BAB III

METODE

3.1 Pembuatan Media

A. Media NA
1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat :
- Beaker glass
- Ose
- Batang pengaduk
- Cawan petri
- Hot plate
- Erlenmeyer
- Magnetic stirrer
- Lampu spritus
- Aluminium foil
- Tali
- Kertas buram
- Autoclaf
- Oven
- Neraca analitik
b. Bahan :
- Bubuk Natrium Agar
- Aquades 200 ml
3. Prosedur Kerja
1) Disinfeksi area kerja dengan alkohol 70%.
2) Siapkan alat dan bahan yang digunakan.
3) Cawan petri dibungkus dengan kertas buram lalu di sterilkan
didalam oven dengan suhu 150 C selama 2 jam.
4) Ambil bubuk NA dengan menggunakan aluminium foil yang telah
ditimbang sebanyak 5,6 g.
 5) Kemudian bubuk tersebut dituangkan kedalam Erlenmeyer.
6) Beaker glass yang sudah berisi aquades sebanyak 200 ml
dituangkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi bubuk NA
tadi.
7) Homogenkan campuran bubuk media dan aquades dengan
memanaskan di atas hot plate magnetic stirer suhu 100 C dengan
kecepatan 60 rpm.
8) Setelah dipanaskan, kemudian Erlenmeyer ditutup dengan
kapas dan aluminium foil lalu diikat dengan tali.
9) Kemudian Erlenmeyer diletakkan pada autoclaf pada suhu 121C
selama 15 menit.
10) Selanjutnya media dituangkan pada cawan petri yang sudah
steril. Cawan petri dan Erlenmeyer yang berisi media di des
terlebih dahulu dengan api bunsen sebelum dan sesudah
menuangkan media.
11) Kemudian media yang sudah memadat pada cawan petri,
dibalikkan dan dapat diberi label.
12) Media selanjutnya dapat disimpan di dalam chiller kulkas.
B. Media TSIA
1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat :
- Beaker glass
- Ose
- Batang pengaduk
- Tabung reaksi
- Hot plate
- Erlenmeyer
- Magnetic stirrer
- Lampu spritus
- Aluminium foil
- Tali
- Kertas buram
 - Autoclaf
- Oven
- Kapas
- Neraca analitik
b. Bahan :
- Bubuk Triple Sugar Iron Agar
- Aquades 100 ml
3. Prosedur Kerja
1) Disinfeksi area kerja dengan alkohol 70%.
2) Siapkan alat dan bahan yang digunakan.
3) Tabung reaksi dibungkus dengan kertas buram lalu di sterilkan
didalam oven dengan suhu 150 C selama 2 jam.
4) Ambil bubuk Triple Sugar Iron Agar dengan menggunakan
aluminium foil yang telah ditimbang sebanyak 6,5 g.
5) Kemudian bubuk tersebut dituangkan kedalam Erlenmeyer.
6) Beaker glass yang sudah berisi aquades sebanyak 100 ml dituangkan
ke dalam Erlenmeyer yang berisi bubuk Triple Sugar Iron Agar tadi.
7) Homogenkan campuran bubuk media dan aquades dengan
memanaskan di atas hot plate magnetic stirer suhu 100 C dengan
kecepatan 60 rpm.
8) Setelah dipanaskan, kemudian Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan
aluminium foil lalu diikat dengan tali.
9) Kemudian Erlenmeyer diletakkan pada autoclaf pada suhu 121C
selama 15 menit.
10) Selanjutnya media dituangkan pada tabung reaksi yang sudah steril.
Tabung reaksi dan Erlenmeyer yang berisi media di des
11) terlebih dahulu dengan api bunsen sebelum dan sesudah
menuangkan media.
12) Kemudian media ditutup dengan kapas dan diletakkan dengan posisi
sedikit miring, media yang sudah memadat pada tabung reaksi dapat
diberi label.
13) Media selanjutnya dapat disimpan di dalam chiller kulkas.
C. Media MCA
1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat :
- Petri disk
- Incubator
- Automatic stirrer
- Neraca Analitik
- Erlenmeyer
