Machine Translated by Google

D
Diterbitkan online 9 Desember 2020 Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1 371–382

hat
doi: 10.1093/ nar/ gkaa1165

d
Rekonstitusi mitokondria mamalia
sistem terjemahan yang mampu melakukan inisiasi dengan benar dan
sintesis polipeptida panjang dari mRNA tanpa pemimpin
Muhoon Lee1, Noriko Matsunaga1, Shiori Akabane1,2, Ippei Yasuda1, Takuya Ueda1,3 dan
Nono Takeuchi-Tomita 1,*

1Departemen Biologi Komputasi dan Ilmu Kedokteran, Sekolah Pascasarjana Ilmu Perbatasan, Universitas
Tokyo, 5-1-5, Kashiwanoha, Kashiwa-shi, Chiba 277-8562, Jepang, 2Departemen Ilmu Hayati, Universitas Rikkyo,
Tokyo, 171-8501, Jepang dan 3Departemen Biosains Integratif dan Teknik Biomedis, Sekolah Pascasarjana
Sains dan Teknik, Universitas Waseda, Tokyo, Shinjuku 162-8480, Jepang

Diterima pada 25 Agustus 2020; Direvisi 12 November 2020; Keputusan Redaksi 13 November 2020; Diterima 16 November 2020

ABSTRAK PERKENALAN

Mitokondria mamalia mempunyai dedikasinya sendiri
sistem sintesis protein, yang menghasilkan 13 subunit penting
dari kompleks fosforilasi oksidatif. Kami telah menyusun kembali oksidatif (OXPHOS) terdiri dari lima
sistem penerjemahan dari mitokondria mamalia, memanfaatkan
secara in vitro
terjemahan mitokondria rekombinan yang dimurnikan
faktor, ribosom 55S dari mitokondria hati babi,
dan campuran tRNA dari salah satu atau Escherichia coli
ragi. Sistem ini mampu menerjemahkan protein model
pengkodean mRNA tanpa pemimpin (DHFR dan
nanoLuciferase) atau beberapa protein yang dikodekan mtDNA.
Kami menunjukkan bahwa mRNA tanpa pemimpin, yang
mengkode nanoLu-ciferase, dimulai dengan setia tanpa memerlukannyapolipeptida berkode nuklir, yang disintesis di
faktor tambahan apa pun selain IF-2mt dan IF-3mt.
Kami menemukan bahwa aktivitas GTPase yang bergantung
pada ribosom dari translocase EF-G1mt dan
faktor daur ulang EF-G2mt tidak sensitif terhadap fusida
acid (FA), penghambat translasi yang menargetkan homolog EF-
G bakteri, dan akibatnya sistem
tahan terhadap FA. Selain itu, kami menunjukkan hal itu
urutan poliprolin dalam protein menyebabkan 55S
ribosom mitokondria terhenti, menghasilkan ribosom
kompleks rantai yang baru lahir. Analisis dampak dari
konsentrasi Mg pada penghentian ribosom yang dimediasi
poliprolin menunjukkan adanya regulasi unik dari
pemanjangan peptida oleh mitoribosom. Sistem ini akan berguna
untuk menganalisis mekanisme
inisiasi terjemahan, dan interaksi antara
rantai peptida yang baru lahir dan dada mitokondria.
Mitokondria menghasilkan sebagian besar energi yang digunakan
oleh sel mamalia melalui fosforilasi oksidatif. Sistem fosforilasi
kompleks multi-subunit yang terletak di dalam membran mitokondria
bagian dalam, dan terdiri dari inti dan mitokondria
Polipeptida yang dikodekan DNA (mtDNA). Polipeptida yang
dikodekan sekutu mitokondria mencakup tujuh subunit Kompleks I
(NADH:ubiquinone oxidoreductase), satu subunit dari
Kompleks III (koenzim Q-sitokrom c reduktase), tiga
subunit Kompleks IV (sitokrom c oksidase), dan dua
subunit Kompleks V (ATP sintase). 13 subunit membran ini disintesis
oleh mesin sintesis protein mitokondria dan berfungsi dalam kompleks
dengan
sitosol seluler dan kemudian diimpor ke mito-kondria (1). Regulasi
mitokondria yang terkoordinasi
dan sintesis protein sitoplasma diperlukan untuk yang tepat
fungsi sistem OXPHOS. Cacat pada mitokondria
sintesis protein sering menyebabkan berbagai penyakit manusia yang
berhubungan dengan defisiensi fosforilasi oksidatif (2-4).
Beberapa efek samping obat disebabkan oleh kesalahan penargetan obat
pada mesin sintesis protein mitokondria, dan penghambatan sintesis
protein mitokondria (5,6).
Sistem sintesis protein mitokondria mamalia
menggunakan seperangkat ribosom berbeda dengan koefisien
sedimentasi rendah sebesar 55S, dan terdiri dari subunit kecil 28S
dan subunit besar 39S (7). Ri-bosom mitokondria mamalia
(mitoribosom) memiliki kandungan rRNA yang berkurang
(25–30%RNA) (8), dan mengandung tiga spesies rRNA; 12S
di subunit kecil, 16S dan mt-tRNA(Val) di subunit besar
subunit (9,10). Mitoribosom relatif kaya protein,
dan protein tambahan dan/atau lebih besar dari mitoribo-beberapa
dianggap mengimbangi fungsi tersebut
rRNA yang lebih kecil (11-18). Sedangkan arsitektur inti katalitik dari
peptidil transferase dan pusat decoding

