Theobromine

Theobromine merupakan alkaloid purin yang terdapat dalam kakao. Theobroma cacao,
tumbuh di daerah tropis Amerika dengan ketinggian sekitar 10 m. Theobroma berasal dari kata Yunani
yakni theo untuk “dewa” dan broma untuk “makanan”, sehingga disebut “makanan dari dewa”.
Theobromine merupakan suatu alkaloid yang tidak mengandung atom brom. Istilah ini diciptakan
pada tahun 1842 ketika alkaloid pertama kali diisolasi dari biji kakao. Saat ini bubuk coklat yang
beredar di pasaran mengandung antara 1 hingga 3% Theobromine. Sintesis senyawa Theobromine
pertama kali dilakukan pada tahun 1882 dari Xhantine (3,7-dihydro-1H-purin-2,6-dione), yakni
senyawa alkaloid non-metilasi purin untuk Caffein, Theophylline dan Theobromine.
Theobromine merupakan zat stimulan ringan yang memiliki efek meningkatkan dan
mencerahkan suasana hati. Kandungan Theobromine pada dark chocolate mengandung sekitar 10
g/kg sedangkan pada mild chocolate mengandung sekitar 1-5 g/kg. Secara medis, Theobromine
digunakan sebagai agen diuretik, miokardium stimulan dan vasodilator. Theobromine membantu
dalam pengobatan asma, menenangkan otot polos dan juga otot bronkus. Dalam dosis tinggi,
theobromine dapat mengakibatkan sulit tidur, gelisah dan gemetar serta peningkatan produksi urin.

Isolasi Theobromine
1. Prinsip
Metode isolasi menggunakan trikloroetilen, yaitu pelarut yang bersifat nonpolar dan
lipofilik yang biasanya digunakan sebagai bahan pembersih lemak. Sifat fisikokimia
teobromin dapat membentuk ikatan hidrogen dengan molekul air baik sebagai donor (oleh
unit NíH) maupun sebagai molekul akseptor (dengan unit C=O dan –N=). Oleh karena itu,
pada langkah pertama, teobromin, bersama dengan semua senyawa larut air lainnya, terutama
karbohidrat, diekstraksi dari bubuk kakao yang dihilangkan lemaknya dengan air panas.
Setelah pemisahan fase air, langkah kedua menggunakan metanol sebagai pelarut organik
dengan polaritas yang jauh lebih rendah daripada air untuk menghilangkan residu yang tersisa
setelah pengeringan ekstrak air. Disakarida dan polisakarida tidak akan larut dalam metanol
sama sekali. Monosakarida, seperti glukosa, jika ada pun, hanya sebagian kecil saja dan tidak
akan mengganggu proses ekstraksi. Setelah kristalisasi dan rekristalisasi dari metanol,
sebagian theobromine dimurnikan dengan sublimasi menggunakan vakum.
2. Metode

Bubuk kakao (100 g, merek

Demeter®, mengandung 11% lemak
Suspensi yang diperoleh,
kakao) dan air 1L dimasukkan ke
didinginkan hingga mencapai suhu
dalam labu beralas bulat berukuran
kamar dan disentrifugasi dengan
2L, diaduk secara mekanis dan
kecepatan 3000 rpm selama 5 menit
dipanaskan dalam penangas air pada
suhu 90°C selama 30 menit

Fase cair berwarna coklat dan keruh

Fase cair yang diperoleh, dikeringkan
dipisahkan dan diekstraksi dengan
dalam dua langkah. Pertama,
metil tert-butil eter (3×100 mL)
didistilasi dalam rotary evaporator
untuk menghilangkan lipid lalu fase
pada suhu 45°C dan tekanan 16
halus berwarna coklat yang
mbar
terbentuk dibuang

Padatan yang terbentuk

Air yang tersisa pada "Slurry"
ditambahkan metanol (400 mL) dan
dihilangkan menggunakan pompa
dipanaskan dengan refluks selama
minyak pada suhu 45˚C dan tekanan
15 menit. Suspensi disaring untuk
0,1 mbar. Tersisa sebuah padatan
menghasilkan ekstrak coklat, lalu
berwarna coklat pucat seberat 31,8
dipekatkan dalam vakum hingga 15
g
mL

Ekstrak kasar dilarutkan dalam

Saat didiamkan semalaman,
metanol panas (250 mL) dan
terbentuk endapan kristal tidak
didiamkan dalam gelas kimia
berwarna. Endapan disaring dan
terbuka semalaman, terjadi proses
dicuci dengan 3 mL metanol dingin.
rekristalisasi teobromin abu-abu
Ekstrak Kasar Teobromin ini memiliki
pucat (300 mg ketika dikeringkan
massa 700 mg
menggunakan pompa minyak)

