a.

Analisa Mikrobiologi
1) Sterilisasi Alat
a) Dengan menggunakan Oven

Alat dan Bahan :

Oven, kertas koran, rak tabung, gelas kimia, tabung reaksi, tabung durham,
pipet volume 5 ml dan 10 ml

Prosedur Kerja :

tabung reaksi, tabung durham,

gelas kimia, pipet volume

- Dibersihkan dan dikeringkan di tempat terbuka

- Disusun tabung reaksi pada rak tabung
- Dimasukkan tabung durham ke dalam gelas kimia
- Dibungkus pipet volume dengan kertas koran dan dipastikan
permukaan pipet tertutup rapat tanpa ada celah
- Dimasukkan alat ke dalam oven
- Ditutup oven dan dinyalakan oven pada suhu 120°C selama 4
jam

Alat yang telah

steril

b) Dengan menggunakan Autoklaf

Alat dan Bahan :
Autoklaf, botol sampel
Prosedur Kerja :

Botol sampel

- Dibersihkan dan dikeringkan di tempat terbuka

- Dimasukkan alat ke dalam autoklaf pada tekanan 1 atm pada
suhu 120°C selama 4 jam
(autoklaf sebelumnya telah diisi air pada bagian bawahnya )
- Ditutup autoklaf dan dinyalakan
- Dimatikan dan dibuka katup pembuang gas pada autoklaf
setelah 4 jam
- Ditunggu hingga botol dingin

Botol sampel yang

telah steril
2) Cara pengambilan sampel sampling konsumen
a) Alat dan Bahan
Botol sampel, pinset, spiritus, kapas, korek api, es batu
b) Prosedur Kerja

Kran/pipa air sampel

- Dibuka kran dan dibiarkan air mengalir selama beberapa

menit, kemudian ditutup kembali
- Dibasahi kapas dengan spiritus, kemudian dibakar kapas
tersebut dengan menggunakan pinset sebagai penjepit
- Dipanaskan mulut kran dengan api dari kapas
- Dibuka kran dan dibiarkan air mengalir, sementara mulut
botol sampel dipanaskan pula secara merata dengan api dari
kapas (tutup botol telah dibuka sebelumnya)
- Diisi botol sampel dengan air dari kran dan segera dipanaskan
kembali mulut botol setelah terisi air hampir penuh
- Ditutup botol sampel dan dimasukkan ke dalam box yang
telah berisi es batu
Sampel air

* Jangka waktu pengambilan sampel air yang telah diolah sampai

dilakukan analisa adalah 24 jam, sedangkan untuk sampel air yang
belum diolah adalah ≤ 6 jam.

3) Pembuatan Media SSL (Single Strength Lactose)

a) Alat dan Bahan
Alat :
Tabung reaksi, tabung durham, kapas, rak tabung reaksi, pipet volume
5 ml, karet penghisap, gelas ukur, Erlenmeyer, gelas kimia, pengaduk,
neraca analitik, autoklaf
Bahan :
aquades, Lactose Broth
 b) Prosedur Kerja

Lactose Broth
- Ditimbang sebanyak 4,55 gram
- Dilarutkan dalam 350 ml aquades dan diaduk hingga
homogen
- Dipipet sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang sebelumnya telah diisi dengan tabung durham (±
sebanyak 70 tabung reaksi)
- Disumbat tabung reaksi dengan menggunakan kapas
- Dimasukkan tabung ke dalam gelas kimia, lalu dimasukkan
ke dalam autoklaf pada tekanan 1 atm pada suhu 120°C
selama 4 jam
(autoklaf sebelumnya telah diisi air pada bagian bawahnya )
- Ditutup autoklaf dan dinyalakan
- Dimatikan dan dibuka katup pembuang gas pada autoklaf
setelah 4 jam
- Ditunggu hingga media SSL dingin
Media SSL

*media SSL yang telah dingin kemudian dikeluarkan dari autoklaf dan
disimpan dalam lemari es

