85

ISOLASI ACTINOMYCETES DENGAN MENGGUNAKAN METODE

SKRINING SEBAGAI PENGHASIL ENZIM KITINASE

Welly Anggraini
Program Studi Pendidikan Fisika, FTK IAIN Raden Intan Lampung; e-mail:

Abstrak: Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi Actinomycetes yang memiliki kemampuan dalam
mendegradasi kitin. Isolasi Actinomycetes dilakukan menggunakan media NaST21Cx selama 2-3 bulan dan
purifikasi untuk mendapatkan isolat murni dilakukan menggunakan media ISP-2. Hasil dari penelitian ini yakni,
empat isolat Actinomycetes, yang diberi kode ANL-4, ANL-9, ANL-12, dan ANL-d-2b-3 yang ditandai dengan
ciri-ciri isolat yang keras dan melekat erat pada agar. Secara mikroskopis teramati adanya hifa dan spora yang
terbentuk. Isolat ANL-4, ANL-9, ANL-12, dan ANLd-2b-3 memiliki kemampuan dalam mendegradasi kitin
pada media uji mineral-salt agar plate dengan substrat kitin 1% (w/v) yang diindikasikan dengan terbentukya
zona bening yang diperjelas dengan penambahan Congo Red 1% (w/v). Indeks kitinolitik yang dihasilkan
berturut-turut : 5 cm, 2 cm, 1,9 cm, dan 2,3 cm.

Kata Kunci : actinomycetes, hutan bakau, kitin, kitinase

86

PENDAHULUAN Untuk memperoleh satu jenis bakteri

(misalnya Actinomycetes) dari suatu bahan
Kitinase merupakan enzim yang mampu
yang mengandung campuran mikroba,
menghidrolisa polimer kitin menjadi
dapat dilakukan dengan cara isolasi
oligosakarida atau N-asetilglukosamin
mikroorganisme. Isolasi mikroorganisme
(Cohen-Kupiec and Chet, 1998). N-
dari alam atau sampel merupakan tahap
Acetylglucosamin (N-Acetyl-D-
awal dalam skrining metabolit
Glucosamine, atau GlcNAc, atau NAG)
mikroorganisme yaitu dengan
merupakan turunan monosakarida,
menggunakan kitin sebagai sumber karbon
glukosa, memiliki rumus molekul
satu-satunya di dalam media, dimana
C8H15NO6 dengan massa molar sebesar
tujuan isolasi ini adalah untuk memperoleh
221.21 g/mol, dikenal sebagai amida yang
mikroba Actinomycetes kitinolitik
terdiri dari glukosamin dan asam asetat
sebanyak-banyaknya melalui teknik
(Linden, J. et al., 2007). N-
diperkaya dan sistem pengenceran (Cermin
Acetylglucosamin dapat dihasilkan dari
Dunia Kedokteran No. 89, 1993).
kitin, dimana secara umum kitin banyak
Penelitian ini bertujuan untuk melihat
terdapat pada eksoskeleton atau kutikula
kemampuan actinomycetes melakukan
serangga, crustacea, udang, jamur, cumi-
skrining kitinase, mengetahui kondisi
cumi, dan artropoda lainnya (Tiffany A.
optimum pertumbuhan actinomycetes
Reese, et al., 2000). Bakteri yang
sehingga dapat menghasilkan enzim
menghasilkan kitinase adalah
kitinase dalam jumlah yang tinggi, dan
Actinomycetes, yaitu kumpulan
mengetahui spesies dan kekerabatan dari
mikroorganisme yang strukturnya
Actinomycetes penghasil enzim kitinase
merupakan bentuk antara bakteria dan
tersebut.
jamur, mereka menghasilkan zat-zat anti
mikroba dari asam amino yang dikeluarkan METODE PENELITIAN
oleh bakteria fotosintetik dan bahan
Media NaST21Cx
organik. Actinomycetes ini merupakan
sumber kitinase, mudah didapatkan, mudah Medium NaST21Cx terdiri dari larutan A (
dikembangbiakkan, dan memiliki nilai 750 mL air laut steril, 1 g KH2PO4 dan 10
ekonomi yang tinggi (Martín-Gil FJ, Leal g agar ) dan larutan B (250 mL air laut, 1 g
JA, 1992 ). KNO3, 1 g MgSO4, 1 g CaCl2.2H2O, 0,2 g
FeCl3, 0,1 g MnSO4.7H2O). larutan A dan
 87

