsuatute ekspresi basal dari lac operondengan menggunakan Laci-mediated topologi penghalang
sebagai sensor untuk mendeteksi perubahan superheliks dari kromosom D NA selama kondisi pertumbuhan
yang berbeda. Ada kemungkinan bahwa bakteri telah mengadopsiDN hambatan topologiA sebagai
mekanisme umum untuk merasakansuperhelikal perubahandalam kromosom DNA, sinyal epigenetik
paling dinamis untuk regulasi transkripsi. Karena nukleosom adalah unit kemasan dasar untuk eukariota
di mana ~ 146 bp dari DNSebuah pembungkus dalam 1,67 kidal superhelical berbalik di sekitardan (-)
supercoils adalah kendala dalam noctone octamerucleosom , itu mungkin besar that juga eukariota menggunakan
43

topologi hambatan untuk regulmakan different biological functions, seperti transcription dan recombdalamtion.
Metode
 Protein, bahan kimia, dan reagen. E. coli Laci dan mutants dimurnikan dengan metode Chen dan
Matthews (E. coli strain containing itu plasmid overexprEssing LacI dan mutants adalah baiklah disediakan by K.
44

S. Msebuahtotot at Nasi University). Restriction enzim Nt.BbvCI, Nb.BbvCI, Nb.BTsi, T4 DNA ligase, nd E. coli DNA
girase kamire purdikejar from New Inggris Biolabs (Beverly,MA, USA). Sayajadipropyl β -D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG) dan o-nitrophenyl-β -D-galactoside (ONPG) diperoleh dari Sigma-Aldrich,
Inc. (St. Louis, MO). Semua synthetic oligonukleotida kamire purdikejar from MWG-Biotech, Sayanc.
(Huntsville, AL). γ - P-ATP (3000) mCi / mmol) adalah diperoleh from PerkinElmer Kehidupan dan Analitik
32

Ilmu pengetahuan (Dialton, CT).

Ilmiah RepoRts | 6: 19243 | DOI: 10.1038 / srep19243 7

www.nature.com/scientificreports/

Angka 5. LacI tetramer serentak mengikat untuk O1 & O2 operators dari itu lac promotor dan formulir
sebuah
topologi pembatas that kendala tiga (-) supercoils di itu 401 bp DNA lingkaran. Ini molekuler model telah
constructed seperti yang dijelaskan di bawah Methods dan shows that saya t aku s layak for itu Lac-mediated
topologi penghalang untuk constrain three (-) DNA supercoils untuk itu 401 bp DNA toilethlm.
Ilmiah RepoRts | 6: 19243 | DOI: 10.1038 / srep19243 8
www.nature.com/scientificreports/

Kerangka DNA plasmid. Semua plasmid kecuali pZXD133, pZXD145, dan pZXD146 berasal dari
plasmid pACYC184. Konstruksi templat DNA plasmid kadang-kadang membutuhkanDN fusiA antara
termini kohesif non-komplementer. Dalam scenari ini o,ujung kohesif yang converted sebelum ligasi untuk
menumpulkan ujung by incubsebuahtion of itu DNA fragmennts wengan T4 DNA polimerase di itu presence of
dNTPs. Plasmid pCB67, pCB73, pCB107, pCB109, pCB112, dan pCB115 dijelaskan sebelumnya . Plasmid 25

pCB106 dibangun by penyisipan dari 19 bp synthetic DNAfragmentcontaining enzim nicking

