Machine Translated by Google

ALEGRIA ET AL.: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 81, No.2, 1998 457

ELEMEN RESIDU DAN TRACE

Optimalisasi Penentuan Selenium pada Susu Manusia

dan Darah Utuh dengan Injeksi Aliran Hydride Atomic
Spektrometri Penyerapan

AMPARO ALEGRIA, REYES BARBERA, ROSAURA FARRE, EMILIA FERRER, M. JESUS LAGARDA,1 dan M. ANGELES TORRES
University of Valencia, Fakultas Farmasi, Nutrisi dan Kimia Pangan, Avenida Vicente Andres Estelles s/n, 46100-Burjassot, Valencia, spanyol

Diu
06
pa
art
81
M
ac
htt
da
ta
ol
2
ja Metode flow injection hydride atomic absorption spec
trometry (FI-HAAS) dikembangkan untuk menentukan
selenium dalam susu manusia dan darah utuh setelah
pencernaan sampel dengan gelombang mikro.
Sampel (2 mL ASI atau 0,25 mL darah) dimasukkan ke
dalam bejana microwave dengan 1,5 mL HN03 dan 0,25
mL H2 02 dan 300 W (4 menit) dan 600 W (4 menit)
diterapkan. Pencernaan diselesaikan dengan pemanasan
hingga 140 C (2-3 jam). Se (VI) direduksi menjadi Se (IV)
dengan asam klorida. Kondisi instrumental untuk FI-
HAAS (konsentrasi zat pereduksi dan asam pembawa,
laju aliran gas pembawa argon, dan volume sampel yang
disuntikkan) dioptimalkan. Batas deteksi metode yang
diusulkan adalah 0,23 ng/mL (pengujian) atau 115 pg Se
(absolut) dalam sampel biologis (1,15 ng/mL susu, 10,4
ng/mL darah). Nilai presisi adalah 5,0% untuk susu dan
4,0% untuk darah. Keakuratan dievaluasi dengan 2 bahan
referensi, Institut Standar dan Teknologi Nasional Susu
Bubuk Tanpa Lemak (ditemukan: 104,3 ± 7,2 ng/g,
bersertifikat: 110 + 10 ng/g) dan Seronorm Darah Utuh
menghilangkan residu bahan organik dan asam nitrat yang
digunakan untuk mencerna sampel, yang dapat mengganggu
penentuan fluorimetri. Oleh karena itu, kompleks piazselenol
yang akan diukur harus diekstrak.
Teknik pembangkitan hidrida dikombinasikan dengan
spektrometri serapan atom (HG-AAS) menawarkan
keunggulan sensitivitas tinggi, bersama dengan pengurangan
interferensi matriks. Penentuan kandungan selenium cairan
biologis dengan teknik ini juga memerlukan penghancuran
bahan organik dan reduksi lengkap Se(VI) menjadi Se(IV).
Selain itu, metode tersebut harus dioptimalkan untuk setiap
jenis sampel.
Beberapa penulis telah menggunakan campuran asam untuk
pencernaan plasma atau serum darah manusia: campuran
pencernaan yang terdiri dari HN03 -H2S04 -HC104 (5 + 2 +
1) digunakan oleh McLaughlin et al. (3), yang memperoleh
pemulihan antara 95 dan 109%. Mereka tidak menemukan
efek matriks yang berarti dalam penentuan selenium dalam
serum atau plasma dengan spektrometri serapan atom
hidrida injeksi aliran (FI-HAAS). Negretti de Bratter dkk. (4)
(ditemukan: 81 ± 7,3 ng /mL, referensi: 83 ± 4 ng/mL). diperoleh akurasi dan presisi yang baik dengan destruksi
Hasilnya menunjukkan kesesuaian metode penentuan (HNO3-H2SO4-HCIO4) dalam bejana terbuka atau dalam
selenium dalam ASI dan darah lengkap. Metode ini bejana bertekanan ketika bahan referensi jaringan atau
diterapkan pada sampel darah utuh yang diperoleh dari serum dianalisis dengan FI-HAAS. Mayer dkk. (5) diperoleh
ibu hamil dan ASI. akurasi yang baik untuk penentuan selenium dalam serum
setelah predigesti dengan HN0 3 - H2S microwave
0 diikuti dengan
4 , digesti
dan
pengukuran HG-AAS.
Wang dkk. (6) menggunakan 10 mL whole blood untuk
penentuan Fe, Zn, Cu, dan Se setelah digesti HN03 -H2S04
-HC104 ; pemulihan yang diperoleh untuk selenium dalam
dalam cairan biologis merupakan langkah pertama yang
serum hanya 84% dengan nyala hidrida AAS. Penulis
Mengukurpenting
selenium
dalamelemen jejak penting
memperkirakan status gizi selenium yang kembali
menghubungkan ini dengan volatilitas selenium; juga,
membutuhkan teknik yang akurat dan sensitif (1). tampaknya, ada gangguan matriks dalam penentuan selenium
Kami sebelumnya menjelaskan metode spektrofluorimetri darah lengkap. Ducros dkk. (7) memperoleh hasil yang baik,
(2) untuk penentuan selenium dalam ASI, yang memenuhi dengan menggunakan destruksi gelombang mikro dalam
persyaratan sensitivitas tinggi yang ditentukan oleh kandungan sistem pembuluh terbuka dan pemanasan di bawahdengan refluks
2 02,
selenium susu yang rendah. Meskipun waktu digesti HN0 3 - H dengan penentuan selenium dalam darah lengkap
berkurang dengan menggunakan microwave digest, metode dengan kromatografi gas/spektrometri massa. Terakhir,
ini panjang dan melelahkan. Itu perlu Navarro et al. (8) dan Hao et al. (9), menggunakan HN03 ,
-HC104 memperoleh pemulihan yang lebih baik (masing-
masing 104 dan 97-99,2%) dari urin dan serum dengan
Diterima 30 Juni 1997. Diterima oleh JS 6 November 1997. penentuan HG-AAS.
