AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

PETUNJUK PRAKTIKUM
LABORATORIUM AIR DAN MIKROBIOLOGI

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

I. STERILISASI ALAT
 ALAT DAN BAHAN
1. Peralatan gelas 5. Kertas pembungkus (Koran)
2. Oven 6. Tali
3. Autoclave 7. Ethanol
4. Kapas 8. Aquadest

 PROSEDUR
1. STERILISASI KERING
a. Siapkan alat gelas yang akan disterilisasi : pipet, cawan petri, tabung reaksi dan
Erlenmeyer.
b. Pastikan bahwa alat dalam keadaan bersih dan kering.
c. Sumbat lubang pada alat menggunakan kapas secukupnya.
d. Bungkus dengan kertas pembungkus, ikat dengan tali agar kertas tidak lepas.
e. Masukan ke dalam oven dengan suhu 160oC selama 2 jam.
f. Setelah selesai keluarkan alat dari oven dan tunggu hingga dingin sebelum
digunakan.

2. STERILISASI BASAH
a. Siapkan alat gelas yang akan disterilisasi : pipet, cawan petri, tabung reaksi dan
Erlenmeyer.
b. Pastikan bahwa alat dalam keadaan bersih dan kering.
c. Sumbat lubang pada alat menggunakan kapas secukupnya.
d. Bungkus dengan kertas pembungkus, ikat dengan tali agar kertas tidak lepas.
e. Masukkan ke dalam panci autoklaf, tutup rapat dan nyalakan autoclave.
f. Tunggu hingga manometer dan thermometer menunjukkan tanda sterilisasi,
yaitu pada suhu 121oC dengan tekanan 1,2 kg/cm2 (hijau-merah).
g. Sebelum membuka tutup autoclave, keluarkan udara yang didalam panci dan
diamkan selama 15 menit.
h. Setelah selesai keluarkan alat dari oven dan tunggu hingga dingin sebelum
digunakan.

3. STERILISASI KIMIAWI
a. Siapkan alat gelas yang akan disterilisasi : pipet, cawan petri, tabung reaksi
dan Erlenmeyer.
b. Siapkan larutan dengan komposisi ethanol 60% dan aquadest 40%

1
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

c. Usapkan larutan pada permukaan alat dengan menggunakan kapas.

d. Keringkan ke dalam oven dengan suhu 60oC selama 30–60 menit.
II. PEMBUATAN MEDIA
 Media Bakteri
1. Pembuatan Ekstrak Ayam
Alat : Bahan :
- Cawan Petri - Daging Ayam 50 gr
- Beaker Glass - Agar–agar
- Gelas Ukur - Garam
- Pisau
- Kompor
- Pengaduk
- Kapas
- Kertas Pembungkus
- Tali
- Autoclave

Cara Kerja :
a. Cincang halus daging ayam sebanyak 50 gr .
b. Masukkan daging yang telah halus ke dalam gelas beker yang berisi 200 ml
aquades dan merebusnya sampai mendidih.
c. Saring larutan yang telah dingin sebanyak 100 ml kemudian tambahkan 2 gr
agar–agar dan 0,5 gr garam ke dalamnya.
d. Rebus kembali larutan sampai mendidih sambil terus diaduk.
e. Masukkan larutan ke dalam cawan petri sebanyak 10 ml.
f. Bungkus cawan dengan kertas pembungkus dan rekatkan dengan tali (jangan
dibalik)
g. Masukkan ke dalam autoklaf selama ±2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2
atm.
h. Dinginkan media kemudian masukkan media ke dalam lemari pendingin
(kulkas) sebelum medium digunakan dalam praktikum selanjutnya.

 Media E. Coli
1. Pembuatan Lactose Broth Single Strength
Alat : Bahan :
- Labu ukur - Lactose Broth 13 g
- Tabung Reaksi - Aquadest
- Tabung Durham
- Pipet
- Kapas
- Autoclave

2
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

Cara Kerja :
a. Siapkan semua bahan dan lakukan penimbangan
b. Larutkan bahan ke dalam Labu Ukur 1 L dengan aquadest ±1000 ml
c. Bagikan ke dalam tabung reaksi @10 ml dan masukkan tabung durham secara
terbalik
d. Tutup tabung dengan kapas dan bungkus dengan kertas pembungkus, lalu
masukkan ke dalam autoklaf selama ±2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2
atm.