4) Pembuatan Media TSL (Triple Strength Lactose)

a) Alat dan Bahan
Alat :
Tabung reaksi, tabung durham, kapas, rak tabung reaksi, pipet volume
10 ml, karet penghisap, gelas ukur, Erlenmeyer, gelas kimia, pengaduk,
neraca analitik, autoklaf
Bahan :
aquades, Lactose Broth
 b) Prosedur Kerja

Lactose Broth
- Ditimbang sebanyak 11,7 gram
- Dilarutkan dalam 300 ml aquades dan diaduk hingga
homogen
- Dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang sebelumnya telah diisi dengan tabung durham (±
sebanyak 30 tabung reaksi)
- Disumbat tabung reaksi dengan menggunakan kapas
- Dimasukkan tabung ke dalam gelas kimia, lalu dimasukkan
ke dalam autoklaf pada tekanan 1 atm pada suhu 120°C
selama 4 jam
(autoklaf sebelumnya telah diisi air pada bagian bawahnya )
- Ditutup autoklaf dan dinyalakan
- Dimatikan dan dibuka katup pembuang gas pada autoklaf
setelah 4 jam
- Ditunggu hingga media TSL dingin
Media TSL

*media TSL yang telah dingin kemudian dikeluarkan dari autoklaf dan
disimpan dalam lemari es

5) Pembuatan Media BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth)

a) Alat dan Bahan
Alat :
Tabung reaksi, tabung durham, kapas, rak tabung reaksi, pipet volume
5 ml, karet penghisap, gelas ukur, erlenmeyer, gelas kimia, pengaduk,
neraca analitik, autoklaf
Bahan :
aquades, Brilliant Green Lactose Bile Broth
 b) Prosedur Kerja

BGLB
- Ditimbang sebanyak 9,6 gram
- Dilarutkan dalam 240 ml aquades dan diaduk hingga
homogen
- Dipipet sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang sebelumnya telah diisi dengan tabung durham (±
sebanyak 48 tabung reaksi)
- Disumbat tabung reaksi dengan menggunakan kapas
- Dimasukkan tabung ke dalam gelas kimia, lalu dimasukkan
ke dalam autoklaf pada tekanan 1 atm pada suhu 120°C
selama 4 jam
(autoklaf sebelumnya telah diisi air pada bagian bawahnya )
- Ditutup autoklaf dan dinyalakan
- Dimatikan dan dibuka katup pembuang gas pada autoklaf
setelah 4 jam
- Ditunggu hingga media BGLB dingin
Media BGLB

*media BGLB yang telah dingin kemudian dikeluarkan dari autoklaf

dan disimpan dalam lemari es

1) Pembiakan bakteri dari sampel air dan penentuan MPN (Most Probable
Number)/ JPK (Jumlah Perkiraan Kuman)
a) Uji Perkiraan (Presumtive Test)
Alat dan Bahan :

Rak tabung reaksi, pipet volume 5 ml, karet penghisap, pembakar sipitus,
korek api, kertas label, alcohol (etanol), media TSL dan SSL, sampel air

Prosedur Kerja :

a. Sterilkan terlebih dahulu tempat yang akan digunkaan untuk

pembiakan bakteri dengan menggunkan alcohol.

b. Disusun media bakteri pada rak tabung reaksi menjadi dua bagian
yaitu media TSL dan media SSL, digunakan 5 media SSL dan 2
media TSL dengan ragam 5:1:1 (5 media SSL diisi sampel air
 sebanyak 10 ml, 1 media TSL diisi dengan sampel air sebanyak 1
ml, dan 1 media TSL diisi sampel air sebanyak 0,1 ml)

 Sampel air

- Dimasukkan ke dalam media SSL sebanyak 5 ml

(mulut tabung media SSL telah dipanaskan permukaannya
dengan menggunakan spiritus)
- Dipanaskan kembali mulut tabung reaksi dengan
menggunakan spiritus
- Disumbat mulut tabung dengan menggunakan kapas
- Disusun kembali media SSL pada rak tabung yang telah
diberi label nomor sampel, dan diinkubasi pada suhu 35°C, 24
jamyang telah
Media SSL
ditambahkan sampel air