3. Pemurnian
Sejumlah 100 mg ekstrak disublimasikan menggunakan sublimator vakum
yang dipanaskan dalam aliran udara (320°C) dari heat gun elektronik di bawah vakum
pompa membran (hingga 40 mbar) selama 15 menit hingga sublimasi berhenti.
Teobromin tersublimasi tak berwarna (50 mg) diperoleh, dengan titik leleh 346 - 347°
C (kuvet Fischer). Titik leleh ini sesuai dengan sampel asli Theobromine komersial
yang tidak berwarna.
Galanthamine
Sekitar tahun 1950-an seorang farmakologis Rusia memperhatikan penduduk desa
pegunungan Ural menggunakan tanaman Caucasian Snowdrop liar untuk mengobati polio pada anak-
anak. Dari tanaman inilah, Galanthamine secara aktif mulai diisolasi pada tahun 1952. Nama
Galanthamine berasal dari kata Yunani yakni γάλά untuk susu dan ἄѵθΟЅ untuk bunga (menjadikan
nama genus Galanthus= “Bunga Susu”) dan kata amina yang menyoroti sifat dasar alkaloid.
Penyelidikan menyeluruh terhadap snowdrop dan spesies lain yang termasuk dalam famili
Amaryllidaceae membuktikan bahwa semuanya mengandung alkaloid. Alkaloid utama
Amaryllidaceae selain Galanthamine diwakili oleh senyawa berikut: norbelladine (non heterosiklik),
crinine, haemanthamine, homolycorine, lycorine, montanine, narciclasine, dan tazettine. Penetapan
struktur Galanthamine jauh lebih cepat dibandingkan senyawa alkaloid lainnya yang diisolasi pada
awal abad ke-19. Para peneliti Rusia menyebutkan dalam menetapkan beberapa subunit struktural
molekul, konfigurasi absolut ditemukan melalui struktur sinar-X pada tahun 1964, yaitu hanya
belasan tahun setelah isolasi senyawa tersebut.
Galantamine meningkatkan fungsi kolinergik dengan meningkatkan kadar neurotransmitter
asetilkolin di otak. Selanjutnya, galanthamine juga mampu mempengaruhi reseptor kolinergik
nikotinat di jalur kedua dan meningkatkan pelepasan asetilkolin. Awalnya, senyawa tersebut
digunakan untuk membalikkan relaksasi otot yang pada saat pemulihan pasca operasi. Selain itu,
alkaloid digunakan dalam kasus kelemahan otot patologis. Penggunaan awal Galanthamine ini
dikembangkan pada masa Perang Dingin di Bulgaria dan Uni Soviet. Sediaan Galanthamine telah
menjadi pilihan terapi untuk memperlambat degenerasi neurologis. Galanthamine memiliki efek
ganda pada sistem kolinergik. Bertindak sebagai penghambat asetilkolinesterase dan dengan demikian
memperlambat pembelahan asetilkolin sampai batas tertentu, dan secara alosterik memodulasi
reseptor asetilkolin nikotinat, yang pada akhirnya terjadi peningkatan asetilkolin yang diinginkan.
Galanthamine yang digunakan untuk tujuan medis, saat ini tidak lagi diperoleh secara implisit
dengan ekstraksi tanaman. Prosedur sintetis telah dikembangkan dan dipatenkan serta digunakan.
Perusahaan pertama yang memperoleh paten atas sintetis tersebut adalah Sanochemia Pharmazeutika
dari Austria pada tahun 1997, yang kemudian memulai kerja sama dengan Janssen Pharmaceutica
(Belgia). Di pasaran saat ini, obat tersebut memiliki nama-nama dagang seperti Reminyl, Razadyne
dan Nivalin dan diindikasikan untuk kasus penyakit ringan hingga sedang. Sejak saat itu, sekitar 20
paten telah diambil, yang menggambarkan minat terhadap obat tersebut. Pendekatan sintetis telah
dibahas untuk proses yang mengarah ke galanthamine rasemat dan ke bentuk murni secara
enansiomer. Dua langkah reaksi utama adalah reaksi penggabungan fenol oksidatif dan reaksi Heck
intramolekuler. Selain itu, beberapa metode ekstraksi lebih lanjut dari tanaman tersebut juga telah
diklaim.
Isolasi Galanthamine
1. Prinsip
Catatan penting: Semua kegiatan yang dilaporkan disini sebagian besar terinspirasi oleh
temuan yang dilaporkan oleh Kreh pada tahun 1990-an. Keuntungan dari penyelidikannya
adalah diarahkan pada optimalisasi banyak faktor, misalnya. spesies Narcissus apa yang
paling cocok dan pemisahan ekstraktif apa yang terbaik pada kondisi pH yang sesuai dengan
pelarut yang paling cocok, dan seterusnya. Semua ini dipelajari dengan sangat hati-hati dan
hanya digunakan disini dengan mengikuti prinsip-prinsipnya. Meskipun demikian, isolasi di
laboratorium masih rumit jika dipertimbangkan secara teknologi.
Isolasi Galanthamine mengikuti prinsip klasik. Alkaloid pertama-tama dibebaskan
dari bentuk garam – yang terkandung di dalam sel – melalui reaksi dengan basa kuat.
Kemudian alkaloid diekstraksi dengan pelarut organic lalu dimurnikan. Ini tampaknya cukup
sederhana. Namun, dalam praktiknya, hal ini memiliki dua poin penting. Masalah pertama
adalah alkaloid ini tidak terkandung dalam semua spesies Narcissus. Apabila diperlukan,
harus dipastikan terlebih dahulu dengan memeriksa literatur apakah suatu varietas daffodil
tertentu diketahui mengandung galanthamine atau tidak.
Masalah kedua adalah masalah teknologi. Transfer dari matriks biologis bulbs ke
dalam pelarut organik sangat sulit dilakukan. Tidak mudah untuk menghancurkan bulbs yang
agak keras bersama-sama dengan bahan dasar padat yang sesuai seperti soda ash untuk
membebaskan alkaloid dari sel. Selanjutnya, saat menggunakan basa anhidrat seperti soda
ash, pengaduk laboratorium biasa tidak mampu menghasilkan pencampuran antara bulbs
dengan pelarut. Saat menggunakan larutan basa (uji coba dilakukan dengan larutan natrium
karbonat), diperlukan pencampuran yang intens dari bulbs yang dihancurkan dengan pelarut.
Emulsi akan terjadi dan diperlukan sentrifugasi. Intinya adalah bahwa peralatan teknis
laboratorium organik standar mungkin tidak memenuhi kebutuhan yang disebabkan oleh
masalah pemisahan (tidak tersedianya alat pemisahan yang memadai).
2. Metode
 Dua puluh dua umbi Narcissus pseudonarcissus Bulbs kemudian dipotong dadu dan dicampur
L. subspesies pseudonarcissus Carlton (massa 2 dengan natrium karbonat padat (170 g).
kg) dikupas dan akarnya dipotong. Beratnya Campuran tersebut digiling menggunakan
kemudian menjadi 1,75 kg penggiling daging