*Kepada siapa korespondensi harus ditujukan. Telp: +81 04 7136 3641; Faks: +81 04 7136 3648; Email: nono@edu.ku-tokyo.ac.jp

C Penulis 2020. Diterbitkan oleh Oxford University Press atas nama Penelitian Asam Nukleat.
Ini adalah artikel Akses Terbuka yang didistribusikan berdasarkan ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), yang
mengizinkan penggunaan kembali, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, asalkan karya aslinya dikutip dengan benar.
Machine Translated by Google
372 Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1
dilestarikan, ada sejumlah fitur struktural unik di mitoribosom, termasuk
tidak adanya anti-SD
urutan dan komponen berbeda yang membentuk gerbang masuk
mRNA (9,19-24). Salah satu fitur yang luar biasa adalah arsitektur
terowongan keluar polipeptida (PET), yang mungkin
telah berevolusi untuk memfasilitasi pemasangan membran ko-translasi
pada polipeptida yang baru lahir. Khususnya, dalam mi-toribosom ragi,
polipeptida yang baru lahir muncul dari lokasi ÿ3,5
nm jauhnya dari situs keluar kanonik, dan kanonik
PET diblokir oleh ekstensi spesifik mitoribosom yang panjang
dari mL23 (25). Pada mitoribosom mamalia, tempat keluarnya pasang
polipep yang diamati pada mitoribosom ragi diblokir
oleh 16S rRNA. Situs yang diduga dapat diakses oleh polipeptida
ÿ
(PAS), bukaan lateral 25 A dari lokasi keluar kanonik, juga sebagian
diblokir oleh komponen protein spesifik mitoribosom (21,24). Yang
lebih menarik lagi adalah faktanya
bahwa mL45, mitra dari ragi Mba1, reseptor mitoribosom yang terikat
membran, memasukkan ekornya ke dalam PET kanonik dan
sepenuhnya memblokir terowongan hingga
pusat peptidil transferase (26). Secara keseluruhan, jalur tepat yang
digunakan untuk mengekstrusi polipeptida yang baru lahir
dari mitoribosom hingga mesin penyisipan membran masih penuh teka-
teki.
Karena mitokondria berasal dari bakteri purba endosimbiotik,
mekanisme sintesis protein di mitokondria pada prinsipnya mirip
dengan bakteri. Namun,
seperti yang dijelaskan di bawah ini, penelitian-penelitian sebelumnya juga telah mengungkapkan
sejumlah perbedaan. Sejauh ini, proses individu
sistem sintesis protein mitokondria mamalia -
inisiasi, elongasi, terminasi, dan daur ulang ribosom
- telah dibentuk kembali secara in vitro menggunakan mitoribosom dan
faktor terjemahan. Inisiasi pembentukan kompleks telah terjadi
diselidiki dengan menganalisis pengikatan fMet-tRNA ke mitoribo-some
dengan adanya fragmen mRNA pendek (27-29).
Dua faktor inisiasi translasi mitokondria telah terjadi
diidentifikasi, IF-2mt dan IF-3mt. Dalam model saat ini (29),
IF-3mt awalnya berikatan dengan mitoribosom 55S, dan memisahkannya
menjadi subunit yang membentuk kompleks [IF-3mt:28S]; Kompleks
Pra-Inisiasi mitokondria 1 (mtPIC-1).
IF-3mt menginduksi penataan ulang struktural di sub-unit 28S,
memfasilitasi pengikatan IF-2mt ke mtPIC-1, yang menghasilkan
kompleks [IF-2mt:IF-3mt:28S]; mitokondria
Kompleks Pra-Inisiasi 2 (mtPIC-2). Sejak pengikatan
IF-3mt dan fMet-tRNA pada subunit 28S saling eksklusif, pelepasan
IF-3mt dari mtPIC-2 kemudian memungkinkan perakitan subunit
mRNA, fMet-tRNA dan 39S. Akibatnya,
kompleks [55S:fMet-tRNA:mRNA], kompleks inisiasi lengkap, terbentuk
dan berlanjut ke pemanjangan
proses. Di sini, waktu yang tepat dari pengikatan mRNA dan fMet-
tRNA ke subunit 28S, baik sebelum atau sesudahnya