1
Penulis kepada siapa korespondensi harus ditujukan.
Machine Translated by Google
458 ALEGRIA ET AL.: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 81, No.2, 1998
Mengingat fakta bahwa beberapa penelitian telah menentukan
konsentrasi selenium dalam darah utuh, yang merupakan matriks
yang lebih kompleks daripada serum atau plasma, dan karena
informasi ini akan berguna dalam menentukan status gizi
selenium, penelitian ini dirancang untuk mengembangkan metode
FI-HAAS. untuk menentukan selenium dalam darah lengkap dan
susu manusia setelah pencernaan sampel dengan gelombang
mikro. Tujuan kami adalah menggunakan metode ini untuk
mengevaluasi status gizi selenium wanita hamil (yang nilai
seleniumnya mungkin lebih rendah daripada wanita tidak hamil
[10]), dan juga untuk memperkirakan asupan selenium bayi yang
diberi ASI. Setelah parameter analitik metode ditentukan, metode
diterapkan pada darah ibu hamil dan ASI untuk menguji
Diu
06
pa
art
81
M
ac
htt
da
ta
ol
2
ja kegunaannya.
Eksperimental
Aparat
(a) Spektrofotometer.—Perkin-Elmer Model 2380 dengan
lampu lucutan elektrode selenium Perkin-Elmer dan catu daya
Sistem EDL 2 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). (b) Sistem analisis
injeksi aliran. —Perkin-Elmer MHS-FIAS 100 dengan manifold
dan blok pemisah untuk memisahkan campuran gas-cair. (c)
Sel penyerap kuarsa. —Dipanaskan dengan api udara-asetilena
(Perkin-Elmer). (d) Oven gelombang mikro. —Sistem destruksi
Milestone MLS 1200 dengan bom, bejana Teflon bertekanan
sedang MV 100 dengan cakram pecah.
(e) Sistem destruksi blok. —Kjeldatherm Gerhardt blok digester.
Reagen
Semua reagen adalah kelas reagen analitik. Sistem air
deionisasi Milli pori Milli-Q Plus (Waters, Mil lipore, Medford, MA)
digunakan seluruhnya.
(a) Asam klorida —37%, sp. gr. 1.33 (Probus, Badalona,
Spanyol).
(b) Asam nitrat —65%, sp. gr. 1.40 (Merck, Darm stadt,
Jerman). (c) Natrium tetrahidroborat.—98-99% (Sigma, St.
Louis, MO).
(d) Natrium hidroksida.—97% (Panreac, Barcelona, Spanyol).
(e) Hidrogen peroksida.—33% (Panreac). (f) Larutan standar
selenium.—(1) Larutan stok.— 1 g/L, dibuat dari ampul
selenium dioksida dalam asam nitrat encer (Titrisol, E. Merck).
(2)
Larutan antara.—10 (xg/mL (0,100 mL stok larutan diencerkan
menjadi 10 mL dengan air deionisasi). (3)
Larutan kerja standar.—Disiapkan dari larutan stok segera
sebelum digunakan.
Semua peralatan gelas direndam dalam asam nitrat pekat
selama 10 menit dan dibilas dengan air deionisasi sebelum digunakan.
Sampel
Sampel ASI (kolostrum) dari ibu sehat dikumpulkan langsung
dalam botol kaca bersih dengan menggunakan pompa ASI.
Sampel darah diperoleh dengan venipuncture dari sukarelawan
hamil yang sehat pada bulan kehamilan yang berbeda. Sampel
darah dikumpulkan dalam tabung plastik, dan 1 tetes larutan
antikoagulan natrium heparin ditambahkan ke setiap 5 mL sampel
darah.
Semua sampel ASI dan darah disediakan oleh Rumah Sakit
Universitas "La Fe."
Bahan referensi biologis (Susu Bubuk Non-Lemak Bahan
Referensi Standar Institut Nasional Standar dan Teknologi [NIST
SRM] 1549 dan Elemen Pelacak Seronorm Darah Utuh I) juga
digunakan.
Pencernaan
Setiap sampel (2 mL ASI atau 0,25 mL darah) dimasukkan ke
dalam bejana microwave, dan 1,5 mL HN0 0 2 ditambahkan (2).
Program
3
pencernaan mi crowave
dan 0,25 mLH 2
diikuti
diterapkan:
Sampelsegera
hasiloleh
300600
W dipindahkan
digesti (4
Wmenit)
(4 menit).
ke tabung digesti dengan menggunakan 4 mL air untuk mencuci
masing-masing bejana Teflon. Tabung kemudian dipanaskan
sampai 140 ° C selama 2-3 jam untuk mengurangi volume menjadi
1 mL dan untuk mendapatkan intisari yang jelas. Setelah dingin,
2 mL HC1 ditambahkan untuk mereduksi Se(VI) menjadi Se(IV).
Volume kemudian disesuaikan menjadi 10 mL dengan air
deionisasi, dan tabung ditutup dan ditempatkan dalam penangas
air pada 100 ° C selama 10 menit.
Prosedur destruksi juga harus diterapkan pada larutan kerja
standar, atau setidaknya 2 mL HC1 harus ditambahkan sebelum
penentuan.
Tekad
Selenium ditentukan di bawah kondisi instrumental yang
dijelaskan pada Tabel 1, yang dioptimalkan dengan melakukan
pengujian dengan berbagai konsentrasi zat pereduksi, berbagai
konsentrasi HC1 dalam aliran pembawa, dan berbagai laju aliran
gas pembawa argon.
Hasil dan Diskusi
Optimalisasi Kondisi Analitis
Tinggi puncak meningkat dengan peningkatan volume
sampel . Meskipun loop hingga 1 mL diuji, loop 0,5 mL dipilih
untuk menghemat sampel.
Dalam uji coba yang dilakukan dengan standar, konsentrasi
pembawa HC1 1,5-3% dalam gas pembawa argon
Machine Translated by Google