2. Pembuatan Lactose Broth Double Strength

Alat : Bahan :
- Labu ukur - Lactose Broth 26 g
- Tabung Reaksi - Aquadest
- Tabung Durham
- Pipet
- Kapas
- Autoclave

Cara Kerja :
a. Siapkan semua bahan dan lakukan penimbangan
b. Larutkan bahan ke dalam Labu Ukur 1 L dengan aquadest ±1000 ml
c. Bagikan ke tabung reaksi @5 ml dan masukkan tabung durham secara terbalik
d. Tutup tabung dengan kapas dan bungkus dengan kertas pembungkus, lalu
masukkan ke dalam autoklaf selama ±2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2
atm.

3. Pembuatan Brilliant Green Lactose Bile Broth

Alat : Bahan :
- Labu ukur - BGLBB 40 g
- Tabung Reaksi - Aquadest
- Tabung Durham
- Pipet
- Kapas
- Autoclave

Cara Kerja :
a. Siapkan semua bahan dan lakukan penimbangan
b. Larutkan bahan ke dalam Labu Ukur 1 L dengan aquadest ±1000 ml
c. Bagikan ke tabung reaksi @10 ml dan masukkan tabung durham secara terbalik
d. Tutup tabung dengan kapas dan bungkus dengan kertas pembungkus, lalu
masukkan ke dalam autoklaf selama ±2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2
atm.

3
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

4. Pembuatan EC Medium
Alat : Bahan :
- Labu ukur - EC Medium 37 g
- Tabung Reaksi - Aquadest
- Tabung Durham
- Pipet
- Kapas
- Autoclave

Cara Kerja :
a. Siapkan semua bahan dan lakukan penimbangan
b. Larutkan bahan ke dalam Labu Ukur 1 L dengan aquadest ± 1000 ml
c. Bagikan ke tabung reaksi @10 ml dan masukkan tabung durham secara terbalik
d. Tutup tabung dengan kapas dan bungkus dengan kertas pembungkus, lalu
masukkan ke dalam autoklaf selama ±2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2
atm.

4
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

III. PENGAMBILAN SAMPEL

 Sampel Air PDAM
Alat :
- Korek Api
- Botol Sampel steril
- Kertas Pembungkus
- Tali

Cara Kerja :
1. Pilih kran yang cukup sering digunakan, lepaskan bagian untuk aerasi atau
penyaring kalau ada.
2. Bakar ujung kran bagian dalamnya dengan nyala api selama 3–5 menit (jangan
pegang atau membersihkan kran setelah dibakar)
3. Biarkan air keluar dari kran dengan debit tinggi selama ±5 menit.
4. Kecilkan debit air kran dan biarkan mengalir selama ±1 menit.
5. Buka tutup botol dan segerakan untuk mengisi botol sebanyak ¾ bagian dan tutup
kembali.
6. Bungkus dengan kertas pembungkus dan ikat pada bagian leher, beri label.

 Sampel Air Sumur

Alat :
- Timba / bak
- Botol Sampel Steril
- Kertas Pembungkus
- Tali

Cara Kerja :
1. Ambil air sumur dengan titik pengambilan sampel berada dibawah permukaan air
sumur dengan menggunakan bak.
2. Sesaat setelah air sumur diambil, isi botol sampel dengan air dengan cara pegang
bagian bawah botol sampel celupkan botol dengan ke dalaman 2/3 dari kedalaman
bak.
3. Isi botol sebanyak ¾ bagian dan tutup kembali.
4. Bungkus dengan kertas pembungkus dan ikat pada bagian leher, beri label.

