PRAKTIKUM

BIOKIMIA
EMS 2020

Penyusun:
Tim Dosen Biokimia

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS WIJAYA KUSUMA
SURABAYA
DAFTAR ISI

1
DAFTAR ISI .......................................................................................................... 1
GLUKOSA SERUM ............................................................................................. 3
A. METODE GOD-PAP ................................................................................... 3
B. Metode Point of Care Testing (POCT) ....................................................... 5
TRIGLISERIDA ................................................................................................... 9
KOLESTEROL ................................................................................................... 12
PROTEIN SERUM ............................................................................................. 15
Globulin = T.P – Albumin ................................................................................ 17

2
 1.GLUKOSA SERUM

A. METODE GOD-PAP

I. TUJUAN PRAKTIKUM:
Untuk menentukan kadar glukosa dalam serum menggunakan
Spektrofotometer

II. Pendahuluan:
Pengukuran kadar glukosa darah diperlukan untuk menunjang diagnosis beberapa
penyakit, termasuk diabetes melitus. Kadar glukosa darah dapat diukur pada saat
puasa atau 2 jam setelah makan. Kadang-kadang kadar glukosa darah harus diukur
pada saat ini untuk mendeteksi peningkatan atau penurunan kadar glukosa darah
(hiperglikemia atau hipoglikemia).

Pada dasarnya ada dua metode untuk mengukur kadar glukosa darah:
1. Metode reduksi, yang didasarkan pada kemampuan glukosa mereduksi Cu
menjadi Cu. Cara ini kurang sensitif, karena selain glukosa banyak juga zat
yang dapat mereduksi Cu, seperti gula lain (fruktosa, galaktosa), vitamin C,
kreatin, asam urat, glutation, dll.
2. Metode enzimatis; glukosa dioksidasi oleh oksidasi glukosa menjadi asam dan
H2O2 dan reaksinya akan menghasilkan pewarna merah. Karena oksidasi
glukosa hanya dapat mengoksidasi glukosa, reaksi ini sangat spesifik dan
memberikan hasil yang lebih akurat.

III. Prinsip (menurut metode TRINDER GOD-PAP)

Glukosa oksidase (GOD) mengkatalisis reaksi oksidasi glukosa menurut
persamaan berikut:

Hidrogen peroksida (H2O2) yang terbentuk kemudian bereaksi dengan dengan 4-

aminofenazon dan fenol dengan katalis enzim peroksidase (POD) dan
menghasilkan 4-benzoquinon mono iminophenazon (pewarna merah).

3
Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kadar glukosa dalam sampel.

IV. Bahan dan perlengkapan:

1. Reagen warna mengoksidasi glukosa (GOD-PAP)
 Glukosa mengoksidasi (GOD)> 15 KU / L.
 Peroksidasi (POD)> 1,5 KU / L.
 4-aminofenazon 0,25 mmol / L.
 Fenol 0.75mmol / L, mutarotase> 2.0 KU / L.
 Buffer fosfat pH 7,5 0,1 mol / L.
2. Larutan standar glukosa 100mg / dl (5,55 mmol / L)
3. Serum atau plasma
4. Akuades
5. Mikropipet 19uL, 1,0 ml
6. Tabung reaksi
7. Waterbath 37oC
8. Mesin sentrifugal
9. Spektrofotometer (panjang gelombang 492-546 nm)

Untuk membuat pereaksi warna GOD:

larutkan isi botol enzim GOD beserta pelarutnya. Larutan ini stabil selama 30 hari
pada suhu 2-8 oC. Absorbansi blanko reagen harus sekitar 0,0 - 0,4 AU jika dibaca
pada panjang gelombang 505 nm dibandingkan dengan aquadest.
Untuk setiap rangkaian pengukuran, hanya diperlukan satu standar dan satu
blanko.