pengikatan subunit 39S, masih belum diketahui. Jadi, apakah mRNA
mitokondria dimulai dengan subunit 28S atau dengan 55S
monosom tidak diketahui. Perlu ditekankan bahwa IF-3mt memiliki
aktivitas disosiasi ribosom selain
aktivitas anti-asosiasi bakteri IF-3, dan diperkirakan
secara aktif menyediakan subunit kecil 28S (30). Kekurangan mitokondria
homolog bakteri IF-1, suatu zat esensial yang sangat terpelihara
faktor inisiasi, namun peran faktor ini digantikan oleh
sisipan ditemukan di IF-2mt (26,31,32). Kebanyakan mamalia
mRNA mitokondria tidak memiliki pemimpin, sehingga tidak memiliki 5
urutan pemimpin untuk mempromosikan perekrutan mRNA ke ri-
D
hat
d
dada (33). Sedangkan mitoribosom mamalia dilaporkan
jika kita memilih kodon AUG terminal 5 pada mRNA tanpa pemimpin
(28), pertanyaannya masih tetap apakah faktor tambahan, seperti
aktivator terjemahan khusus transkrip, diperlukan untuk memastikan
ketepatan inisiasi terjemahan
mRNA tanpa pemimpin di mitokondria mamalia.
Proses pemanjangan peptida terutama telah dipelajari dengan
mengukur pengikatan ribosom Phe-tRNA di
adanya poli(U) mRNA dan ketergantungan poli(U).
sintesis poli(Phe) (34). Aminoasil-tRNA dikirim ke situs A ribosom oleh
EF-Tumt. Mengikuti
reaksi transfer peptida, translokasi dikatalisis oleh EF-G1mt. EF-G1mt
adalah translocase eksklusif, berbeda dengan
bakteri EF-G, yang bertanggung jawab untuk translokasi dan daur
ulang ribosom (35). Fungsi EF-Tsmt
sebagai faktor pertukaran PDB:GTP untuk EF-Tumt. Sistem sintesis
poli(Phe) yang bergantung pada poli(U) yang dimodifikasi memiliki
telah diterapkan untuk mempelajari fungsi mt-tRNASer (AGY)
dengan struktur yang tidak biasa yang tidak memiliki keseluruhan D-loop (36).
Fungsi modifikasi spesifik mitokondria dari 5-
formylcytidine (f5C) di mt-tRNAMet diselidiki oleh
sistem sintesis oligo(Met) yang bergantung pada oligo(AUN) (37).
Selama proses penghentian dan daur ulang ribosom,
RF-1Lmt/mtRF1a mengenali kodon stop (UAA atau
UAG) dan mendorong reaksi pelepasan peptida. Tulang rusuk
kemudian dipisahkan menjadi subunit untuk
babak penerjemahan berikutnya melalui tindakan bersama
RRFmt dan EF-G2mt. EF-G2mt, mitokondria kedua
homolog bakteri EF-G, merupakan faktor daur ulang eksklusif yang
tidak memiliki aktivitas translokasi (35). Pelepasan peptida
Aktivitas RF-1Lmt/mtRF1a telah dideteksi dengan menganalisis
aktivitas hidrolisis peptidil-tRNA yang bergantung pada ribosom
(38-40). Kegiatan EF-G2mt dan RRFmt telah
telah diselidiki dengan memeriksa reaksi disosiasi 55S dan
kemampuannya untuk mendorong terjemahan multi-putaran
(35). Tidak ada homolog bakteri RF-3, dan mekanisme keluarnya
RF1Lmt/mtRF1a dari ribosom setelah reaksi pelepasan peptida masih
belum jelas. Selain RF-1Lmt/mtRF1a, terdapat empat protein keluarga
RF di mitokondria mamalia: mtRF1, ICT1, C12orf65, dan mS35
(41), namun fungsi tepatnya masih harus diklarifikasi.
Dalam penelitian ini, kami telah menyusun kembali secara in vitro
sistem terjemahan dari mitokondria mamalia, memanfaatkan faktor
terjemahan mitokondria yang dimurnikan (IF-2mt, IF-3mt, EF-Tumt, EF-
Tsmt, EF-G1mt, EF-G2mt,
RF-1Lmt/mtRF1a dan RRFmt) dan mitoribosom 55S,
dimana inisiasi yang benar dapat dilanjutkan dan terjemahannya
ORF yang ditentukan diperbolehkan dari mRNA tanpa pemimpin. Itu
sistem yang dikembangkan mampu mensintesis protein dalam waktu lama