larutan B diautoklaf secara terpisah selama diperoleh kultur murni (Margavey, et al.,
30 menit, kemudian dicampurkan dan 2004).
ditambahkan dengan 10 mL trace element
Pengamatan Makroskopik
solution dan 25 μg cycloheximide/mL
(Margavey, Nathan A., et al., 2004). Isolasi Actinomycetes secara makroskopik
diamati pada akhir masa inkubasi dengan
Media ISP - 2
menumbuhkan isolat Actinomycetes pada
Medium ISP–2 terdiri dari 4 g yeast media NaST21Cx (10 hari). Isolat
ekstrak, 10 g malt ekstrak, 4 g dekstrosa, Actinomycetes yang tumbuh diamati
dan 20 g agar dilarutkan dalam 1 L air laut bentuk koloni, tepi koloni, warna, elevasi,
steril kemudian diautoklaf. Setelah media dan pigmentasinya (Jutono,1980).
sedikit dingin, ditambahkan cycloheximide
Pengamatan Mikroskopik
(25 μg/mL) dan nalidixic acid (25 μg/mL)
(Margavey et al., 2004). Isolasi Actinomycetes secara mikroskopik
diamati bentuk hifa dan spora yang
terbentuk. Pengamatan dilakukan pada
Media Trace Element Solution akhir masa inkubasi dengan menumbuhkan
isolat Actinomycetes pada media
CaCl2.2H2O 10 mM, FeCl3.6H2O 1 mM,
NaST21Cx dengan menggunakan
MnSO4.7H2O 2,5 mM, CuSO4.2H2O 0,2
Illuminating System Zeiss Axio.
mM, H3BO3 1 mM, CoCl2.6H2O 0,1 mM,
ZnCl2 0,5 mM, dan NaMoO4.2H2O 0,1 Pereaksi Mineral Salt Medium dan
mM dilarutkan dalam 0,1 N HCl. Mineral Salt Agar plate

Isolasi Actinomycetes Mineral salt medium 0,4 % (NH4)2SO4, 0,1

% K2HPO4, 0,01 % MgSO4.7H2O, 0,01 %
Isolasi Actinomycetes dilakukan dengan
CaCl2, 0,6 % NaCl, 1 % kitin, dilarutkan
cara meletakkan kertas saring steril diatas
dalam 1 L air laut steril sampai pH 7,0.
media NaST21Cx yang memadat didalam
Kemudian diautoclave pada temperatur
cawan Petri. Kemudian sampel Lumpur
1210C, 1 atm, selama 15 menit. Sedangkan
disebar dan diratakan diatas cawan Petri
mineral salt agar plate 0,4 % (NH4)2SO4,
tersebut dan diinkubasi pada suhu 300C
0,1 % K2HPO4, 0,01 % MgSO4.7H2O, 0,01
selama 8 hari. Koloni yang tumbuh,
% CaCl2, 0,6 % NaCl, 1 % kitin, dilarutkan
dipindahkan kedalam media ISP-2 hingga
88

dalam 1 L air laut steril sampai pH 7,0. untuk sel prokariotik, yaitu : dinding
Kemudian diautoclave pada temperatur selnya mengandung asam muramat, tidak
0
121 C, 1 atm, selama 15 menit (M.Al-tai, mempunyai mitokondrion, mengandung
et al., 1989). ribosom 70s, tidak mempunyai
pembungkus nukleus, garis tengah selnya
berkisar dari 0,5-2,0 µm, dan dapat
Seleksi Actinomycetes dimatikan atau dihambat oleh banyak
antibiotik bakteri (Wesley dan Wheeler,
Isolasi Actinomycetes yang diperoleh dari
1993 dan Rao, 1994).
tahap isolasi, diuji kemampuannya dalam
Menurut Alexander, 1997,
mendegradasi kitin. Isolat Actinomycetes
Actinomycetes memiliki dinding sel yang
yang tumbuh pada media ISP-2
terdiri dari polimer-polimer gula, asam
diinokulasi pada mineral salt agar plate.
amino dan asam gula seperti dinding sel
Kemudian diinkubasi selama 5 hari. Pada
bakteri Gram positif. Sedangkan dinding
akhir inkubasi, mineral salt agar plate
sel fungi terdiri dari selulosa dan kitin.
dipenuhi dengan larutan Congo Red 1 %
Hal tersebut sejalan dengan Lay dan
selama 15 menit. Lalu dibilas dengan 1 M
Hastowo (1992), yang mengatakan bahwa
NaCl selama 15 menit. Adanya zona
Actinomycetes merupakan kelompok
bening yang terbentuk
mikroba bersifat Gram positif. Strain
mengidentifikasikan terjadinya degradasi
actinomycetes ini ditumbuhkan dalam
kitin. Semakin besar zona bening yang
media ISP–2. Isolate actinomycetes yang
terbentuk mengidentifikasikan bahwa
digunakan adalah ANL--12, ANL-9,
semakin besar pula kemampuan
ANLd-2b-3, dan ANL-4. Isolat ANL-4
Actinomycetes tersebut dalam
yang diperoleh memiliki kemiripan
menghasilkan enzim kitinase.
dengan gambar mikroskopis dari
streptomyces sp yang telah berhasil
HASIL DAN PEMBAHASAN
diisolasi dari tanah oleh Nikolova, et al.
pada 2006-2007, sehingga dapat dikatakan
Actinomycetes merupakan organisme tanah
bahwa isolat ANL-4 termasuk ke dalam
yang memiliki sifat–sifat yang umum
genus streptomyces. Sterptomycetes,
dimiliki oleh bakteri dan jamur. Terlihat
terdiri dari 4 genus dengan ciri-ciri
dari luar seperti jamur (eukariotik), namun
diameter filamen 0,5 - 2,0 µm, rantai
organisme ini sesuai dengan semua kriteria
 89