ALEGRIA ET AL.: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 81, No.2, 1998 459

Tabel 1. Parameter instrumental untuk penentuan Daya serap

0,35
selenium

Kondisi spektrofotometri serapan atom3

AAS2380(Perkin-Elmer):
0,25
Panjang gelombang (nm):
196,0 Lebar celah (nm):2,0
Sumber cahaya: lampu pelepasan tanpa elektroda (Se)
catu daya (mA): 280
Api, pengaturan aliran (L/mnt): udara (17), asetilena (1,5) 0,15
Waktu integrasi (s): 15

Kondisi analisis aliran injeksi 50 100 150 200

Diu
06
pa
art
81
M
ac
htt
da
ta
ol
2
ja MHS- FIAS 100 (Perkin-Elmer):
Time setting (s) fill: 10 inject: 15
Carrier acid:
3% HCI, flow rate (mL/min): 9 Reductant:
0.05% NaBH4 in 0.1% NaOH,
laju alir (mL/menit): 4
Aliran gas argon (mL/mnt): 100
Volume sampel (|xL): 500
3
Untuk pengukuran tinggi puncak.

diperlukan untuk mendapatkan respon yang maksimal. Oleh

karena itu 3 % HCI digunakan untuk memastikan bahwa
konsentrasi HCI pembawa cukup .
Pengujian dengan larutan natrium tetrahidroborat 0,05 ,
0,1, dan 0,2%, reduktor , dilakukan, dan konsentrasi 0,05%
dipilih , karena menghasilkan sensitivitas terbesar , seperti
yang ditunjukkan oleh kemiringan kurva kalibrasi pada
Gambar 1 .
Pengujian juga dilakukan untuk menentukan pengaruh
laju aliran argon pada sinyal . Plot absorbansi vs laju aliran
ditunjukkan pada Gambar 2. Laju aliran 100 mL / menit dipilih .
Se: 10 ppb HCl: 3% NaBH4 : 0,2%

Daya serap
Argon (mL/mnt)

Gambar 2. Optimalisasi laju alir argon untuk penentuan FI-

HAAS selenium .