V. Prosedur:
1. Centrifuge darah 3 ml dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. serum
akan dipisahkan dari sel darah. Gunakan serum untuk sampel.
2. Pipet ke masing-masing dari tiga tabung reaksi sesuai dengan tabel berikut

Blank Standar Sample

Aquades 0.01 ml - -
Standar - 0.01 ml -
Plasma - - 0.01 ml
GOD color reagent 1.00 ml 1.00 ml 1.00 ml

Campur isi masing-masing tabung dengan baik, kemudian inkubasi pada suhu
37oC selama 10 menit atau diamkan pada suhu kamar selama 25 menit. Hindari
sinar matahari langsung.

4
Setelah diinkubasi, kuvet yang berisi larutan-larutan di atas dimasukkan ke dalam
alat spektrofotometer dan dibaca absorbansinya terhadap blanko pada panjang
gelombang 505 nm

Perhitungan:

Cstandart= konsentarsi standart (100 mg/dl)

C = Kadar/konsentrasi Glukosa dalam serum (mg/dl)

Catatan:
1. Dengan metode ini kadar glukosa darah dapat diukur secara linier hingga
600 mg / dl jika kadar glukosa darah lebih tinggi dari 600 mg / dl.
Encerkan plasma tiga kali dengan menambahkan 2 volume aquadest,
kemudian ulangi prosedurnya. Kalikan hasilnya tiga kali.
2. Hasil tidak dipengaruhi oleh kreatinin, fruktosa, galaktosa, asam urat,
glutation, asam askorbat atau bilirubin selama konsentrasi zat tersebut
dalam batas normal.
3. Konsentrasi bilirubin sampai 10 mg / dl tidak mempengaruhi hasil, tetapi
asam askorbat oral (vitamin C) dosis tinggi dapat menurunkan hasil.
4. Warna yang dihasilkan akan stabil selama 2 jam.

B. METODE POINT OF CARE TESTING (POCT)

I. Tujuan
Di akhir kegiatan siswa akan memahami dan dapat mendeskripsikan tentang:
1. Penggunaan dan cara menggunakan instrumen untuk pemantauan rumah
sendiri / glukosa darah
2. Interpretasi hasil tes
3. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil.

II. Pengantar:
Metode ini adalah bagian dari pemantauan mandiri pengelolaan pembaruan
DM. Pasien dapat memeriksa kadar glukosa darahnya sendiri di rumah, dan
melaporkan hasilnya ke dokter untuk pemantauan DM yang lebih ketat.

5
 Terkadang, penderita DM tidak mengenali keadaan berbahaya, seperti
hipoglikemia (sebagai komplikasi pengobatan / insulin), atau ketoasidosis.
Ada sistem peringatan dalam program perangkat ketika kadar glukosa darah
mencapai 300 mg / dl, yaitu instruksi untuk mengukur kadar keton darah
dengan perangkat yang sama ini.

III.Penggunaan yang dimaksudkan:

Monitor glukosa darah untuk mengukur glukosa (D-glukosa) secara kuantitatif
dalam sampel darah kapiler segar (misalnya, dari jari), vena, arteri, dan neonatal.
Beberapa jenis alat ini juga dapat mengukur konsentrasi keton darah (beta-OH
butirat).

IV. Prinsip reaksi:

Glukosa dalam sampel darah bereaksi dengan bahan kimia pada strip,
menghasilkan arus listrik kecil. Arus ini diukur dan kemudian hasilnya
ditampilkan oleh monitor. Besar kecilnya arus tergantung pada jumlah glukosa
dalam sampel.

Glukometer, strip glukosa, autoclick (blood lancet), pengukur yang direndam

dalam alkohol 70%.

