A.

Sterilisasi Alat

Seluruh alat-alat dicuci bersih dan dikering anginkan. Kemudian

alatalat seperti labu erlenmeyer, gelas kimia, cawan petri, gelas ukur,

pipet tetes, pipet volum dan tabung reaksi dibungkus kertas serta

diikat tali. Dan bersama bahan-bahan seperti aquadest, kertas cakram

dan media yang akan digunakan disterilkan dengan menggunakan

oven pada suhu 170oC selama 1 jam (Wahyuddin dkk.2015).

B. Prosedur Pembuatan Seduhan Kayu Manis

Kayu manis disortasi, dilakukan pengecilan ukuran lalu dicuci bersih

dan ditimbang sebanyak 5 gram. Setelah itu direbus dengan air

sebanyak 250 ml pada suhu 100oC selama ± 15 menit. Perbandingan

kayu manis dengan air adalah 1:5. Air rebusan kayu manis disaring

dengan kain saring dan ampasnya dibuang. Analisis bahan meliputi

total fenol, kadar antioksidan, warna dan pH, untuk formula B dan C

menggunakan prosedur yang sama tetapi dengan konsentrasi kayu

manis yang berbeda sesuai formula B dan C (Putri Puncak Anjani

dkk.2015).
C. Prosedur Pembuatan Teh Kombucha Kayu Manis

Penelitian dilaksanakan dengan membuat teh dari daun yang

mengandung fenol tinggi kemudian dijadikan kombucha dengan

penambahan starter dan difermentasi yaitu dengan berbagai macam

daun yang mengandung fenol tinggi diseduh terlebih dahulu dengan

air suhu 800C 400ml, 15 menit. Kemudian air seduhan disaring untuk

memisahkan daun dengan air teh. Kemudian ditambahkan gula 10%

(b/v) dan dilarutkan. Disaring agar air teh bersih. Kemudian air teh

dimasukkan Toples yang terbuat dari kaca dan seduhan kayu manis.

Setelah itu dinginkan sampai suhu ± 25 0C. Waktu mendinginkan tidak

boleh lebih dari 4 jam. Kemudian sebelum 4 jam dan air teh sudah

dingin ditambahkan starter kombucha cair 30 ml dan nata (SCOBY).

Tutup dengan kain katun putih dan dikat dengan karet. Kemudian

fermentasi selama 14 hari dengan suhu ruang dan tidak boleh

langsung terkena sinar matahari, Prosedur yang sama dilakukan

untuk formula A, B, C dan D tanpa menggunakan kayu manis (Prasis

Nursyam Suhardini & Elok Zubaidah.2016).

D. Pembuatan medium

1. Media Nutrient Agar (NA)

 Medium dasar dibuat dengan cara ditimbang Nutrien Agar (NA)

sebanyak 2,3 gram lalu dilarutka dengan 100 ml aquadest

menggunakan Erlenmeyer. Lalu didihkan pada penangas air

hingga berubah menjadi bening. Sebanyak 10 ml dituang kedalam

cawan petri steril lalu dibiarkan hingga memadat. Proses ini

dilakukan secara aseptik (Wahyuddin dkk.2015).

E. Penyiapan Bakteri Uji

1. Inokulasi Bakteri (Peremajaan)

Pembiakan Bakteri Biakan bakteri Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus diinokulasi secara aseptik ke dalam tabung

reaksi yang sudah berisi 5 ml medium NB. medium tersebut

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC, kemudian diinokulasi

lagi dari medium NB ke medium NA miring lalu diinkubasikan

selama 24 jam lalu disimpan sebagai stok dari kedua bakteri

tersebut (Megawati S dkk.2014).

2. Pembuatan suspensi bakteri

Diambil 1 ml dari hasil peremajaan biakan murni bakteri

Staphylococcus aureus dan Escherchia coli dimasukkan ke dalam

tabung reaksi yang berisi 5 ml NaCl fisiologis 0,9% kemudian

dihomogenkan (Wahyuddin dkk.2015).

F. Uji aktifitas antibakteri Teh Kombucha kombinasi kayu manis

 Uji aktifitas antibakteri teh kombucha kombinasi kayu manis dilakukan

dengan menggunakan metode difusi yaitu disiapkan medium Nutrien

Agar (NA) steril dengan suhu 45oC-47oC lalu dituang secara aseptik

kedalam 2 cawan petri steril yang telah disiapkan masing-masing

sebanyak 10 ml dan dibiarkan hingga memadat, ini merupakan

lapisan dasar (Base Layar). Setelah itu dicampur 10 ml medium

Nutrien Agar dan 0,2 suspensi bakteri uji dalam tabung reaksi steril

lalu dituang diatas permukaan medium Nutrien Agar yang telah

memadat tadi, kemudian digoyang-goyangkan secara teratur

sehingga membentuk lapisan yang homogen dan dibiarkan setengah

memadat (Seed Layer). Direndam 4 kertas cakram dalam ekstrak

sampel dan 1 kertas cakram dalam kontrol kemudian ditempatkan

kertas cakram tersebut secara aseptik dalam masing-masing cawan

petri yang berisi bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

secara diagonal ± 2 menit dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC

selama 1x24 jam (Wahyuddin dkk.2015).

G. Pengamatan dan pengukuran

Setelah 24 jam, cawan petri yang berisi perlakuan dikeluarkan dari

inkubator, kemudian dilakukan pengukuran zona hambat terhadap

pertumbuhan bakteri disekitar kertas cakram dengan menggunakan

jangka sorong. Pengukuran dilakukan dengan terlebih dahulu

membalikkan cawan petri sehinggah terlihat daerah hambatan yang

transparan disekitar kertas cakram, kemudian jangka sorong

diletakkan pada permukaan tutup cawan petri, tepat di atas zona

hambatan yang akan diukur. Posisi paruh jangka sorong (rahang tetap

dan rahang sorong) terletak selurus dengan zona hambatan yang

akan diukur. Kemudian geser rahang sorong sesuai dengan besarnya

diameter zona hambatan yang terlihat. Selanjutnya pembacaan

dilakukan pada skala utama dan skala nonius pada jangka sorong

untuk menentukan besarnya diameter zona hambatan dalam satuan

millimeter (mm) (Wahyuddin dkk.2015).

Pembacaan hasil negatif jika disekitar kertas cakram tidak terdapat

zona jernih, berarti Teh kombucha kombinasi kayu manis yang diuji

tidak mempunyai daya antibakteri. Pembacaan hasil positif jika

disekitar kertas cakram terdapat zona jernih, yaitu zona yang tidak

ditumbuhi bakteri, berarti Teh kombucha kombinasi kayu manis

mempunyai daya antibakteri. Pengukuran diameter zona hambat

dilakukan secara vertikal (misal a mm), horizontal (misal b mm) dan

miring (misal c mm). Kemudian ketiganya dijumlah dan dibagi 3 (misal

n) (Wahyuddin dkk.2015).