BAB III

METODOLOGI KERJA

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, alat maserasi, alu,
autoklaf, batang pengaduk, beaker glass, botol hand sanitizer, bunsen, deck glass.
erlenmeyer, gelas ukur, inkubator, jangka sorong, jarum ose, kapas steril, kertas
pencadang, kertas perkamen, laminar airflow cabinet (LAC), lemari pendingin,
lumpang, mikropipet, object glass, oven, pH meter, pinset, pipet tetes, rotary
evaporator, spatula, tabung reaksi dan timbangan analitik.

3.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah Rumput laut E. spinosum, rumput
laut E. cottonii, metanol, karbopol, trietanolamin, metil paraben, propilen glikol,
pewangi green tea, pewarna fast green, metanol, air suling, Nutrient Agar (NA),
Nutrient Broth (NB), NaCl 0,9%, H2SO4(p), BaCl2, triklosan, dimetil sulfoksida
(DMSO), sediaan gel hand sanitizer merek Y, Escherichia coli ATCC 35218, dan
Staphylococcus aureus ATCC 25923.

3.2 Permasalahan dan Penyelesaian Masalah dalam Formulasi

Tabel 1. Permasalahan dan Penyelesaian Masalah
No. Permasalahan Penyelesaian Masalah
1. Dalam formulasi hand sanitizer terdapat Disimpan atau dikemas
alkohol yang mudah menguap. dalam botol sediaan yang
tertutup rapat untuk
mencegah penguapan
alkohol.
2. Dalam formulasi gel hand sanitizer, Ditambahkan humektan
diperlukan suatu bahan untuk menjaga atau pelembab yaitu
stabilitas sediaan gel dan untuk menjaga propilen glikol untuk
kelembaban kulit. menjaga stabilitas sediaan
 gel dengan cara mencegah
kehilangan air dan untuk
menjaga kelembaban kulit
karena kandungan alkohol
dalam sediaan dapat
merenggangkan stuktur
lipid kulit sehingga air
menguap. Propilen glikol
dapat meningkatkan kerja
metil paraben sebagai
pengawet dan meningkatkan
laju difusi zat aktif sehingga
cepat berefek.
3. Dalam formulasi gel hand sanitizer Diberi pengawet (metil
mengandung banyak air yang merupakan paraben) yang merupakan
media pertumbuhan mikroba terutama antimikroba spektrum luas
kapang. dan sangat efektif terhadap
kapang.
4. Dalam formulasi gel hand sanitizer, Dapat diberikan karbopol
harus menggunakan basis gel yang sebagai basis gel karena
mempunyai toksisitas rendah dan tidak ketika didispersikan dalam
mengiritasi kulit serta dapat membentuk air akan membentuk gel
gel yang jernih. yang jernih dengan
penambahan alkali yaitu
trietanolamin. Karbopol
juga aman digunakan dalam
berbagai sediaan kosmetik
karena toksisitasnya rendah
dan tidak mengiritasi kulit.
5. Diperlukan suatu bahan untuk membantu Ditambahkan alkohol untuk
penguapan air dalam sediaan. membantu penguapan air
dalam sediaan sehingga
 cepat kering ketika
digunakan dan memberikan
sensasi dingin.
6. Dalam formulasi gel hand sanitizer, Ditambahkan pewangi
diperlukan suatu bahan untuk menutupi green tea untuk menutupi
bau sediaan yang kurang baik dan untuk bau sediaan yang kurang
memperbaiki estetika sediaan. baik dan pewarna fast green
untuk memperbaiki
penampilan atau estetika
sediaan.

3.3 Pendekatan Formula

Tabel 2. Formulasi Hand sanitizer 50 gram gel
No. Bahan Konsentrasi (%) Fungsi
1. Kombinasi ekstrak 4 Zat aktif
2. Karbopol 0,5 Pembentuk gel
3. Trietanolamin 5 tetes Penetral
4. Propilen glikol 15 Humektan
5. Metil paraben 0,2 Pengawet
6. Parfum green tea 2 tetes Pengaroma
7. Pewarna fast green 1 tetes Pewarna
8. Alkohol 15 Pembantu penguapan
9. Air suling 65,3 Pelarut
(Akib dkk., 2019).

3.4 Perhitungan Bahan dan Penimbangan

4
 Kombinasi ekstrak (1:1) : x 50 g = 2 gram
100
0,5
 Karbopol : x 50 g = 0,25 gram
100
 Trietanolamin : 2,5 tetes
15
 Propilen glikol : x 50 g = 7,5 gram
100
 0,2
 Metil paraben : x 50 g = 0,1 gram
100
 Parfum green tea : 1 tetes
 Pewarna fast green : 1 tetes
15
 Alkohol : x 50 g = 7,5 ml
100
65 ,3
 Air suling : x 50 g = 32,65 ml
100

3.5 Prosedur Kerja

3.5.1 Penyiapan Ekstrak
Sampel E. cottonii dan E. spinosum diperoleh di Kelurahan Ambeua,
Kecamatan Kaledupa, Kabupaten Wakatobi, Provinsi Sulawesi Tenggara. Sampel
masing-masing 5 kg disortasi basah, dicuci, dirajang, dikeringkan (40oC),
disortasi kering, dan dicacah hingga diperoleh serbuk kering.
Serbuk kering 300 g dimaserasi dengan 900 mL pelarut metanol selama 24
jam sehingga diperoleh filtrat. Maserasi diulangi hingga filtrat bening. Sisa pelarut
pada filtrat diuapkan menggunakan rotary evaporator (40oC) dan waterbath
(40oC) hingga diperoleh ekstrak kental. Dihitung rendemen ekstrak (Hanapi dkk.,
2013).