VI. Reagen:
1. Glukosa dehidrogenase (mikroba); [Fe (CN) 6], NAD (sebagai garam
natrium), fenantrolin kuinin (PQQ) atau
2. Glukosa oksidase; [Fe (CN)6 ]

6
VII. Prosedur:
Pengumpulan dan persiapan sampel:
Sebelum mengambil sampel darah ujung jari, cuci dan keringkan tangan
sepenuhnya. Air hangat membantu aliran darah ke ujung jari. Jika
memungkinkan, gantung lengan ke bawah sebelum mengangkat jari untuk
meningkatkan aliran darah. Hindari meremas situs tusukan. Gunakan sampel
segera.

Kalibrasi:
Dengan nomor lot menghadap ke arah kami, masukkan bilah kontak kalibrator ke
monitor, monitor menyala secara otomatis. “LOT” dan nomor lot kemudian
muncul di jendela tampilan. Periksa apakah nomor lot ini cocok dengan nomor
pada kalibrator dan paket strip pengujian. Kalibrasi selesai.

Aplikasi darah:
1. Cuci dan keringkan tangan dengan seksama
2. Masukkan lancet menggunakan petunjuk perangkat lancing
3. Buka paket strip uji dengan merobek perlahan takiknya
4. Masukkan bilah kontak ke dalam port uji
5. Dorong strip uji ke dalam port uji sampai berhenti
6. Tombak jari untuk mendapatkan setetes darah
7. Sentuh tetesan darah ke area target putih di ujung strip tes sementara
instruksi Terapkan Darah muncul di jendela tampilan
8. Tahan jari di tempatnya sampai tes dimulai
9. Tes akan dimulai ketika sampel terdeteksi (Catatan: jika tes gagal dimulai,
tetes kedua dapat diterapkan dalam 30 detik setelah tetesan darah. Jika tes
gagal untuk memulai lagi atau jika sudah lebih dari 30 detik telah berlalu,
ulangi dengan strip baru)
10. Ada hitungan mundur 20 detik sebelum hasil glukosa darah ditampilkan.
11. Penting: jika hasil glukosa darah sangat tinggi (> 300 mg / dl atau 16,7
mmol / L) atau rendah (<50 mg / dL atau 2,8 mmol / L), atau jika kita
mempertanyakan hasilnya, ulangi tes dengan benar dengan strip uji baru.

Rentang pengujian: 20 - 500 mg / dL (1,1 - 27,8 mmol / L)

Nilai yang diharapkan:

Dewasa: puasa 74-106 mg / dL (4,1 - 5,9 mmol / L)
2 jam setelah makan: <140 mg / dL (7,8 mmol / L)

7
VIII. Faktor yang mengganggu:
1. Sangat tinggi: infus dekstrosa iv, steroid, stres, infeksi, kafein, nikotin,
infeksi kelenjar adrenal, nutrisi parenteral total (TPN), diuretik, estrogen,
fenitoin, demam, HCT, kehamilan, AMI, lansia, kontrasepsi oral.
2. Sangat rendah: insulin, OAD, alkohol, steroid anabolik, betha-blocker,
MAO-inhibitor, amfetamin.

HASIL:

Mahasiswa Kadar Glukosa Darah (mg/dl)

Menggunakan Menggunakan POCT
spektrofotometer
A
B

8
 2. TRIGLISERIDA
I. Tujuan
Menentukan kadar trigliserida dalam darah

II. Pengantar
Trigliserida adalah ester dari asam lemak dan dihidrolisis menjadi gliserol dan
asam lemak bebas. Penentuan trigliserida bila dilakukan bersama dengan tes
lipid lain yang berguna dalam diagnosis inemia hiperlipoprote primer dan
sekunder. Mereka juga tertarik mengikuti perjalanan penyakit diabetes melitus,
nefrosis, obstruksi bilier dan berbagai kelainan metabolik akibat gangguan
endokrin.

II. Prinsip reaksi:

Metode standar untuk pengukuran konsentrasi trigliserida telah melibatkan
hidrolisis enzimatik atau alkali untuk melepaskan gliserol. Formulasi ini
memanfaatkan hidrolisis dan kuantifikasi enzimatik karena bersifat spesifik
dan tidak terganggu oleh fosfolipid.