- Batang pengaduk
b. Bahan :
- Bubuk MCA
- Aquades
- Aluminium foil
- Kapas
- Tissue
- Alkohol
3. Prosedur Kerja
1) Disinfeksi meja bekerja & sterilisasi 12 petri disk, dengan
membungkus dengan kertas coklat ke dalam inkubasi dengan
suhu 150℃ selama 2 jam.
2) Timbang bubuk MCA sebanyak 3,1 g menggunkan neraca
analitik.
3) Siapkan 100 ml aquades di dalam gelas ukur.
4) Tuangkan bubuk MCA kedalam gelas elenmeyer, dilanjutkan
dengan menuangkan aquades ke dalam gelas elenmeyer.
5) Homogenkan aquades dan bubuk MCA dengan menggunkan
automatic stirrer dengan temperatur 100C dengan kecepatan
60 rpm.
6) Setelah larutan tersebut homogen, tutup bibir gelas elenmeyer
dengan kapas dan alumunium foil.
 7) Sterilisasi media tersebut pada autoclave suhu 121 ℃ selama
15 menit.
8) Setelah selesai di inkubasi, diamkan pada suhu ruang beberapa
saat hingga larutan tersebut hangat.
9) Tuangkan larutan MCA kedalam petri dist secukupnya,
berikan label pada petri disk.
10) Tunggu media hingga padat, media yang sudah padat dapat
dibalik posisi petri disknya.
11) Bungkus dengan kertas coklat.
12) Masukkan media ke dalam kulkas dan di tunggu 24 jam untuk
dapat melakukan uji selanjutnya.
D. Media MRVP
1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat :
- Neraca Analitik
- Batang Pengaduk
- Gelas ukur
- Beaker glass
- Labu Erlenmayer
- Tabung reaksi
- Aluminium foil (wadah saat menimbang)
b. Bahan :
- Media MRVP (1.7 g)
- Aquades (100 mL)
3. Prosedur Kerja
1) Siapkan media MRVP (bubuk) dan aquades dalam beaker glass.
2) Timbang media MRVP 1.7 gram.
3) Masukkan media ke dalam Labu Erlenmayer.
4) Tambahkan aquades 100 mL.
5) Aduk hingga homogen.
 6) Lalu tuang media ke 10 tabung reaksi, masing masing tabung
reaksi berisi 10 ml media MRVP.
7) Tutup tabung reaksi dengan kapas dan ikat tabung reaksi menjadi
2 bagian (masing-masing ada 5 tabung reaksi) dan bungkus
menggunakan kertas lalu diikat kembali.
8) Sterilisasi media menggunakan autoclave pada suhu 121C.
9) Media MRVP bisa langsung digunakan untuk uji biokimia.
Apabila ingin disimpan, maka biarkan media dingin lalu
masukkan ke dalam kulkas dengan meletakkan tabung-tabung
reaksi ke dalam beaker glass dan beri label agar tidak tertukar.
E. Media SC
1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat :
- Rak tabung
- Tabung reaksi
- Incubator
- Automatic stirrer
- Neraca Analitik
- Erlenmeyer
- Batang pengaduk
b. Bahan
- Bubuk SC
- Aquades
- Aluminium foil
- Kapas
- Tissue
- Alkohol
3. Prosedur Kerja
1) Sterilisasi 10 tabung reaksi terlebih dahulu dengan menutup
dengan kapas dan kertas ke dalam oven suhu 150℃ selama 2
jam
 2) Timbang bubuk SC (Simon Citrate) sebanyak 2,3 gram dengan
menggunakan neraca analitik.
3) Siapkan 100 ml akuades ke dalam erlenmeyer.
4) Homogenkan bubuk SC dengan 100 ml akuades tadi dengan
menggunakan automatic stirrer.
5) Setelah homogen, tutup erlenmeyer dengan menggunakan
kapas dan aluminium foil.
6) Sterilisasi media ke dalam autoclave 121 ℃ selama 15 menit.
7) Setelah selesai diinkubasi, biarkan beberapa saat, tetapi jangan
sampai dingin.
8) Ambil tabung reaksi yang disterilisasi tadi.
9) Tuangkan cairan SC ke 10 tabung reaksi tadi masing-masing
10 ml lalu dimiringkan hingga media membentuk lereng,
biarkan hingga padat.
10) Berikan label pada setiap tabung.