10
Selenium (ng/mL)

[•^-Aqueous standard ••-Penambahan matriks )

Gambar 3. Hasil uji gangguan matriks dalam penentuan FI

15 2

-HAAS selenium dalam ASI .

Untuk mempelajari pengaruh matriks , metode penambahan
standar diterapkan pada analisis susu (Gambar 3 ) dan sampel
darah ( Gambar 4 ) . Analisis dari _
Daya serap
0,07

Daya serap

6 8 10 12 14 16
Selenium (ng/mL) 'bl. b2. b3, M: Darah") a: Selenium (ng/mL)
Aqueous J
>-NaBH 4 0,5 % — NaBrijO.r/o -*-NaBH 4 0,2 %

Gambar 4. Hasil pengujian gangguan matriks pada FI -HAAS

Gambar 1. Optimalisasi konsentrasi tetrahydroborate untuk FI penentuan selenium dalam darah yang berbeda
-HAAS penentuan selenium . sampel.
Machine Translated by Google

460 ALEGRIA ET AL.: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 81, No.2, 1998

kovarian dilakukan, dan tidak ada gangguan matriks yang Tabel 2. Parameter analitik penentuan selenium
ditemukan dalam analisis sampel susu (Dihitung = 1,24, i^abie dalam susu dan darah
=
5,32); namun, interferensi matriks,
95%, diamati pada
dalam tingkat probabilitas
penentuan selenium Parameter Darah susu
dalam darah (Calculated 411.71, Cable 7.71). Oleh karena
= Batas deteksi:
itu, perlu diterapkan metode penambahan standar saat 0,26 ng/ml_a 0,23ng/ml_a
=
pengukuran kandungan selenium darah. (n = 10) 10,4 ng/ml_b 1,15ng/ml_b
efek matriks Ya TIDAK

Presisi (%RSD)
Instrumental 4,5 (x = 62,0 ng/mL) 3,2 (x = 7,8 ng/mL)
Untuk menentukan apakah mungkin menggunakan kurva
kalibrasi yang sama untuk menghitung kandungan selenium (n = 10)
metode
dari sampel darah yang berbeda, sampel darah dari 4 individu
Dalam jangka waktu (n = 8) 4,0 (x = 66,8 ng/mL) 5,0 (x = 22,5 ng/mL)
yang berbeda dianalisis dengan metode penambahan standar
Antara lari 10.7 7.1
(Gambar 4), dan kemiringan kurva diperoleh dibandingkan

Diu
06
pa
art
81
M
ac
htt
da
ta
ol
2
ja (analisis kovarians). Tidak ada perbedaan pada tingkat
probabilitas 95% yang diamati (Dihitung^ ^ = 0,004, b = 4,9,
b ] - b 2,4, b2 - b3
- b=
2 4,5,
nilai
b2b- dengan
b4 = ,1,9,

yang akan dianalisis) dapat digunakan

subskrip
-b3 b3 -sesuai
b4 yang
darah yang berbeda; Cable 7.71). Oleh karena itu kami
menyimpulkan bahwa kumpulan darah (campuran sampel
=
kurva kalibrasi
= 3,6,
dengan
berbeda
di mana
sampel

untuk mendapatkan
4

tunggal untuk
setiap pengujian, ketika selenium ditentukan dalam sampel
darah yang berbeda.

Kondisi optimal yang dipilih untuk penentuan selenium

dirangkum dalam Tabel 1.

Karakteristik Analitis

Untuk menilai validitas metode yang diusulkan, batas

deteksi, presisi, dan akurasi metode diperkirakan. Linearitas
respon diverifikasi dengan menggunakan standar mulai dari 1
sampai 30 ng/mL.
Penyesuaian persamaan linier dan koefisien korelasi yang
diperoleh adalah sebagai berikut: untuk susu, y = 0,03x +
0,04, r = 0,9968; untuk darah, y = 0,0148* - 0,00044, r =
=
3

D
(n = 16)
Akurasi 83 + 4 ng/mLc Nilai bersertifikat untuk
Se 81 ± 7,3 ng/mLc

Sehubungan dengan assay.

Sehubungan dengan sampel.
Bahan referensi Darah Utuh: Seronorm batch 205052.
Bahan referensi Susu Bubuk Tanpa Lemak: NIST SRM 1549.