Fase heptana kuning pucat dihilangkan dengan

Campuran tersebut dibagi menjadi 10 bagian
penyaringan. Lakukan hal yang sama pada 9
yang sama dari (180-190g). Satu bagian
bagian lainnya. Fase heptana kemudian
ditempatkan dalam gelas kimia 2L bersama
digabungkan, dikeringkan menggunakan
dengan nheptana (400 mL) dan diaduk sekuat
MgSO4 dan heptana dihilangkan seluruhnya
mungkin dengan mixer selama 3 menit
menggunakan rotary evaporator

Emulsi yang dihasilkan dipisahkan dengan

Hasil ekstrak kasar, cairan berwarna kuning
sentrifugasi (10 menit pada 3200 rpm-atau
(2,44 g) dilarutkan dalam heptana (350 mL)
lebih cepat jika memungkinkan). Fase yang
dan diekstraksi menggunakan larutan H2SO4
mengandung galanthamine dan alkaloid lain
2% (5 × 100 mL) untuk mentransfer
dalam bentuk terprotonasi dikumpulkan dan
galanthamine sebagai garam ke dalam fase cair
fase heptana dibuang

Fasa yang tidak berwarna disesuaikan menjadi

pH 9 dengan penambahan larutan amoniak
pekat. Basa alkaloid bebas diekstraksi dengan
dietil eter (5 × 100 mL), fasa-fasa digabungkan,
dikeringkan dengan MgSO4 dan eter disuling
seluruhnya dalam vakum, diperoleh cairan
kental tak berwarna (465 mg) yang
mengandung galanthamine kasar
Filtrat gabungan yang diperoleh kemudian
disesuaikan menjadi pH 5 dengan penambahan
larutan amoniak pekat. Untuk menghilangkan
pengotor pewarna, filtrat diekstraksi dengan
dietil eter hingga eter tidak berwarna (2 × 100
mL)

Beberapa tes TLC dilakukan untuk menemukan

pelarut yang cocok untuk pemisahan
kromatografi kolom. Etanol murni ditemukan
menunjukkan Rf = 0,20 untuk galanthamine
dan Rf = 0,36 untuk senyawa pendamping
utama