Sampel air

- Dimasukkan ke dalam media TSL sebanyak 1 ml

(mulut tabung media TSL telah dipanaskan permukaannya
dengan menggunakan spiritus)
- Dipanaskan kembali mulut tabung reaksi dengan
menggunakan spiritus
- Disumbat mulut tabung dengan menggunakan kapas
- Disusun kembali media TSL pada rak tabung yang telah
diberi label nomor sampel, dan diinkubasi pada suhu 35°C, 24
jam
Media TSL yang telah
ditambahkan sampel air

Sampel air

- Dimasukkan ke dalam media TSL sebanyak 0,1 ml

(mulut tabung media TSL telah dipanaskan permukaannya
dengan menggunakan spiritus)
- Dipanaskan kembali mulut tabung reaksi dengan
menggunakan spiritus
- Disumbat mulut tabung dengan menggunakan kapas
- Disusun kembali media TSL pada rak tabung, dan diinkubasi
pada suhu 35°C, 24 jam
 -
Media TSL yang telah

ditambahkan sampel air
 a. Langkah uji perkiraan selanjutnya yaitu identifikasi tabung yang
terbukti positif terhadap pengujian yang ditandai dengan adanya
gelembung pada tabung durham.
b. Tabung positif selanjutnya diuji lebih lanjut dengan uji penegasan,
sedangkan untuk tabung negatif tidak dilakukan uji penegasan

b) Uji Penegasan
Alat dan Bahan :

Rak tabung reaksi, kawat ose, pembakar sipitus, korek api, kertas label,
alcohol (etanol), media BGLB, media TSL dan SSL yang terbukti positif
pada uji perkiraan

Prosedur Kerja :
a. Sterilkan terlebih dahulu tempat yang akan digunkaan untuk
pembiakan bakteri dengan menggunkan alcohol.
b. Disiapkan 2 media BGLB untuk setiap tabung positif

media TSL dan SSL yang terbukti positif

- Dipanaskan mulut tabung dengan menggunakan spiritus

- Dicelupkan kawat ose ke dalam media TSL dan SSL yang
terbukti positif
(kawat ose sebelumnya telah dibakar terleih dahulu dengan
menggunakan pembakar spiritus)
- Dimasukkan kawat ose tsb ke dalam media BGLB
(mulut tabung media BGLB sebelumnya telah dipanaskan
permukaannya dengan menggunakan pembakar spiritus)
- Dipanaskan kembali mulut tabung media BGLB yang telah
ditanamkan bakteri
- Disumbat mulut tabung dengan kapas penutup
- Diulangi langkah tersebut pada media BGLB yang kedua, dan
diberi label
- Disusun 2 media BGLB tsb pada rak tabung yang berbeda
- Diinkubasi media BGLB tersebut dimana rak tabung 1 pada
suhu 35°C dan rak tabung 2 pada suhu 45°, ± 24 jam

Media BGLB yang telah ditanamkan

bakteri dari sampel air
a. Langkah uji penegasan selanjutnya yaitu identifikasi tabung yang
terbukti positif terhadap pengujian yang ditandai dengan adanya
gelembung pada tabung durham.
b. Tabung positif selanjutnya ditentukan dengan MPN(Most Probable
Number)/ JPK (Jumlah Perkiraan Kuman) menggunakan tabel ragam
5:1:1.
Tabel 12. Penentuan MPN/JPK
Jumlah Tabung Positif MPN/100
5 x 10 ml 1 x 1 ml 1 x 0,1 ml
5 1 1 >240
5 1 0 240
5 0 1 96
5 0 0 36
5 - - 16
4 1 1 27
4 1 0 21
4 0 1 20
4 0 0 15
4 - - 16
3 1 1 16
3 1 0 12
3 0 1 12
3 0 0 8,8
3 - - 9,2
2 1 1 -
2 1 0 10
2 0 1 7,6
2 0 0 7,5
2 - - 5,1
1 1 1 6,7/5,0
1 1 0 4,4
1 0 1 4,4