Nt.BbVCIrsitusecognitionke dalam unique EAGI site of pCB73. Plasmid pCB108 adalah created by itu insertion
of itu 378 bhal BamHI-KpnI fragment of pCB106 membawa 8 berduaan copies of lac O1 operators untuk itu unik
AdhI site of pCB106. Sayan ini way, pCB108 contains 16 lac O1 opertors equally Distributed taruhanween two
LOCsebuahtions. Plasmid pCB116 adalah constructed through penyisipan 194 bp BamHI-KpnI fragmen
pCB112 membawa 4 tandem salinan lac O1 operatorke situsunik AdhIpCB112. Dalam way ini, pCB116
berisi 8 O1 operatordidistribusikan secara merata antara dua locsebuahtions. Plasmid pCB110 adalah
constructed by itu insertion of itu 19 bp synthetic DNA fragment dijelaskan di atasdi situs EagI unik pCB67.
Plasmid pCB126 (atau pO1O1) dibuat by memasukkan 46 bp synsintetik oligoncoucleotidentaining sebuah lac
O1 opersebuahtor ke situs Ahdi unik pCB110. Dalam hal ini, distribusi terpendek tance antara itu twolac O1
operators of pCB126 aku s 1.2 kb.
Plasmid pO1O2 nd pO1O3 were cpadaterstruktur by inserting Sebuah 41 bhal synthetic DNA
oligonucleopasang cantaining a lac O2 atau O3 operauntuksitus AhdI yang unik dari pCB110, dengan hormat y.
Demikian juga, plasmid pO1Os dibuat by itu insertion of Sebuah 40 bp synthetic DNA oligonukleotida
containing Sebuah lac Os operator sayatidak itu unik Ahdi site dari pCB110. Plasmid pO2O2 itu kekasdiciptakan
oleh replacement dari 46 bp BamHI-BglII fragment pO1O2 dengan a 31 bp synthetic DNA oligonukleotida
membawa Sebuah lac O2 operator. Plasmid pO3O3 adalah constructed by mengganti 46 bp BamHI-BglII
fragment pO1O3 dengan 31 bp synthetic oligonukleotida DNA membawa lac O3 OPEr ahinggar. Plasmid pOsOs
was created byreplacing the 46 bp BamHI-BglII fragment of pO1Os with a 31 bp synthetic DNA oligonucleotide
carrying a lac Os operator. Plasmid pO3O1O2 was constructed in two steps. Step 1 is to i nsert Sebuah
568 bp PCR product containing lac O1, O2, and O3 operators at their native positions on itu chromosome into the
BamHI-KpnI sites of pYZX43F to gener ate plasmid pO1O2O3-1. In the second step, a nicking enzyme
Nt.BbvCI recognition site antara itu lac O1 dan O2 operators adalah created untuk yield plasmid pO3O1O2.
Plasmids pO1O2n and pO3O2n were made by PCR-directed site-mutagenesis to eliminate the lac O3 or O2
operators of pO3O1O2, respectively. Plasmid pOsOs401 and pOsOs493 were, respectively, created through
converting itu lac operators of pO1O2n dan pO3O2n into lac Os operators by PCR-based site-directed
mutagenesis.
Plasmid pZXD133, pZXD145, dan pZXD146 are derivative of pBR322 dan were constructed di beberapa steps.
Plasmid pZXD64 was constructed byintroducing a unique AgeI site into the upstream region of the tet gene
of pZXD14 using PCR-based, site-directed mutagenesis. Kemudian, itu tet gene between itu unique AgeI and BsmI
45

sites of pZXD64 was replaced by a 3,068 bp lacZ gene DNA fragment of plasmid pYC2/CT/lacZ (Life
Technologies, Grand Island, NY) to generate pZXD65. Next, four Rho-independent E. coli rrnB T1
terminators from plas- mid pLUC1 were inserted into XbaI site of pGL3 (Promega Corpor ation, Wisconsin,
WI) to yield pZXD67. A 2,511 bp HindIII-SpeI DNA fragment of pZXD67 carrying a modified firefly
(Photinus pyralis) luciferase gene (the codon usage was optimized for mammalian cells) and four Rho-
independent E. coli rrnB T1 terminators was inserted between the HindIII and SpeI sites of pZXD65 to
produce pZXD70. Plasmid pZXD74 was created by silently removing itu EcoRI site di itu downstream region of
lacZ gene of plasmid pZXD70 without changing the open reading frame of lacZ gene using PCR-based, site-
directed mutagenesis. Plasmid pZXD76 was gene r- ated after a XbaI site was inserted i nto the downstream region
of the luciferase gene of plasmid pZXD74. Then, a 1,688 bp DNA fragment of pZE15luc carrying a firefly
(Photinus pyralis) luciferase gene (the codon usage was optimized for bacterial cells) was inserted into the
HindIII and XbaI sites of pZXD76 to yield pZXD77. Plasmid pZXD97 was created by inserting a 72 bp
synthetic deoxyoligonucleotide containing leu-500 promoter and a unique BamHI site into itu HindIII dan
EcoRI sites of pZXD77. pZXD99 adalah produced by inserting Sebuah 53 bp syn- thetic deoxyoligonucleotide
into the BamHI and EcoRI sites of pZXD97. Plasmid pZXD105 was constructed byinserting Sebuah 55 bp
synthetic DNA oligonucleotide containing itu strong IPTG-inducible E. coli T7A1/O4 promoter into the EcoRI
and XhoI sites of pZXD99. In this way, the T7 promoter was replaced by the T7A1/O4 promoter. Plasmid
pZXD133 was made by the insertion of a 3,093 bp PCR product containing the lacZ gene amplified from
MG1655 genomic DNA into itu AgeI dan BsmI sites of pZXD105. Sayan this case, the codon usage of lacZ was
optimized for E. coli cells. Plasmid pZXD106 was constructed by inserting an 85 bp synthetic DNA oligonucle-
otide containing the tac promoter into the EcoRI and XhoI sites of pZXD99. In this wa y, the T7 promoter
was replaced by P . Plasmid pZXD145 was created by the insertion of a 3,093 bp PCR product containing the
tac