 Sampel Air Sungai

Alat :
- Timba / bak
- Botol Sampel Steril
- Kertas Pembungkus
- Tali

5
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

Cara Kerja :
1. Ambil air sungai dengan titik pengambilan sampel berada dibawah permukaan air
sungai.
2. Pegang botol pada bagian bawah, celupkan ke dalam air dengan leher menghadap
miring ke bawah sampai kedalaman botol ± 20 cm
3. Angkat botol dari dalam air dengan mulut botol menghadap keatas dan mulut botol
berhadapan dengan arah aliran air.
4. Isi botol sebanyak minimal ¾ bagian dan tutup kembali.
5. Bungkus dengan kertas pembungkus dan ikat pada bagian leher, beri label.

IV. PEMERIKSAAN SAMPEL MIKROBIOLOGI

 RAGAM I : (7 Tabung)
Untuk spesimen yang sudah diolah atau spesimen yang diperkirakan kerapan bakteri
indikatornya rendah. Menggunakan ragam : 5 x 10 ml ; 1 x 1 ml ; 1 x 0,1 ml.
1. Siapkan :
 5 tabung berisi @5 ml media lactose double strength, yaitu media laktosa yang
berkekuatan 3x (tabung a1 – a5)
 2 tabung berisi @10 ml media lactose single strength (tabung b1 dan b2)
2. Tutup tabung dengan kapas lalu masukkan ke dalam autoklaf selama ±2 jam
dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.
3. Setelah dilakukan proses sterilisasi ke dalam tabung a1-a5 ditanamkan @10 ml
sampel air.
4. Pada tabung b1 tanamkan 1 ml sampel.
5. Pada tabung b2 tanamkan 0,1 ml sampel (lakukan pengenceran sampel dengan 1
ml sampel dan 9 ml larutan pengencer, dan ambil 1 ml untuk ditanam).
6. Agar sampel tercampur rata ke seluruh bagian media, isap dan lepaskan isi tabung
berulang kali menggunakan pipet.
7. Inkubasikan pada suhu 35oC selama 1 x 24 jam atau teruskan 2 x 24 jam apabila
tidak ada gelembung. Apabila pada 2 x 24 jam tidak terdapat gelembung maka
sampel pada tabung tidak mengandung bakteri E. Coli (Munculnya gelembung
pada tes pendugaan, menunjukkan bahwa sampel positif terhadap bakteri E. Coli,
kemudian dilanjutkan pada tes penegasan).
8. Pada tabung pendugaan positif, ambil 1–2 ose isi ditanam ke 1 seri tabung
BGLBB untuk memastikan bakteri golongan koliform. dan ditanam juga ke 1 seri
EC Medium untuk memastikan bakteri golongan koliform tinja. Dikarenakan
ketidak tahuan jumlah tabung yang akan berisi gas positif, maka media BGLBB
serta media EC Medium dibuat sesuai jumlah tabung pada tes perkiraan yaitu 7
tabung.
9. Inkubasikan pada suhu 35oC selama 1 x 24 jam atau teruskan 2 x 24 jam apabila
tidak ada gelembung. Apabila pada 2 x 24 jam tidak terdapat gelembung maka
sampel pada tabung tidak mengandung bakteri baik golongan koliform maupun
tinja.

6
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

 RAGAM II : (9 Tabung) atau (15 tabung)