Prosedur ini melibatkan hidrolisis trigliserida oleh lipase. Konsentrasi gliserol

kemudian ditentukan dengan uji enzimatis ditambah dengan reaksi Trinder yang
berakhir dalam pembentukan pewarna kuinoneimin. Jumlah zat warna yang
terbentuk, ditentukan oleh serapannya pada 520 nm, berbanding lurus dengan
konsentrasi trigliserida dalam sampel.

III.Sampel
Serum darah, plasma EDTA

9
IV.Kit Reagansia
Kit Reagansia terdiri dari tiga komponen:
1. Enzim
2. pelarut
3. standar

V. Peralatan
1. Tabung reaksi + rak
2. Macropippet 1.0 ml
3. Mikropippet 0,01 ml (10ul)
4. Spektrofotometer dengan panjang gelombang 500nm (520-546)
Persiapan dan stabilisasi

VI.Prosedur kerja
Encerkan enzim di dalam botol dengan pelarut dan aduk perlahan. Larutan ini
akan berada dalam kondisi stabil pada suhu 2º- 8º C selama 30 hari setelah
pengenceran.

Blank Standar Sample

Aquades 0.01 ml - -
Standar - 0.01 ml -
Serum - - 0.01 ml
Reagen 1.00 ml 1.00 ml 1.00 ml
Trigliserida

Campur isi masing-masing tabung dengan baik, kemudian inkubasi pada suhu
37oC selama 10 menit atau diamkan pada suhu kamar selama 20 menit. Hindari
sinar matahari langsung. Setelah diinkubasi, kuvet yang berisi larutan-larutan di
atas dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer dan dibaca absorbansinya
terhadap blanko pada panjang gelombang 500 nm. Absorbansi stabil selama 60
menit.

Prosedur Tes (Manual)

1. Beri label tabung reaksi: "Kosong", "Standar", "Tes (pasien)".
2. Pipet 1,0 ml larutan kerja (reagen) ke dalam tabung yang sesuai dan
hangatkan hingga 37 ° C.
3. Tambahkan 0,010ml (10ul) sampel yang sesuai ke tabungnya masing-
masing. Aduk perlahan agar tercampur.
4. Inkubasi semua tabung selama lima (5) menit.
5. Setelah inkubasi, kosongkan spektrofotometer dengan tabung "Kosong",
pada 500nm. (500-520 nm).

10
 6. Baca dan catat absorbansi (Abs.) dari semua tabung. Warna akhir stabil
setidaknya selama 60 menit.

VII.Perhitungan
Hasil trigliserida dinyatakan sebagai mg / dl atau mmol / L.

Cstandart= konsentrasi Standar (200 mg/dl)

C = konenstrasi trigliserida dalam darah (mg/dl)

Contoh:
Asampel = 0,243
Astandart = 0,310
Conc. Std = 200 mg / dl
Trigliserida = 0,243 x 200 mg / dl
0,310
Trigliserida = 157 mg / dl
Harga normal : 150-250 mg / dl

Standarisasi
Untuk mengetahui akurasi dan presisi, gunakan normal atau abnormal. kontrol
serum

Catatan: Jika rendemen lebih dari 900 mg / dl, encerkan serum dengan 5x NaCl
0,086% (1 bagian serum + 4 bagian NaCl 0,86%)

11
 KOLESTEROL

I. Tujuan
Menentukan kadar kolesterol dalam darah menggunakan metode CHOP-PAPA

II. Pengantar
Aterosklerosis merupakan dasar dari berbagai penyakit kardiovaskular seperti
misalnya penyakit jantung koroner (PJK) dan CVA (stroke). Kelainan-kelainan ini
memiliki penyebab multifaktorial, diantaranya adalah kelainan lipid darah, seperti
hiperkolesterolemia dan kenaikan kadar trigliserida darah. Karena itu pemeriksaan
kadar kolesterol dan trigliserida darah yang merupakan faktor-faktor aterogenik
ini, penting untuk mengetahui risiko seseorang untuk terkena kelainan ini.