lacZ gene amplified from MG1655 genomic DN A into the AgeI and BsmI sites of pZXD106. Plasmid
pZXD107 was made by inserting an 87 bp synthetic DNA oligonucleotide containing the lacUV5 promoter into
the EcoRI and XhoI sites of pZXD99. In this way, the T7 promoter was replaced by P . Plasmid pZXD146
lacUV5

was constructed by itu insertion of Sebuah 3,093 bp PCR produk containing itu lacZ gene amplified from MG1655
genomic DNA into the AgeI dan BsmI sites of pZXD107.

Bacterial strains. Escherichia coli strains MG1655 [F−, λ −, rph-I] and VS111 [F−, λ −, rph-I, Δ topA] were
obtained from the Coli Genetic Stock Collection/E. coli Genetic Resource Center (CGSC) at Yale University.
MG1655(DE3) and VS111(DE3) were described previously . E. coli strains FL1130 (MG1655(DE3) Δ lacZ
34
 attnT7::P -lacZ P -luc) and FL1131 (VS111(DE3) Δ lacZ attnT7::P -lacZ P -luc) were con- structed
T7A1/O4 leu-500 T7A1/O4 leu-500

in two steps. First, MG1655(DE3) Δ lacZ and VS111(DE3) Δ lacZ were constructed using the λ Red
recombination system . In the next step, using a Tn7-based site-specific recombination system , a 5.1 kb DNA
35 36

fragment membawa itu divergently coupled P dan P leu-500 promoters with itu luc dan lacZ genes adalah inserted to
T7A1/O4

the attTn7 site of the E. coli chromosome (84 min of the chromosome) to gener ate FL1130 and FL1131. In
46

both strains, itu IPTG-inducible P controls itu expression of β -galactosidase.

T7A1/O4

Scientific RepoRts | 6:19243 | DOI: 10.1038/srep19243 9

www.nature.com/scientificreports/

The DNA-nicking method. The DNA-nicking method was described previously with some modifica- 25

tions. Briefly, a typical DNA-nicking reaction mixture (320 μ L) contained 20 mM Tris-acetate (pH 7.9 at 25 °C),
10 mM magnesium acetate, 1 mM DTT, a negatively supercoiled DN A template, and LacI. Where
specified, 1 mM of IPTG adalah juga ditambahkan untuk itu DNA-nicking assays. Semua components were
assembled on ice dan incubated for 30 min at 37 °C. After the incubation, the supercoiled DN A templates were
digested by either Nt.BbvCI or Nb.BbvCI at 37 °C for 30 min or various times. Then, a large excess of a
double-stranded oligonucleotide con- taining Nt.BbvCI recognition site were ditambahkan untuk itu reaction
mixtures to inhibit itu restriction enzim activities. Itu nicked DNA templates were ligated by T4 DNA ligase di itu
presence of 1 mM of ATP at 37 °C for 5 min and the reactions were terminated by extraction with sebuah equal
volume of phenol. Itu DNA samples were precipitated with ethanol and dissolved in 25 μ L of 10 mM Tris-HCl
buffer (pH 8.5). The linking number of the ligated DNA products was determined with 1% agarose gel
electrophoresis in the absence or p resence of 0.5 μ g/ml of chloro- quine dan calculated from itu gel images stained
with SYBR Emas menggunakan KODAK 1D Image Analysis Software.