terdiri dari tiga hingga beberapa spora,

miselium aerial, dan dapat memproduksi
antibiotik. Contoh : Strepomyces (Gambar
1).

Nikolova, et al. pada 2006-2007

Gambar 1. Isolat actinomycetes secara

mikroskopik

ANL-12 ANL-9 Masing-masing isolate tersebut memiliki

indeks kitinolitik yaitu 1,9 cm, 2,0 cm, 2,3
cm, dan 5,0 cm (Gambar 2). Berdasarkan
hasil tersebut bahwa isolate ANL-4 yang
memiliki indeks kitinolitik tertinggi

ANL-4 dibandingkan isolate yang lain, hal ini

ditentukan berdasarkan rasio diameter zona
bening yang dihasilkan terhadap diameter
koloni, yang artinya bahwa semakin tinggi
nilai indeks kitinolitik maka semakin besar
isolate tersebut memiliki kemampuan
enzim mendegradasi subtrat (Tabel 1 dan
ANLd-2b-3 Gambar 2).

Tabel 1. Indeks kitinolitik actinomycetes

yang diisolasi dari Lumpur Hutan Bakau
asal Pantai Ringgung Perairan Teluk
Lampung
90

salt agar plate dengan Kitin 1% dengan

Kode Isolat Diameter Diameter Indeks

Zona Koloni (cm) Kitinoli
Bening (cm) tik

ANL – 12 2,3 1,2 1,9

ANL – 9 1,0 0,5 2,0

ANLd – 2b 0,7 0,3 2,3

–3

ANL – 4 0,5 0,1 5,0

pewarnaan Congo Red 1 %

SIMPULAN DAN SARAN

ANL-12 ANL-9 Isolasi Actinomycetes dari lumpur hutan

bakau dengan menggunakan media
NaST21Cx berhasil dilakukan dengan
diperoleh empat isolat Actinomycetes yang
diberi kode ANL-4, ANL-9, ANL-12, dan
ANLd-2b-3 yang diidentifikasi dengan
mengamati hifa dan spora yang terbentuk
menggunakan mikroskop dengan
perbesaran 400 x. Isolat ANL-4, ANL-9,
ANL-12, dan ANLd-2b-3 memiliki
aktivitas kitinolitik pada media mineral-
salt agar dengan kitin 1% (w/v) dengan
ANL-4
indeks kitinolitik berturut-turut 5 cm, 2 cm,
Gambar 2. Actinomycetes yang 1,9 cm, dan 2,3 cm
mempunyai kemampuan dalam
Untuk penelitian selanjutnya disarankan
mendegradasi kitin pada media mineral-
menggunakan variasi media dalam
 91

melakukan isolasi Actinomycetes agar perikanan Indonesia 1998-2002.url:

Actinomycetes yang diperoleh lebih http://www.dkp. go.id/. Update 10
beragam, melakukan identifikasi secara Juni 2009. 10.15
biologi molekuler untuk mengetahui Dodane V, Vilivalam VD. 1998.
spesies dari Actinomycetes hasil isolasi, Pharmaceutical applications of
menentukan waktu optimum sebelum chitosan. PSTT 1:246 253
pemanenan enzim kitinase dari isolat Fithria, N. 2007. Uji Antibakteri Isolat
ANL-4, ANL-9, ANL-12 dan ANLd-2b-3 Actinomycetes dari Callispongia sp.
agar aktivitas dari enzim yang dihasilkan yang Terdapat Di Pulau Tegal dan
juga besar, menggunakan variasi zat Pulau Tangkil Perairan Teluk
pewarna dalam melakukan seleksi Lampung. Skripsi. FMIPA.
Actinomycetes agar zona bening Unviversitas Lampung. Bandar
Actinomycetes yang diperoleh lebih besar Lampung
dan terlihat. Fukamizo T. 2000. Chitinolityc enzymes:
catalysis, substrate binding, and their
application. Curr Prot Peptide Sci 1:
DAFTAR PUSTAKA 105-124.
Gijzen M, Kuflu K, Qutob D, Chernys JT.
Alexander, M.1997. Introduction of soil
2001. A class I chitinase from
Microbiology, Second Edition. John
soybean seed coat. J Exp Bot 52:
willey and Sons. Inc. New
2283-2289.
York.
Gooday GW. 1994. Physiology of
Anonim. 1999. Biologi Molekuler.
microbial degradation of chitin and
http:///id.
chitosan. In Ratledge C, editor.
Wikipedia.org/wiki/Sekuensing_
Biochemistry of Microbial
vcasam nukleat. Update : 15 Juni
Degradation. Netherlands: Kluwer
2009.11.00
Academic Publ. p: 279-312.
Cohen-Kupiec R, Chet I. 1998. The
Hirano S. 1996. Chitin biotechnology
molecular biology of chitin digestion.
applications. Biotechnol Annu Rev,
Curr Opinion Biotechnol 9: 270-277.
2:237-258
Departemen Kelautan dan Perikanan
Lay, B.W dan S. Hastowo,. 1992.
Republik Indonesia. 2003.
Perkembangan ekspor komoditi hasil
92

Mikrobiologi. Rajawali Press. Desphande. 2000. Chitinolytic

Jakarta enzymes an exploration. Enz Microb
Lehninger, 1982. Dasar-dasar Biokimia. Technol 26:473-483.
Erlangga. Jakarta Pemerintah Daerah Lampung dan Proyek
Linden, J., Stoner, R., et al., 2007. Pesisir Lampung. Atlas. Sumberdaya
”Organic Disease Control Elicitors”. Wilayah Pesisir Lampung. Diakses
Agro Food Industry. New York tanggal 18 april 2008.
Martín-Gil FJ, Leal JA, Gómez-Miranda Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar
B, Biokimia. UI-Press. Jakarta
Martín-Gil J, Prieto A, Ramos Rao, N.S.S.1994. Mikroorganisme Tanah
Sánchez MC. "Low temperature dan Pertumbuhan Tanaman. UI-
thermal behaviour of chitins and Press. Jakarta.
chitin-glucans". Thermochim. Acta, Singh, J., N. Batra and R.C. Sobti, 1999.
1992, vol. 211, pp. 241-254 Purification and characterization of
Nikolova, Stefka Antonova, Vanya alkaline cellulose produced by a
Stefanova, dan Lyubomira Yocheva. novel isolate, Bacillus sphaericus
2006-2007. Taxonomic Study of JS1.J. Ind. Microbiol. Biotechnol.,
Streptomyces sp. Strain 34-1. 31: 51-59
Journal of Culture Collections, Skjak-Braek GA, Athonsen T, Sandford
Volume 5 pp. 10-15. PT. 1989. Chitin and Chitosan:
Ohno T, Armand S, Hata T, Nikaidou N, Sources, Chemistry, Biochemistry,
Henrissat B, Mitsutomi M, Watanabe Physical Properties and
T. 1996.A modular family 19 Applications. Elsevier Appl Sci,
chitinase found in the prokaryotic London. p:561.
organism Streptomyces griceus HUT Suhartono M.T. 1989. Enzim dan
6037. J Bacteriol 178: 5065-5070 Bioteknologi. Pusat Antar Universitas
Old, R.W., dan Primrose S.B.1989. Bioteknologi, IPB
Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. Tiffany A. Reese, Hong-Erh Liang,
Edisi Keempat. Publisher Business Andrew M. Tager, Andrew D.
Service USA. Hal. 4-7, 182-184. Luster, Nico Van Rooijen, David
Patil, R. S., V. Chormade, and M. V. Voehringer & Richard M. Locksley
(3 May 2007). "Chitin induces
 93

accumulation in tissue of innate

immune cells associated with
allergy". Nature 447: 92-96.
Tomlinson, P,B.1999. TheBotany of
Mangroves. Cambridge University
Press.USA : 3
Tsigos, I., A. Martinou, Kafetzopoulos and
V. Bouriotis. 2000. Chitin
deacetylases: New versatile tools in
biotechnology. TIBTECH Rev, 18:
305-312.
Tsigos I. dan V. Bouriotis. 1995.
Purification and characterization of
chitin deacetylase from
Colletotrichum lindemuthianum . J
Biol Chem, 270:26286 26291
Volk, W.A dan M.F.Wheeler.1993.
Mikrobiologi Dasar, Penerjemah
Markham Edisi Kelima. Erlangga.
Jakarta.