II. Prinsip reaksi:

1. Pemeriksaan kolesterol serum ini menggunakan metode pemeriksaan
enzimatik dan kuantifikasi senyawa yang terbentuk secara
spektrofotometrik.
2. Indikator kolorimetrik pada percobaan ini adalah : Quinoneimine yang
terbentuk dari reaksi antara 4-aminoantipyrine, phenol dan hidrogen
peroksida yang dikatalisa oleh enzim peroksidase
3. Kolesterol darah terdapat dalam bentuk kolesterol dan kolesterol ester.
4. Kolesterol ester dihidrolisis menggunakan enzim kolesterol esterase,
menghasilkan kolesterol.
5. Kolesterol dioksidasi menghasilkan kolestenon dan hidrogen peroksida.
6. Hidrogen peroksida bereaksi dengan aminofenazon dan klorofenol
membentuk senyawa berwarna yang kadarnya dapat diukur dengan
spektrofotometer pada λ 505 nm.

12
 III.Sampel
Serum darah atau plasma EDTA

IV.Kit Reagansia
Kit Reagansia terdiri dari tiga komponen:
1. Enzim
2. pelarut
3. standar

Bahan
1. Goog’s buffer [pH = 6.7] 50 mmol/L
2. Phenol 5 mmol/L
3. 4-Aminoantipyrine 0.3 mmol/L
4. Cholesterl esterase > 200 U/L
5. Cholesterl oksidase > 50 U/L
6. Peroksidase > 3 kU/L
7. Standard [200 mg/dl] 5.2 mmol/L

V. Peralatan
1. Tabung reaksi + rak
2. Macropippet 1.0 ml
3. Mikropippet 0,01 ml (10ul)
4. Spektrofotometer dengan panjang gelombang 500nm (520-546)
5. Stopwatch
Persiapan dan stabilisasi

VI.Prosedur Tes (Manual)

1. Beri label tabung reaksi: "Kosong", "Standar", "Tes (pasien)".
2. Pipet 1,0 ml larutan kerja (reagen) ke dalam tabung yang sesuai dan
hangatkan hingga 37 ° C.
3. Tambahkan 0,010ml (10ul) sampel yang sesuai ke tabungnya masing-
masing. Aduk perlahan agar tercampur.
4. Inkubasi semua tabung kamar [37o C] selama lima (5) menit.
5. Setelah inkubasi, kosongkan spektrofotometer dengan tabung "Kosong",
pada λ = 546 nm (500-520 nm).
6. Baca dan catat absorbansi (Abs.) Dari semua tabung. Warna akhir stabil
setidaknya selama 60 menit.

13
VII.Perhitungan

Harga normal Kolesterol : 150-200 mg / dl

14
 PROTEIN SERUM

I. Tujuan Praktikum
Menentukan kadar protei total, albumin, globulin serum dengan cara kingsley.

II. Pengantar
Protein adalah suatu makromolekul yang tersusun atas molekul-molekul asam
amino yang terhubung melalui ikatan peptida. Secara umum protein berfungsi
dalam sistem komplemen, sumber nutrisi, bagian sistem buffer plasma, dan
mempertahankan keseimbangan cairan intra dan ekstraseluler. Berbagai protein
plasma terdapat sebagai antibodi, hormon, enzim, faktor koagulasi, dan transport
substansi khusus. Sebagian besar protein-protein disintesis di hati.
Hepatosithepatosit mensintesis fibrinogen, albumin, dan globulin. Penetapan
kadar protein dalam serum biasanya mengukur total protein. Total protein terdiri
atas albumin (60%) dan globulin (40%). Bahan pemeriksaan yang digunakan
untuk pemeriksaan total protein adalah serum. Bila menggunakan bahan
pemeriksaan plasma, kadar total protein akan menjadi lebih tinggi 3 – 5% karena
pengaruh fibrinogen dalam plasma.