Determining supercoiling density of plasmid DNA templates. 3 μ g of supercoiled plasmid pBR322,

pUC18, pACYC177, orpACYC184 was relaxed by human DNA topoisomerase I in the pr esence of various con-
centrations of ethidium bromide at 37 °C in 20 mM Tris-acetate (pH 7.9), 50 mM KAc, 10 mM Mg(Ac) , and 1 2

mM DTT for one hour. Subsequently, the relaxation reaction was stopped by addition of an equal volume
of phenol. The topological status of each DNA preparation was analyzed by electrophoresis in a 1%
agarose gel in 1 × TAE buffer (40 mM Tris-acetate (pH 7.8) and 1 mM EDTA) containing different
concentrations of chloro- quine. After electrophoresis, agarose gels were stained with ethidium bromide,
destained, and photographed under UV light. The DNA linking number change (Δ Lk) was determined by
analyzing the distributions of the topoisomers di ini gel images dan itu supercoiling density (σ) adalah
calculated menggunakan itu following equation:
Δ −
σ= =
()

(++/ )−(+ +/ )−
R
()
where Sebuah dan x represent itu total DNA dan itu total protein concentration, respectively.

Atomic Force Microscopy. The LacI-DNA samples were prepared according to the DNA-nicking method as
described above. After the supercoiled DN A templates were digested by Nt.BbvCI at 37 °C for 30 min, the
LacI-DNA complexes (10 μ L) were deposited on Sebuah poly-L-ornithine-coated mica permukaan dan incubated
for 2 min at room temp. Itu droplet adalah rinsed away with 0,4 mL HPLC water and dried gently with compressed
air. Images were acquired with a NanoScope MultiMode AFM microscope (Digital Instrumen t, Santa Barbara,
CA) oper- ated in tapping mode using a 50–60 mV oscillation amplitude of uncoated, etched silicon tips
with a resonance frequency of 75 kHz (NSC18, MirkoMasch, San Jose, CA ). Areas of 1 × 1 μ m were scanned
47 2

atarate of 1.2 Hz and Sebuah resolution of 512 × 512 pixels. Itu DNA contour lengths were estimated by
menggunakan Image Analysis Software ImageJ. The LacI-mediated 401 bp DNA loops were identified by
measuring the DNA contour lengths of these relaxed DNA loops and by comparing the size and volume of
the LacI molecules that form the DNA loops with our previously diterbitkan results . 25

The expression of β-galactisidase. Itu expression level of β -galactosidase adalah measured by Miller's assay as
described . Briefly, 100 mL of LB was inoculated with 1 mL of overnight bacterial cell culture until OD600
48

reaches ~0.2. 100 μ L of bacterial cell culture was mixed with 900 μ L of Z-buffer (60 mM Na HPO , 40 mM
2 4

NaH PO , 10 mM KCl, 1 mM MgSO , and 50 mM β -mercaptoethanol). Sel were lysed with 60 μ L. of chloroform
2 4 4

and 30 μ L of 0.1% SDS. After cell lys ates were equilibr ated at 30 °C for five minutes, 200 μ L of 4 mg/mL ONPG
was added to the cell lysates. After additional 15 min incubation at 30 °C, reactions were stopped by
 addition of 500 μ L of 1 M Na CO . After cell debris was removed by ce ntrifugation at 13,000 rpm for 1 min,
2 3

OD420 and OD550 were measured in a Cary 50 spect rophotometer. β -Galactosidase activities (E) were
calculated using the following equation:

Scientific RepoRts | 6:19243 | DOI: 10.1038/srep19243 10

www.nature.com/scientificreports/

420 550
600
where t dan v represent reaction waktu dan cell culture volume, respectively.

Western blotting experiments. Western blotting experiments were used to monitor the basal level
expression of β -galactosidase in different E. coli strains. Total protein purified from E. coli cells was analyzed b y
electrophoresis in Sebuah 10% SDS-PAGE gel and electrophoretically transferred untuk Sebuah 0,45 nm nitrocellulose
membrane. Itu membrane blot adalah kemudian diblokir with Sebuah solution containing 5% nonfat skim susu di
TBST (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, and 0.05% Tween-20) for 45 min at room
temperature and incubated with the primary antibody, β -galactosidase antibody (Thermofisher Scientific,
Inc.), diluted 1:1000 in TBST solution overnight at 4 °C. After the overnight incubation, the membrane
blot was washed three times with TBST and blocked with a solution containing 5% nonf at skim milk in
TBST for 15 min at room temperature. Membranes were incubated with secondary antibodies in blocking
buffer at 1:20,000 for fluorescently conjugated antibodies purchased from Li-Cor Biosciences. Membranes
were again washed three times for five minutes in 1 × TBST. Western blots were developed using fluorescence
detection using itu LI-COR Odyssey CLx near infrared scanner.

Molecular modeling. The DNA-loop was created with the GraphiteLifeExplorer modeling tool . VMD 49

software was used to patch and render the DNA-loop structure with the LacI-DN A complex (PDB id 1Z04),
50

which was originally modeled bypatching several NMR-structures of fragments of LacI and DNA . Three (−) 51

DNA supercoils were introduced to the DN A loop to match our experimental results for the LacI-
mediated 401 bp DNA loop.
Referensi
1. MullerHill, B. The Lac Operon: A Short History of a Genetic Paradigm (Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1996).
2. Lewis, M. Allostery and the lac Operon. J. Mol. Biol. 425, 2309–2316 (2013).
3. Lewis, M. et al. Crystal structure of the lactose operon repressor and its complexes with DNA dan inducer. Science 271, 1247–1254
(1996).
4. Oehler, S., Eismann, ER, Kramer, H. & Muller-Hill, B. The three operators of the lac operon cooperate in repression. EMBO J. 9,
973–979 (1990).
5. Gilbert, W. & MullerHill, B. Isolation of the lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56, 1891–1898 (1966).
6. MullerHill, B. The function of auxiliary operators. Mol. Microbiol. 29, 13–18 (1998).
7. Oehler, S., Amouyal, M., Kolkhof, P., von Wilcken-Bergmann, B. & MullerHill, B. Kualitas dan posisi dari itu tiga lac operators of
E. coli define efficiency of repression. EMBO J. 13, 3348–3355 (1994).
8. Shanblatt, SH & Revzin, A. The binding of catabolite activator protein and RNA polymerase to the Escherichia coli galactose and
lactose promoters probed by alkylation interference studies. J.Biol. Chem 261, 10885–10890 (1986).
9. Liu, M. et al. Kinetics of transcription initiation at lacP1. Multiple roles of cyclic AMP receptor protein. J. Biol. Chem 278,
39755–39761 (2003).
10. Beckwith, J., Grodzicker, T. & Arditti, R. Evidence for two sites in the lac promoter region. J. Mol. Biol. 69, 155–160 (1972).
11. Malan, T. P. & McClure, WR Dual promoter control of the Escherichia coli lactose operon. Cell 39, 173–180 (1984).
12. Kuhlman, T., Zhang, Z., Saier, MH, Jr. & Hwa, T. Combinatorial transcriptional control of the lactose operon of Escherichia coli.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 6043–6048 (2007).
13. Inada, T., Kimata, K. & Aiba, H. Mechanism responsible for glucose-lactose diauxie in Escherichia coli: challenge to the cAMP
model. Genes Cells 1, 293–301 (1996).
14. Kimata, K., Takahashi, H., Inada, T., Postma, P. & Aiba, H. cAMP receptor protein-cAMP plays a crucial role in glucose-lactose
diauxie by activating the major glucose transporter gene in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12914–12919 (1997).
15. Bates, A. D. & Maxwell, A. DNA Topology(Oxford University Press, Oxford, UK, 2005).
16. Cozzarelli, NR & Wang, J. C. DNA Topology and Its Biological Effects(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1990).
17. James C Wang Untangling the Double Helix: DNA Entanglement and the Action of the DNATopoisomerases(Cold Spring Harbor
Laboratory Press,2009).
18. Wang, J. C., Barkley, M. D. & Bourgeois, S. Measurements of unwinding of lac operator by repressor. Nature 251, 247–249 (1974).
19. Whitson, P. A., Hsieh, W. T., Wells, R. D. & Matthews, KS Influence of supercoiling and sequence context on operator DNA
binding with lac repressor. J.Biol. Chem 262, 14592–14599 (1987).
20. Whitson, P. A., Hsieh, W. T., Wells, R. D. & Matthews, KS Supercoiling facilitates lac operator-repressor-pseudooperator
interactions. J.Biol. Chem 262, 4943–4946 (1987).
21 Borowiec, J. A., Zhang, L., Sasse-Dwight, S. & Gralla, J. D.DNA supercoiling promotes formation of a bent repression loop in lac
DNA. J. Mol. Biol. 196, 101–111 (1987).
22. Eismann, ER & Muller-Hill, B. lac repressor forms stable loops in vitro with supercoiled wild-type lac DNA containing all three
natural lac operators. J. Mol. Biol. 213, 763–775 (1990).
23. Kim, R. & Kim, S. H. Direct measurement dari DNA unwinding angle di spesifik interaction antara lac operator dan repressor. Cold
Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 47 Pt 1, 451–454 (1983).
24. Chen, B., Xiao, Y., Liu, C., Li, C. & Leng, F. DNA linking number change induced by sequence-specific DNA-binding proteins.
Nucleic Acids Res. 38, 3643–3654 (2010).
25. Leng, F., Chen, B. & Dunlap, D. D.Dividing a supercoiled DNA molecule into two independent topological domains. Proc Natl.
Acad. Sci. USA 108, 19973–19978 (2011).
26. Kramer, H., Amouyal, M., Nordheim, SEBUAH. & MullerHill, B. DNA supercoiling changes the spacing requirement of two lac
operators
for DNA loop formation with lac repressor. EMBO J. 7, 547–556 (1988).
27. Crut, A., Koster, DA, Seidel, R., Wiggins, CH & Dekker, NH Fast dynamics of supercoiled DNA revealed by single-molecule
experiments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 11957–11962 (2007).
28. van Loenhout, M. T., de Grunt, M. V. & Dekker, C. Dynamics of DNA supercoils. Science 338, 94–97 (2012).
29. Sadler, J. R., Sasmor, H. & Betz, J. L. SEBUAH perfectly simetris lac operator binds itu lac repressor sangat tightly. Proc. Natl. Acad. Sci.
Amerika Serikat
 80, 6785–6789 (1983).
30. Falcon, C. M. & Matthews, K. S. Glycine insertion di itu hinge region dari lactose repressor protein mengubah DNA binding. J. Biol. Chem
274, 30849–30857 (1999).

Scientific RepoRts | 6:19243 | DOI: 10.1038/srep19243 11

www.nature.com/scientificreports/

31. Ding, Y. et al. DNA supercoiling: A regulatory signal for itu lambda repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 15402–15407 (2014). 32.
Pruss, G. J. DNA topoisomerase I mutants. Increased heterogeneity in linking number and other replicon-dependent
changes in
DNA supercoiling. J. Mol. Biol. 185, 51–63 (1985).
33. Stupina, VA & Wang, J. C. Viability of Escherichia coli topA mutants lacking DNA topoisomerase I. J. Biol. Chem 280, 355–360
(2005).
34. Samul, R. & Leng, F. Transcription-coupled hypernegative supercoiling dari plasmid DNA oleh T7 RNA polymerase di Escherichia coli
topoisomerase I-deficient strains. J. Mol. Biol. 374, 925–935 (2007).
35. Datsenko, KA & Wanner, BL One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645 (2000).
36. McKenzie, G. J. & Craig, NL Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using
Tn7 without need for selection of the insertion event. BMC. Microbiol. 6, 39 (2006).
37. Semsey, S., Virnik, K. & Adhya, S. Three-stage regulation of the amphibolic gal operon: from repressosome to GalR-free DNA. J.
Mol. Biol. 358, 355–363 (2006).
38. Foster, P. L. Stress-induced mutagenesis in bacteria. Crit Rev. Biokem. Mol. Biol. 42, 373–397 (2007).
39. Jensen, P. R., Loman, L., Petra, B., mobil van der Weijden, C. & Westerhoff, H. V. Energi buffering dari DNA structure fails kapan
Escherichia
coli runs out of substrate. J.Bakteriol. 177, 3420–3426 (1995).
40. van, WM et al. DNA supercoiling depends on the phosphorylation potential in Escherichia coli. M ol. Mikrobiol. 20, 351–360
(1996).
41. Westerhoff, HV, O'Dea, MH, Maxwell, A. & Gellert, M. DNA supercoiling by DNA gyrase. A static head analysis. Cell Biophys.
12, 157–181 (1988).
42. Hsieh, L. S., Rouviere-Yaniv, J. & Drlica, K. Bakteri DNA supercoiling dan [ATP]/[ADP] ratio: changes terkait dengan salt shock.
J.Bakteriol. 173, 3914–3917 (1991).