Untuk spesimen yang belum diolah atau spesimen yang diperkirakan kerapatan bakteri
indikatornya tinggi (sumur, sungai dll). Menggunakan ragam : 3 x 10 ml ; 3 x 1 ml ;
3 x 0,1 ml atau ragam : 5 x 10 ml ; 5 x 1 ml ; 5 x 0,1 ml
1. Siapkan 9 atau 15 tabung reaksi.
2. Tutup tabung dengan kapas lalu masukkan ke dalam autoklaf selama ±2 jam
dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.
3. Penanaman Mikroba dalam Media LB dengan Pengenceran 10-1, 10-2, 10-3
 3 tabung atau 5 tabung yang masing–masing berisi 5 ml media lactose double
strength (tabung a1 – a3 atau a5)
 3 tabung atau 5 tabung yang masing–masing berisi 10 ml media lactose single
strength (tabung b1 – b3 atau b5)
 3 tabung atau 5 tabung yang masing–masing berisi 5 ml media lactose single
strength (tabung c1 – c3 atau c5)
 Kedalam tabung a1 – a3 atau a5 ditanamkan masing–masing 10 ml sampel air
 Kedalam tabung b1 – b3 atau b5 ditanamkan masing–masing 1 ml sampel air
 Kedalam tabung c1 – c3 atau c5 ditanamkan masing–masing 0,1 ml sampel air
 Agar sampel tercampur rata ke seluruh bagian media, isap dan lepaskan isi
tabung berulang kali menggunakan pipet.
 Di inkubasi pada suhu 30o – 32o C selama 48 jam.
4. Amati masing–masing tabung untuk melihat ada tidaknya gas, adanya gas
menunjukkan tes perkiraan positif. Tes perkiraan harus dilanjutkan dengan tes
penegasan.
5. Satu seri tabung BGLBB yang sudah ditanami, diinkubasi pada suhu 35℃/37℃
untuk memastikan adanya bakteri golongan koliform. Dan satu seri lagi untuk
pemeriksaan golongan koliform tinja. Dikarenakan ketidak tahuan jumlah tabung
yang akan berisi gas positif, maka media BGLBB serta media EC Medium dibuat
sesuai jumlah tabung pada tes perkiraan yaitu 9 tabung.
 Pembacaan dilakukan setelah 2 x 24 jam dengan melihat jumlah tabung BGLBB
yang menunjukkan positif gas. Dapat juga pembacaan dilakukan pada 1 x 24
jam saja, jika ternyata semua tabung yang sudah ditanami sudah positif dalam
24 jam.

Cara pembuatan air pengencer

Timbang 9 gram garam Sodium Klorida (NaCl) / garam Potassium dehydrogen
Phospate (KH2PO4), larutkan dengan aquades sampai volume 1 L.
Masukkan kedalam tabung fermentasi @ 9 ml. Sumbat ujung tabung dengan kapas lalu
sterilkan pada suhu 121 ℃ selama 20 menit.

7
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

Sampel

BGLBB (35,5˚C)

Ada gas setelah 24 jam Tidak ada gas

Tes Pendugaan

setelah 24 jam

Inkubasi dilanjutkan
24 jam

Ada gas Tidak ada gas

Setelah 24 jam Setelah 48 jam

Tidak ada
Medium EC (44˚C)
Bakteri coli

Ada gas Tidak ada gas

Setelah 24 jam Setelah 24 jam
Tes Penegasan

Inkubasi dilanjutkan
24 jam

Ada gas setelah 24 jam Tidak ada gas

Ada bakteri Setelah 48 jam
Coli tinja
Tidak ada bakteri Coli tinja

8
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

PROSEDUR PEMROSESAN HASIL PRAKTIKUM

Perhitungan nilai MPN (Most Probable Number) untuk tes Mikrobiologi (Organisme
Koliform Total dan Koliform Tinja.
Pembacaan hasil dengan cara berikut :
Catat jumlah tabung confirmative (tabung BGLBB) yang menunjukkan positif gas. Angka
yang diperoleh dicocokkan dengan tabel MPN, maka akan diperoleh indeks MPN Coliform
untuk tabung yang diinkubasikan pada suhu 37oC dan indeks MPN E. Coli untuk tabung yang
diinkubasikan pada suhu 44oC.
Untuk ragam 2, bila penanaman dengan volume terkecil (dalam hal ini 0,1 ml) 1 seri tabung
menunjukkan positif gas, maka jumlah tabung harus ditambah 2 kelipatan 1/10 hingga
diperoleh jumlah tabung positif gas untuk penanaman pada volume terkecil < 5.

Penentuan nilai MPN diambil dari 3 angka terakhir. Tergantung pada nilai beberapa kali
faktor penurunan kelipatan 10 yang digunakan, nilai MPN yang didapat dikalikan dengan
faktor tersebut.