11) Disimpan dikulkas yang selanjutnya dapat digunakan untuk uji
biokimia.
F. Media CCA
1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat :
- Rak tabung
- Tabung reaksi
- Incubator
- Automatic stirrer
- Neraca Analitik
- Erlenmeyer
- Batang pengaduk
- Autoclave
b. Bahan
- Bubuk SC
- Aquades
 - Aluminium foil
- Kapas
- Tissue
- Alkohol
3. Prosedur Kerja
1) Sebelum memulai pembuatan media, lakukan desinfeksi area
kerja.
2) Siapkan alat dan bahan yang diperlukan.
3) Sterilisasi 10 cawan petri terlebih dahulu dengan menutup
dengan kertas ke dalam oven pada suhu 150℃ selama ±2 jam.
4) Timbang serbuk media CCA 28,1gram.
5) Larutkan dengan akuades 100 ml didalam Erlenmeyer.
6) Homogenkan dengan stirrer.
7) Tutup dan sterilkan pada autoclave sampai suhu 121C selama
15 menit.
8) Setelah selesai, tunggu beberapa saat hingga media tersebut
hangat.
9) Nyalakan api bunsen, lalu sterillkan cawan petri dengan api
bunsen, kemudian tuang media tersebut kedalam cawan petri.
10) Diamkan sampai media benar-benar memadat.
G. Media EMB
1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi
Poltekkes Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat :
- Neraca analitik
- Batang pengaduk
- Aluminium foil
- Hot plate
- Erlenmeyer
- 10 buah cawan petri
- Autoklaf
b. Bahan
 - 7,5 gram media EMB
- 200 ml Aquades
3. Prosedur Kerja
1. Siapkan aluminium foil sebagai wadah menimbang media
dan batang pengaduk untuk membantu menuang media ke
aluminium foil.
2. Timbanglah media pada neraca analitik. Formula media
EMB pada label kemasan adalah 37,5 gram/1 liter
aquades. Sehingga untuk membuat 200 ml larutan media,
diperlukan sebanyak 7,5 gram media EMB.
3. Larutkan media ke dalam 200 ml aquades pada erlenmeyer
dengan cara dipanaskan pada suhu 80°C sambil diaduk
menggunakan alat hot plate dan magnetic stirrer. Pastikan
media larut dengan sempurna dan tidak meninggalkan
gumpalan.
4. Tutup Erlenmeyer menggunakan kapas.
5. Sterilisasi media menggunakan Autoklaf pada suhu 121°C
dan tekanan 2 Atm selama 15 menit.
6. Setelah disterilisasi saat media dalam kondisi masih cair
(sekitar suhu 45-50 °C), media dapat secara langsung
dituang ke masing-masing cawan petri sesuai kebutuhan
hingga memadat.
H. Media SIM
1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat
- Neraca analitik
- Batang pengaduk
- Aluminium foil
- Hot plate
- Erlenmeyer
- 10 tabung reaksi
 - Autoklaf
b. Bahan
- 3 gram media SIM
- 100 ml Aquades
3. Posedur Kerja
1) Siapkan aluminium foil sebagai wadah menimbang media dan
batang pengaduk untuk membantu menuang media ke
aluminium foil.
2) Timbanglah media pada neraca analitik. Formula media SIM
pada label kemasan adalah 30 gram/1 liter aquades. Sehingga
untuk membuat 100 ml larutan media, diperlukan sebanyak 3
gram media SIM.
3) Larutkan media ke dalam 100 ml aquades pada erlenmeyer
dengan cara dipanaskan pada suhu 80°C sambil diaduk
menggunakan alat hot plate dan magnetic stirrer. Pastikan
media larut dengan sempurna dan tidak meninggalkan
gumpalan.
4) Tuangkan media yang telah larut ke dalam maisng - masing
tabung reaksi.
5) Tutup tabung reaksi dengan kapas, ikat tabung – tabung
tersebut menjadi satu untuk kemudian di autoklaf.
6) Sterilisasi media menggunakan Autoklaf pada suhu 121°C dan
tekanan 2 Atm selama 15 menit.