3.5.2 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak

3.5.2.1 Sterilisasi Alat

Sterilisasi alat menggunakan oven (± 2 jam, 170oC) atau autoklaf (15
menit, 121oC, 15 psi) (Hasriani dkk., 2013).

3.5.2.2 Pembuatan media NA

Sebanyak 5,7 g media NA dilarutkan dalam 200 mL air suling dan
dipanaskan hingga larut. Larutan media dituangkan dalam tabung masing-masing
3 mL dan disterilkan menggunakan autoklaf. Tabung NA dimiringkan segera
setelah dikeluarkan dari
autoklaf.
 3.5.2.3 Pembuatan media NB
Sebanyak 2,6 g media NB dilarutkan dalam 200 mL air suling dan
dipanaskan hingga larut. Larutan media dituangkan dalam tabung masing-masing
5 ml, ditutup dengan kapas, dan disterilkan menggunakan autoklaf.
3.5.2.4 Peremajaan bakteri
Sebanyak 1 jarum ose stok bakteri S. aureus dan E. Coli diinokulasi ke
dalam media NA miring lalu diinkubasi (24 jam,37oC) (Paju dkk., 2013).
Pembuatan larutan McFarland Standar 0,5: 9,95 mL H2SO4 1% dan
0,05 mL BaCl2 1% yang dikocok membentuk larutan keruh. Larutan tersebut
setara dengan kepadatan bakteri 1,5 x 108 CFU/mL atau 150 x 10CFU/m

3.5.2.5 Pembuatan suspensi bakteri

Sebanyak 1 ose hasil peremajaan bakteri dimasukkan ke dalam 10 mL
NaCl 0,9%, dihomogenkan menggunakan vortex, dihitung kekeruhan bakteri
sesuai standar Mc Farland 0,5.

3.5.2.6 Pembuatan larutan uji kombinasi ekstrak (1:1)

Variasi konsentrasi 1%, 2%, 4%, dan 8% dibuat dengan melarutkan
ekstrak ke dalam DMSO. Larutan kontrol positif adalah triklosan 1% dalam
pelarut DMSO.

3.5.2.7 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

Dilakukan dengan metode dilusi cair: Setiap tabung diisi dengan 4,8 mL
media NB dan 0,1 mL suspensi bakteri. Tabung uji (A, B, C, dan D) ditambahkan
0,1 mL larutan ekstrak masing-masing variasi konsentrasi. Tabung kontrol positif
(K1) ditambahkan 0,1 mL triklosan 1%. Tabung kontrol pelarut (K2) ditambahkan
0,1 mL DMSO. Tabung kontrol negatif (K3) tanpa penambahan. Tabung kontrol
normal (K4) hanya berisi media NB Seluruh tabung diinkubasi (24 jam, 37oC),
kemudian diamati pertumbuhan bakteri berupa kekeruhan. KHM adalah
konsentrasi ekstrak terendah yang tampak jernih.

3.5.2.8 Penentuan Konsentrasi Bunuh Minimun (KBM)

Dilakukan dengan metode dilusi padat. Masing-masing isi tabung
digoreskan di atas media NA padat, diinkubasi (24 jam, 37oC), dan diamati
pertumbuhan bakteri. KHM adalah konsentrasi ekstrak terendah yang tidak
ditumbuhi bakteri.
Karbopol didispersikan dalam mL air suling dan diamkan 24 jam,
ditambahkan 2 tetes trietanolamin hingga terbentuk massa A. Metil paraben,
ekstrak E. spinosum, dan ekstrak E. cottonii dilarutkan dalam propilen glikol dan
alkohol hingga terbentuk massa B. Selanjutnya massa B ditambahkan sedikit demi
sedikit ke dalam massa A, diaduk hingga homogen, dan ditambahkan sisa air
hingga terbentuk massa C. Pewarna fast green dilarutkan dalam alkohol,
ditambahkan ke dalam massa C hingga homogen, lalu ditambahkan parfum green
tea.

3.5.3 Karakterisasi Sediaan Gel

Uji organoleptik berupa pengamatan tekstur, warna, dan bau sediaan

(Ansel, 1989). Uji pH dilakukan dengan alat pH-meter yang dicelupkan ke dalam
1 gram gel yang dilarutkan dalam 10 ml air suling (Setyaningrum, 2010).

3.5.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri Sediaan Gel

Pengujian menggunakan metode dilusi cair terhadap bakteri S. aureus dan
E. coli dilanjutkan dengan penggoresan pada media untuk memastikan efek
bakterisidal sediaan. Gel 5 gram ditambahkan alkohol hingga volume menjadi 5
ml, dilakukan pula terhadap kontrol negatif (basis) dan kontrol positif (merek Y).
Disiapkan 10 tabung yang masing-masing berisi 4,8 ml media NB. Seluruh tabung
diinkubasi (24 jam, 37oC), kemudian diamati pertumbuhan bakteri berupa
kekeruhan. Semua tabung diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37oC. Lalu
masing-masing isi tabung digoreskan di atas media NA padat dan diinkubasi (24
jam, 37oC), kemudian diamati pertumbuhan bakteri.