III. Prinsip Percobaan

Pada percobaan ini total protein dan albumin ditentukan secara
spektrofotometrik dengan direaksikan dengan reagen biuret. Kadar albumin
ditentukan sesudah globulin lebih dahulu dipisahkan dengan mengendapkannya
memakai larutan Na2SO4 23% dan selanjutnya digumpalkan dengan dietil eter.
Pemberian dietileter juga dimaksudkan untuk menghilangkan kekeruhan yang
mungkin terjadi oleh karena adanya lipida didalam serum. Kekeruhan akan
memepengaruhi pembacaan.
Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan metode biuret adalah
menganalisa adanya ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret ke
dalam sampel yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu
karena terbentuk senyawa komplek antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan
peptida

15
IV. Alat dan Reagensia
Alat – alat :
1. Tabung reaksi
2. Tabung centrifuge
3. Pippet
4. Centrifuge
5. Spektrofotometer
Bahan pemeriksaan dan Reagensia :
1. Serum orang coba
2. Na2SO4 23%
3. Reagen biuret
4. Larutan sandart prtein (6 gram protein/100 ml).

V. Cara Kerja
A. Total protein
1. Masukkan ke dalam tabung pemusing 7,5 ml larutan Na 2SO4 23%,
dan tambahkan 0,5 ml serum, campur dengan baik
2. Ambillah 2 ml dari campuran tersebut, lalu bersikan ujung pipet
dengan tisyu dan masukkan campuran ini kedalam tabung reaksi
dengan tanda TP (Total Protein).

B. Albumin
1. Pada sisa campuran (yang terdapat pada tabung pemusing)
tambahkan 3 ml dietil eter dan sumbat baik – baik. Kocoklah agak

16
 kuat dengan sekali-kali membuka tutupnya untuk mengurangi
tekanan yang terdapat dalam tabung tersebut.
2. Pusingkan selama 10 menit. Harus terlihat 3 fase yang berbatasan
jelas dari masing-masing campuran yang terdapat dalam tabung
pemusing tersebut, yaitu:
-) fase teratas adalah eter yang mengandung lipida.
-) fase yang tengah merupakan cincin endapan globulin.
-) fase yang terbawah merupakan larutan yang jernih dari albumin.

3. Miringkan dengan hati-hati tabung centrifuge tersebut, sehingga

cairan globulin terlepas dari dinding tabung lalu masukkan hati-
hati sebuah mikropipet
4. Pipetlah larutan albumin dengan mikropipet tersebut sebanyak 2
ml. kemudian masukkan kedalam tabung reaksi yang bertanda A.
5. Blanko :Untuk blanko dipakai 2 ml aquadest (Tabung B)
6. Standart :Untuk larutan standart 0,5 ml ditambah 7,5 ml
aquadest, Campurlah baik-baik, lalu ambil 2 ml dari campuran
tersebut dan masukkan kedalam tabung (S).
7. Tindakan selanjutnya :
-) tambahkan masing-masing tabung tersebut (A,TP,S dan B)
larutan 4 ml reagent biuret. Campur kemudian biarkan 10
menit pada suhu kamar.
-) bila terjadi kekeruhan tambahkan 2 – 2,5 ml eter, kocok dan
pusingkan. Tapi bila larutan sudah jernih tidak perlu ditambah
eter.
-) Tentukan bacaan Absorbansi dari masing-masing tabung (A,TP,S
dan B) dengan spektrofotometer.
8. Perhitungan
TP = RTP – Rb x CS (gr%)
Rs – Rb

Albumin = RA – Rb x CS (gr%)
Rs – Rb

Globulin = T.P – Albumin

RTP : Reading Total Protein

Rs : Reading Standart

17