cukup untuk melewati terowongan peptida, dan panjangnya
dan urutan rantai peptida yang baru lahir dapat dikontrol. Kompleks
rantai baru lahir ribosom (RNC) dapat berupa
diperoleh dengan memanfaatkan ribosom yang dimediasi poliprolin
mengulur waktu. Sistem ini memfasilitasi analisis biokimia
inisiasi penerjemahan dalam mitokondria mamalia, dan
regulasi pemanjangan peptida melalui interaksi antara rantai peptida
yang baru lahir dan terowongan peptida dari
mitoribosom. Sistem ini juga menyediakan kerangka kerja
untuk mempelajari fungsi tRNA mitokondria, dan
penyisipan membran ko-translasi protein dalam mitokondria mamalia.
Machine Translated by Google
BAHAN DAN METODE
Persiapan DNA cetakan dan mRNA untuk translasi
Templat DNA yang digunakan untuk penerjemahan disintesis secara
kimia (Thermo Fisher Scientific), dan mR-NA ditranskripsi
menggunakan T7 RNA polimerase. Lihat Tabel Tambahan S1 dan
S2 untuk urutan templat.
Pemurnian komponen yang digunakan dalam sistem terjemahan
mitokondria mamalia-malia yang dibentuk kembali
Ribosom 55S dibuat dari mitokondria hati babi
(42), dengan sedikit modifikasi; mitoribosom mentah (70
A260 unit dalam 600 l) diberi puromisin 0,5 mM (konsentrasi akhir)
pada suhu 27ÿC selama 15 menit, sesaat sebelum pemuatan
ke gradien kepadatan sukrosa untuk pemurnian 55S. Itu
Campuran Escherichia coli tRNA dibeli dari Roche.
Campuran ragi tRNA dan aminoasil-tRNA telah disiapkan seperti
dijelaskan (43). Untuk komponen lainnya, lihat Tabel Tambahan S3.
Rekonstitusi terjemahan mitokondria mamalia
sistem
Kecuali ditentukan lain, campuran terjemahan standar (10 l)
mengandung 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 100
mM kalium glutamat, 7 mM Mg(OAc)2, 2 mM spermidine, 0,1 mM
spermine, 1 mM DTT, masing-masing amino 0,15 mM
asam (kecuali metionin dan sistein), 0,05 mM metionin, 0,1 mM
sistein, 1 mM ATP, 1 mM GTP, 20 mM kreatin fosfat, 0,1 g 10-
formil-5,6,7,8-tetrahydrofolic
asam, kreatin kinase 100 nM, miokinase 20 nM, 15 nM
nukleosida-difosfat kinase, pirofosfatase 15 nM,
0,5 M IF-2mt, 0,5 M IF-3mt, 5 M EF-Tumt, 1 M
EF-Tsmt, 0,5 M EF-G1mt, 0,5 M EF-G2mt, 0,5 M
RF-1Lmt, 0,5 M RRFmt, 5 M metionil-tRNA trans-formylase (E. coli
MTF), 0,2 M 55S ribosom, 0,045
A260 unit campuran ragi aminoasil-tRNA, dan 0,1 M
mRNA. Jika diindikasikan, 0,5 L [35S]metionin (>37
TBq/mmol, 400 MBq/mL) dimasukkan, bukan metionin yang tidak
diberi label. Campuran reaksi diinkubasi pada
37ÿC untuk jangka waktu yang ditentukan. Setelah sampel
diobati dengan RNase A (konsentrasi akhir 0,2 mg/ml)
pada suhu 30ÿC selama 10 menit, sampel diselesaikan dengan Tricine
SDS-HALAMAN. Perlakuan RNase A dihilangkan untuk uji pelepasan
peptida (Gambar Tambahan S3 dan S6). Kami
perhatikan bahwa inisiator ragi metionil-tRNA, dan bentuk fMet-tRNA
yang diformulasikan, merupakan substrat yang baik untuk E. coli MTF
dan IF-2mt masing-masing (44,45).
Untuk memasangkan aminoasilasi dan/atau transkripsi dengan
reaksi translasi, kami memodifikasi campuran reaksi.
Reaksi tersebut mengandung 13 mM Mg(OAc)2, 2 mM sper-midine,
0,1 mM spermine, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1
mM CTP dan 1 mM UTP. Ketika aminoasilasi terjadi
digabungkan, 30–300 unit masing-masing E. coli ARS (46) dan 0,56
Campuran A260 unit E. coli tRNA dimasukkan sebagai pengganti
campuran ragi aminoasil-tRNA. Untuk reaksi gabungan transkripsi-