Contoh pembacaan :
1. Untuk Ragam I
 Dari penamaan dengan volume 10 ml diperoleh 4 tabung BGLBB positif gas.
 Dari penamaan dengan volume 1 ml diperoleh 1 tabung BGLBB positif gas.
 Dari penamaan dengan volume 0,1 ml diperoleh 0 tabung BGLBB positif gas.
Maka nilai MPN/100 ml adalah 21
2. Untuk Ragam II
 Dari penamaan dengan volume 10 ml diperoleh 5 tabung BGLBB positif gas.
 Dari penamaan dengan volume 1 ml diperoleh 4 tabung BGLBB positif gas.
 Dari penamaan dengan volume 0,01 ml diperoleh 2 tabung BGLBB positif gas.
Maka nilai MPN untuk 5–4–2 adalah 220
 Dari penamaan dengan volume 10 ml diperoleh 5 tabung BGLBB positif gas.
 Dari penamaan dengan volume 1 ml diperoleh 5 tabung BGLBB positif gas.
 Dari penamaan dengan volume 0,1 ml diperoleh 5 tabung BGLBB positif gas.
Bila dijumpai keadaan demikian dimana nilai MPN>2400, maka jumlah tabung ditambah
dengan seri 5 x 0,01 ml dan 5 x 0,001 ml.

Bila :
 Dari penamaan dengan volume 0,01 ml diperoleh 4 tabung BGLBB positif gas.
 Dari penamaan dengan volume 0,001 ml diperoleh 1 tabung BGLBB positif gas.

9
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

Maka angka yang diambil adalah 5–4–1 (5 x 0,01 ml ; 4 x 0,01 ml ; 1 x 0,001 ml) nilai
MPN yang diperoleh dari tabel harus dikalikan 100 untuk mendapatkan hasil MPN yang
sebenarnya, maka nilai MPN/100 ml untuk ssampel ini adalah 170 x 100 = 17.000.
Contoh beberapa ragam perkiraan yang dipilih dan faktor perkalian yang digunakan untuk
mendapatkan nilai MPN.
Volume Ragam yang Faktor
Contoh
1 0,1 0,01 0,001 0,0001 dipilih perkalian
1 5 5 2 0 0 5-2-0 100
2 5 5 4 1 0 5-4-1 100
3 5 3 0 0 0 5-3-0 10
4 5 5 5 3 1 5-3-1 1000
5 0 1 0 0 0 0-1-0 10

Tabel MPN
Ragam I : 5 x 10 ml ; 1 x 1 ml dan 1 x 0,1 ml
Volume
MPN/100 ml
10 1 0,1
0 0 1 <2
0 1 0 2
0 1 1 4
1 0 0 2,2
1 0 1 4,4
1 1 0 4,4
1 1 1 6,7
1 1 1 5
2 0 0 7,5
2 0 1 7,6
2 1 0 10
3 0 1 12
3 0 1 12
3 1 0 16
3 1 0 15
4 0 1 20
4 1 0 21
4 1 1 27
5 0 0 38
5 0 1 96
5 1 0 108
5 1 1 240

10
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
 AKADEMI TEKNIK TIRTA WIYATA MAGELANG

Ragam II : 5 x 10 ml ; 5 x 1 ml dan 5 x 0,1 ml

Volume Index Volume
Index
MPN/100 ml
10 1 0,1 10 1 0,1 MPN/100 ml
10
0 0 1 <2 4 2 1 26
0 0 1 2 4 3 0 27
0 1 0 2 4 3 1 33
0 2 0 4 4 4 0 34
1 0 0 2 5 0 0 23
1 0 1 4 5 0 1 31
1 1 0 4 5 0 2 43
1 1 1 6 5 1 0 33
1 2 0 6 5 1 1 46
2 0 0 5 5 1 2 63
2 0 1 7 5 2 0 49
2 1 0 7 5 2 1 70
2 1 1 9 5 2 2 94
2 2 0 9 5 3 0 79
2 3 0 12 5 3 1 110
3 0 0 8 5 3 2 140
3 0 1 11 5 3 3 180
3 1 0 11 5 4 0 130
3 1 1 14 5 4 1 170
3 2 0 14 5 4 2 220
3 2 1 17 5 4 3 280
3 3 0 17 5 4 4 350
4 0 0 13 5 5 0 240
4 0 1 17 5 5 1 350
4 1 0 17 5 5 2 542
4 1 1 21 5 5 3 920
4 1 2 26 5 5 4 1600
4 2 0 23 5 5 5 >2400

11
PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI