Nama : Cantika Dylani Putri

NIM : H1031101044

Mata Kuliah : Biokimia Lanjut

 Genomik telah berevolusi selama 20 tahun terakhir oleh teknologi

pengembangan sequencing generasi pertama dan kedua (SGS),
memungkinkan penyelesaian, di antara banyak lainnya
 Metode pertama untuk mengurutkan DNA dikembangkan oleh Maxam dan
Gilbert pada tahun 1977, masing-masing metode ini disebut sebagai
“metode pemutusan rantai” dan “metode squencing kimia”.
 Teknologi TGS menargetkan molekul DNA tunggal, yang memungkinkan
pengurutan waktu nyata, di mana pembacaan tersedia untuk analisis setelah
melewati pengurutan. Ada tiga peningkatan penting dalam platform TGS :
1. Peningkatan panjang baca dari puluhan basis menjadi puluhan ribu
bsis per pembacaan
2. Pengurangan waktu pengurutan dari hari ke jam (atau ke menit
untuk aplikasi waktu nyata)
3. Pengurangan atau penghapusan bias sequencing diperkenalkan oleh
amplifikasi PCR
 Pada tahun 2014, Oxford Nanopore Technologies (ONT) merilis platform
Third Generation Squencing (TGS), perangkat minION melalui program
akses awal (The MinION Access Program, MAP).
 Profil panjang baca dari data ONT sangat mirip dengan PacBio, dengan
akurasi berkisar 65% - 88%. Akan tetapi pemacaan ONT memiliki tingkat
kesalahan yang lebih tinggi daripada pembacaan PacBio
 MinION adalah perangkat pengurutan DNA terkecil (berukuran 10×3×2
cm dengan berat hanya 90 gram)
 Pengurutan DNA dilakukan dengan cara sampel ditambahkan ke sel aliran.
 Ketika molekul DNA melewati atau mendekati pori nano, maka
akan terjadi perubahan besaran arus didalam pori nano yang diukur
oleh sensor.
 Aliran data diteruskan ke ASIC dan MinKNOW, perangkat lunak
yang menghasilkan data tingkat sinyal.
 ASIC, sirkuit terintegrasi khusus aplikasi
 MinKNOW berjalan dikomputer yang terhubung dengan MinION dan
melakukan beberapa tugas inti berupa :
 Akusisi data
 Analisis dan umpan balik realtime
 Streaming data sambil memberikan contoh perangkat
 Identifikasi dan pelacakan sampel
 MinION dapat dihubungkan langsung melalui port USB3 standar pada
komputer dengan konfigurasi yang sederhana
 Bahan DNA yang digunakan harus terdiri dari fragmen panjang (>30 kb),
yang biasanya dapat diperoleh dengan menggunakan ekstraksi standar dan
metode pembersihan.
 Proses konstruksi perpustakaan saat ini terdiri dari sejumlah langkah, yang
dilakukan dengan urutan sebagai berikut:
 Pemotongan DNA genom menggunakan Covaris g-TUBE,
 Langkah opsional ''PreCR" untuk memperbaiki DNA yang
rusak, perbaikan akhir untuk membuat ujung tumpul pada
potongan DNA dan fragmen PCR,
 dA-tailing untuk menambahkan basis ''A' ke ujung 30 fragmen,
ligasi adaptor,
  Pemurnian manik-Nya untuk menghilangkan nukleotida dan
enzim. Pustaka biasanya berisi dua adaptor, leader adapter dan
hairpin adapter, masing-masing diikat ke salah satu ujung
dsDNA.
 Adapter yang memimpin dilambangkan sebagai “adaptor Y” karena
memiliki struktur berbentuk “Y”, sedangkan adaptor seperti jepit rambut
adapter disebut “adaptor HP”
 Sequencing :
 Dimulai pada ujung 50 untai tunggal dari adaptor Y, diikuti oleh
untaian ''templat'', kemudian adaptor HP, dan untai ''pelengkap''.
 Protein motorik mulai membuka ritsleting dsDNA ketika
mendekati titik balik wilayah pelengkap adaptor Y.
 Pada titik ini, untai pertama ("templat") dilewatkan ke dalam
nanopori dengan kecepatan yang ditentukan oleh protein motorik.
 Setelah adaptor HP tercapai, protein ("protein jepit rambut")
memungkinkan untai komplementer DNA dilewatkan melalui
nanopori dengan cara yang sama. Base-calling kemudian dapat
dilakukan.
 Jika informasi dari hanya satu untai digunakan, pemanggilan
dasar disebut 1-arah (1D); sedangkan panggilan dasar 2D
dilakukan, jika informasi dari kedua untai digabungkan, yang
menghasilkan kualitas dasar yang lebih tinggi
 Pada membran dengan nanopori yang tergabung, tegangan dapat
diterapkan untuk mendorong DNA melalui pori dan aliran arus ion dapat
diukur.
 Ketika molekul DNA melewati nanopore, perubahan pola atau besarnya
arus dapat diamati dan dikarakterisasi. Arus di nanopore diukur oleh sensor
beberapa ribu kali per detik, dan aliran data dilewatkan ke microchip yang
disebut sirkuit terintegrasi khusus aplikasi (ASIC). Terakhir, pemrosesan
 data dilakukan oleh perangkat lunak MinKNOW, yang berhubungan
dengan akuisisi dan analisis data.
 Flowcell MinION saat ini memiliki 512 saluran, yang memungkinkan
hingga 512 molekul DNA independen untuk diurutkan secara bersamaan