3. Pemurnian (Kromatografi Kolom Pertama)


kolom, 30 × 3 cm; fasa diam, silika
gel 60 (0,040-0,063 mm); eluen,
etanol
Namun, pemisahan dari pengotor
utama belum memuaskan. Sekali
lagi, tes TLC dilakukan untuk
menemukan pelarut yang lebih
cocok
tersisa 309 mg minyak tak berwarna
4. Pemurnian (Kromatografi Kolom Kedua)
kolom, 45 × 1cm; fase diam, silika
gel 60 (0,040-0,063 mm); eluen,
THF
kandungan galanthamine yang
tinggi menurut NMR-tetapi tidak
murni
5. Pemurnian (TLC)
Ekstrak kasar dilarutkan dalam 20
mL etanol dan ditempatkan di
bagian atas kolom dengan pipet.
Selama kromatografi, diambil 160
fraksi (masing-masing 6,5 mL)
Pemeriksaan TLC menunjukkan
bahwa fraksi 60-150 mengandung
galanthamine. Fraksi-fraksi ini
digabungkan, pelarutnya
dihilangkan dalam vakum dan
Ekstrak kasar dilarutkan dalam 3
mL THF, ditempatkan di bagian atas
kolom dan diambil 140 fraksi
(masing-masing 3 mL)
Pemeriksaan TLC menunjukkan
bahwa fraksi 58-83 mengandung
galanthamine. Fraksi 58-83
digabungkan dan pelarutnya
dihilangkan dalam rotary
evaporator untuk meninggalkan 78
mg pasta tidak berwarna

Pelat Merck silica gel 60-F254 untuk TLC
preparatif, digunakan ukuran 20 × 20 cm
dengan zona konsentrasi 2,5 × 20 cm
Pelat dilepas dan dibiarkan mengering,
kemudian putaran kedua dilakukan dalam
kondisi yang sama; ini membutuhkan
waktu lagi 2 jam. Setelah pengeringan,
pelat disinari dengan sinar UV 254 dan 366
nm
Pada Rf = 0,05-0,1, senyawa dengan
fluoresensi biru di bawah sinar UV 366 nm
muncul. Pada Rf = 0,25, diamati suatu
senyawa yang di bawah sinar UV 254 nm,
tidak ada senyawa galanthamine.
Alkaloid ditemukan pada Rf = 0,45 di
bawah sinar UV 254 nm
6. Pengujian Dragendorff
Ekstrak kasar 78 mg dilarutkan dalam 4 mL
metanol dan dibagi menjadi empat bagian
masing-masing 1 mL. Setiap bagian
ditempatkan dalam satu garis di zona
konsentrasi pelat TLC preparatif
Keempat pelat tersebut kemudian
ditempatkan di chamber TLC dan
dikembangkan dengan metanol sebagai
eluen. Ini memakan waktu sekitar 2 jam
Emulsi yang dihasilkan dipisahkan dengan
sentrifugasi (10 menit pada 3200 rpm-atau
lebih cepat jika memungkinkan). Fase yang
mengandung galanthamine dan alkaloid
lain dalam bentuk terprotonasi
dikumpulkan dan fase heptana dibuang
 Persiapan reagen: 1,7 g bismut nitrat basa
dan 20 g asam tartarat dilarutkan dalam 40
Tes terakhir dilakukan dengan reagen
mL air, ditambahkan ke dalam campuran 16 g
Dragendorff untuk alkaloid
kalium iodida dalam 40 mL air, diaduk selama
1 jam dan disaring

Pelat sepanjang 4 cm dipotong dan pelat kecil Disimpan dalam keadaan dingin dalam botol
ini disemprot dengan reagen dragendorff. gelap, reagen dapat digunakan selama
Zona coklat sebagai ciri alkaloid terlihat di beberapa minggu. Encerkan dengan air
dua titik atas. Zona di sekitar Rf = 0,45 sebanyak tiga kali lipat sebelum digunakan

Ekstrak kasar dikumpulkan dan diekstraksi Semua spektrum dan pengukuran daya putar
dengan kloroform panas untuk menghasilkan optik, [α] 22D -125° (c 0,0063 g / mL, etanol),
14 mg padatan amorf tak berwarna setelah menunjukkan bahwa bahan ini adalah
pelarut dihilangkan Galanthamine murni

Penentuan titik leleh tidak mungkin dilakukan

karena penghilangan pelarut secara cepat
tidak memungkinkan terjadinya
pembentukan kristal yang besar. Namun, jika
lebih banyak bahan tersedia, perlu dicatat
bahwa literatur merekomendasikan
kristalisasi dari isopropanol, tetapi
prosedurnya lebih rumit