43. Luger, K., Mader, SEBUAH. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. & Richmond, T. J. Kristal struktur dari itu nucleosome inti particle at 2.8 A
resolution. Nature 389, 251–260 (1997).
44. Chen, J. & Matthews, KS Deletion of lactose repressor carboxyl-terminal domain affects tetramer formation. J.Biol. Chem 267,
13843–13850 (1992).
45. Zhi, X. & Leng, F. Dependence dari transcription-coupled DNA supercoiling di promoter kekuatan di Escherichia coli topoisomerase
I deficient strains. Gene 514, 82–90 (2013).
46. Waddell, C. S. & Craig, N. L. Tn7 transposition: recognition dari itu attTn7 target sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. Amerika Serikat 86,
3958–3962
(1989).
47. Wang, H., Finzi, L., Lewis, D. E. & Dunlap, D. AFM studies of lambda repressor oligomers securing DNA loops. Curr. Pharm
Bioteknol. 10, 494–501 (2009).
48. Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1972).
49. Hornus, S., Levy, B., Lariviere, D. & Fourmentin, E. Mudah DNA modeling dan lebih dengan GraphiteLifeExplore r. PLos ONE 8, e53609
(2013).
50. Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: visual molecular dynamics. J. Mol. Graph. 14, 33–38 (1996).
51. Balaeff, A., Mahadevan, L. & Schulten, K. Structural basis for cooperative DNA binding by CAP and lac repressor. Structure. 12,
123–132 (2004).
Acknowledgements
We thank Kathleen S. Matthews for providing us with E. coli strains containing plasmids overexpressing E. coli
lac repressor and mutants. We also thank Dr. Alberto Martin at the University of Toronto for providing us with
E. coli strain MG1655(DE3). We are grateful to D r. Bo Chen for technical support. This work was
supported by grants from the National Institutes of Health: 1SC1HD063059-04 and 1R15GM109254-01A1
(to F.L.) and RGM084070A (to Laura Finzi at Emory University).
Author Contributions
designed research; G.F., S.D., XZ, B.C. and D.D. performed research; P.C. and BG constructed itu molecular
F.L.
model; F.L. analyzed data; F.L. wrote itu paper.
informasi tambahan
Tambahan information accompanies ini paper at http://www.naturecom/srep
Competing keuangan interests: Itu authors declare tidak competing keuangan interests.
How untuk cite ini article: Fulcrand, G. et Al. DNA supercoiling, Sebuah critical sinyal regulating itu basal
expression of the lac operon in Escherichia coli. Sci. Rep. 6, 19243; doi: 10.1038/srep19243 (2016).
Ini work aku s licensed dibawah Sebuah Creative Milik bersama Atribusi 4.0 Internasional License. Itu
images
or other third party material in this article are included in the article's Creative Commons license,
unless indicated jika tidak di itu credit baris; jika itu bahan aku s tidak termasuk dibawah itu Creative Milik
bersama license, users will need to obtain permission from the license holder to reproduce the material. To
view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Scientific RepoRts | 6:19243 | DOI: 10.1038/srep19243 12