3.2 Inokulasi Bakteri

1. Waktu dan Tempat : 12 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan :
a. Alat
- Ose
- Lampu spritus
b. Bahan
- Media EMB, CCA dan MCA

3. Prosedur Kerja
 1) Disinfeksi area kerja dengan alkohol 70%.
2) Siapkan alat dan bahan yang digunakan.
3) Panaskan ose dengan sudut 45 sampai ujungnya merah sampai ke
tangkai.
4) Dinginkan ose sebelum mengambil urine.
5) Ambil urine menggunakan ose secukupnya.
6) Panaskan bagian luar petri dish yang berisi media EMB.
7) Kemudian, buka petri dish dan inokulasi sampel urine dengan streak 4
kuadran.
8) Panaskan kembali bagian luar petri dish kemudian simpan media
inokulasi di dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37 C.
9) Ulangi langkah dari nomor 3-6 untuk media CCA dan MCA

3.3 Peremajaan Bakteri

1. Waktu dan Tempat : 18 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi Poltekkes
Kemenkes Denpasar
2. Alat dan Bahan
a. Alat
- Ose steril
b. Bahan
- Media Agar yang sudah tumbuh bakteri
- Media EMB (dari proses inokulasi)
3. Prosedur Kerja
1) Siapkan media yang sudah tumbuh bakteri dari proses inokulasi
sebelumnya.
2) Kemudian ambil koloni bakteri tunggal dari media inokulasi
menggunakan ose steril yang sudah dipanaskan api bunsen.
3) Lalu streak 4 kuadran pada media NA.
4) Media dari peremajaan bakteri selanjunya diinkubasi pada inkubator
suhu 37  C. Selama 24 jam.

3.4 Uji Biokimia

1. Waktu dan Tempat : 19 Oktober 2022, Lab. Bakteriologi
Poltekkes Kemenkes Denpasar
 2. Alat dan Bahan
a. Alat
- Ose
- Spritus
- Pipet tetes
- Mikro pipet
b. Bahan
- Media NA (dari proses peremajaan)
3. Prosedur Kerja
A. Media TSIA
1) Siapkan alat dan bahan (koloni bakteri pada media EMB).
2) Panaskan ose jarum sampe memerah dengan sudut 45.
3) Dinginkan ose jarum. Ambil koloni bakteri tunggal dari media EMB.
4) Selanjutnya tusuk kedalam media TSIA (tidak sampai dasar)
dilanjutkan dengan penggoresan dilereng media TSIA.
5) Tutup kembali dengan kapas, lalu diinkubasi didalam inkobator suhu
37 C selama 24 jam.
B. Media SIM
1) Siapkan alat dan bahan (koloni bakteri pada media EMB).
2) Panaskan ose jarum sampe memerah dengan sudut 45.
3) Dinginkan ose jarum. Ambil koloni bakteri tunggal dari media EMB.
4) Tusukkan ose jarum pada media SIM tegak lurus ke dalam
2/3 bagian media.
5) Tutup kembali dengan kapas, lalu diinkubasi didalam inkobator
suhu 37 C selama 24 jam.
6) Setelah diinkubasi selanjutnya media SIM ditambahkan
dengan reagen kovac sebanyak 500 mikron.
C. Media MRVP
1) Siapkan alat dan bahan (koloni bakteri pada media EMB).
2) Panaskan ose bulat sampe memerah dengan sudut 45.
3) Dinginkan ose bulat. Ambil koloni bakteri tunggal dari media EMB.
4) Campurkan pada media MRVP hingga homogen.
 5) Tutup kembali dengan kapas, lalu diinkubasi didalam inkobator suhu 37 C
selama 24 jam.
6) Setelah 24 jam, kemudian media tersebut dibagi menjadi dua yaitu MR dan
VP.
7) Untuk uji MR akan ditetesi reagen methyl red menggunakan pipet tetes
sebanyak 5 tetes, lalu diamati perubahan warna yang terjadi.
8) Untuk uji VP digunakan 2 reagen yaitu 𝛼-naphthol dan KOH 40%, dengan
menggunakan mikro pipet reagen 𝛼-naphthol di tambahkan 600 mikro atau
0,6 ml dan KOH 40% 200 mikro atau 0,2 ml. Amati perubahan warna yang
terjadi.
D. Media SC
1) Siapkan alat dan bahan (koloni bakteri pada media EMB).
2) Panaskan ose bulat sampe memerah dengan sudut 45.
3) Dinginkan ose bulat. Ambil koloni bakteri tunggal dari media EMB.
4) Ose distreak pada lereng media SC.
5) Tutup kembali dengan kapas, lalu diinkubasi didalam inkobator suhu 37 C
selama 24 jam.