Tabel 3. Konsentrasi selenium yang ditemukan dalam ASI dan

darah utuh

Sampel

Seluruh darah3
Susu manusia

A
N

54
37

Didapatkan dari ibu hamil.

Rata-rata ± SD,

Mg/L

74,67 + 18,74
9,60 ± 4,43

dan Seronorm). Hasil yang diperoleh menunjukkan

110 ± 10 ng/hari
104,3 ± 7,2 ng/hari

Interval kepercayaan 95%

Minimum,

kesesuaian yang baik dengan nilai sertifikasi (Tabel 2).

^9/L

69,54
8.11
untuk wanita

Maksimum,

^g/L

79,79
11.09

0,9997 untuk sampel darah.
Batas deteksi, didefinisikan sebagai konsentrasi selenium
yang sesuai dengan 3 kali standar deviasi blanko reagen,
dihitung dengan 10 blanko reagen, yang mengalami prosedur
destruksi yang sama dengan sampel. Nilai batas deteksi
dihitung sehubungan dengan pengujian dan sampel (Tabel
2). Nilai-nilai ini sebanding dengan yang dilaporkan dalam
literatur; batas penentuan mutlak dalam sampel biologis
adalah 115 pg, sedangkan 110 pg telah dilaporkan untuk
cairan tubuh manusia (4).
Presisi instrumental diperkirakan dari 10 pengukuran
berturut-turut dari pengenceran yang sama dari sampel yang
dicerna (masing-masing darah dan susu). Ketepatan metode
diperkirakan dari analisis 16 alikuot homogen dari sampel
(melibatkan semua langkah pretreatment sampel) yang
dilakukan pada 2 hari yang berbeda (presisi dalam-jalan dan
antara-jalan). Hasilnya , dinyatakan sebagai standar deviasi
relatif (RSDs) ditunjukkan pada Tabel 2.
Keakuratan diperkirakan dengan mengukur kandungan
selenium dari standar referensi biologis (NIST
Analisis Sampel
Metode yang diusulkan diterapkan pada 37 sampel ASI
dan 54 sampel darah utuh yang diperoleh dari wanita hamil.
Hasil analisis ditunjukkan pada Tabel 3.
Kesimpulan
Batas deteksi, rentang kalibrasi linier, dan nilai presisi dan
akurasi yang diperoleh untuk metode yang diusulkan, dan
hasil analitik yang diperoleh dengan metode yang diusulkan
menunjukkan kesesuaiannya untuk menentukan selenium
dalam darah lengkap manusia wanita hamil dan dalam ASI.
Terima kasih
Studi ini merupakan bagian dari proyek yang didukung
secara finansial oleh Social Security Health Research Fund
94/0467.
Kami berterima kasih kepada Prof. Dr. J. Monleon atas penyediaannya
sampel susu manusia dan darah utuh.
Machine Translated by Google

ALEGRIA ET AL.: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 81, No.2, 1998 461

Referensi (6) Wang, CT, Huang, CW, Chou, SS, Lin, DT, Liau, SR, & Wang, RT
(1993) Eur. J.Clin . kimia Klinik.
(1) Neve, JC (1991) /. Lacak Elem. Dis Kesehatan Elektrolit . Biokimia. 31, 759-763
5, 1-17
(7) Ducros, V., Ruffieux, D., Belin, N., & Favier, A. (1994)
(2) Alegria , A. , Barbera , R. , Farre , R. , Lagarda , MJ , Lorente , R. , Analis 119, 1715-1717
& Torres , A. (1996) Alam 40 , 92-95 (3) McLaughlin , K. ,
(8) Navarro, M., Lopez, H., & Lopez, MC (1996) /. AOAC
Dadgar , D. , Smyth , MR , & McMaster , D. ( 1990 ) Analis 115 , 275–
Int. 79, 773-776
278
(4) Negretti de Bratter, V., Bratter, P., & Tomiak, A. (9) Hao, DQ, Xie, GH, Zhang, YM, & Tian, \u200b\u200bGJ (1996)
(1990) /. elemen jejak Dis Kesehatan Elektrolit. 4, 41-48 (5) Bakat 43, 595-600

Mayer, D., Haubenwallner, S., Kosmus, W., & Beyer, W. (1992) Anal. (10) Granjean, P., Nielsen, GD, Jorgensen, PJ, & Horder, M. (1992)
dentang. UU 286, 315-321 Scand. J.Clin. Laboratorium. Menginvestasikan. 52, 321-337

Diu
06
pa
art
81
M
ac
htt
da
ta
ol
2
ja