terjemahan, 30 nM T7 RNA polimerase
dan DNA templat 10 nM dimasukkan, sebagai pengganti
mRNA.
D
Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1 373
hat
d
Untuk mengurangi kesalahan manipulasi, gabungkan sebanyak
mungkin komponen dan tambahkan dalam satu langkah. Misalnya,
campuran reaksi untuk beberapa sampel disiapkan dan dialokasi
ke dalam mRNA yang telah disiapkan sebelumnya dalam tabung yang berbeda.
Sensitivitas sistem translasi mitokondria yang dibentuk kembali
untuk antibiotik (asam fusidat, kloram-fenikol, dan sikloheksimid)
telah diperiksa untuk mengecualikan
kemungkinan kontaminasi ribosom sitosol (Gambar Tambahan S1).
uji nanoLuciferase
Aktivitas enzimatik produk dinilai dengan a
Sistem Uji Nano-Glo Luciferase (Promega). Reaksi 2 l dihentikan
dengan menambahkan 18 l larutan penghenti (20 mM
HEPES–KOH [pH 7,5], 100 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)2,
0,1 mg/ml RNase A), lalu dicampur dengan 20 l substrat dalam pelat
putih dengan luas setengah lubang 96 lubang. Setelah inkubasi
selama 17 menit pada suhu kamar, pendaran dideteksi dengan
Sistem Multi Deteksi GloMax (Promega).
Pengukuran aktivitas GTPase
Aktivitas GTPase yang bergantung pada ribosom pada EF-G1mt/
G2mt manusia dan E. coli EF-G diukur seperti yang dijelaskan
(34). Secara singkat, pengujian dilakukan dalam 25 l buffer pengujian
GTPase (20 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 100 mM KCl,
4,5 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT, 2 mM spermidine, 0,05
mM spermine) mengandung 5 pmol (konsentrasi akhir: 0,2
M) ribosom 55S/70S dan 1 g (konsentrasi akhir
0,5 M) dari EF-G1/G2mt. Reaksi dimulai dengan menambahkan
0,5 l 7,5 mM [- 32P]GTP (50–100 cpm/pmol). Setelah
Inkubasi 10 menit pada suhu 30ÿC, reaksi dihentikan dengan
menambahkan 100 l 0,1 N H2SO4–1,5 mM NaH2PO4 dan 25
l natrium molibdat 5%. Kompleks fosfomolibdat
diekstraksi dengan 250 l n-butanol. Aliquot (250 l) dari
lapisan butanol dihitung dengan penghitung sintilasi.
Dalam kondisi ini, aktivitas GTPase terdeteksi
dalam rentang linier dari waktu ke waktu, dan bergantung pada konsentrasi
dari faktor tersebut.
HASIL
Sintesis protein yang dikodekan mtDNA dengan cara dilarutkan
sistem terjemahan mitokondria mamalia
Kami menyusun kembali sistem terjemahan mitokondria dengan
menggunakan faktor terjemahan mitokondria rekombinan murni
(IF-2mt, IF-3mt, EF-G1mt, EF-G2mt, EF-Tumt, EF-Tsmt, RF-1Lmt
dan RRFmt; Gambar 1A ) , dan yang terisolasi
Ribosom 55S dari mitokondria hati babi (Gambar 1B). Kami
awalnya mencoba untuk mensintesis model protein DHFR,
serta 13 protein berkode mtDNA (Gambar 2) (gel penuh
gambar juga ditunjukkan pada Gambar Tambahan S2). Kami
merancang templat DNA untuk mRNA tanpa pemimpin
masing-masing protein, di mana setiap protein dikodekan mengikuti
fragmen mRNA cI tanpa pemimpin dari bakteriofag lambda (Gambar
2A, atas; Tabel Tambahan S1).
Dengan menggunakan templat DNA ini, reaksi translasi dilakukan
dengan menggabungkan transkripsi dan aminoasilasi
reaksi. Di sini, kami menggunakan campuran E. coli tRNA, yang
dapat diaminoasilasi dengan aminoasil E. coli yang dimurnikan
Machine Translated by Google

D
374 Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1

Gambar 1. Komponen yang digunakan dalam sistem penerjemahan mitokondria

mamalia yang dibentuk kembali. (A) Faktor penerjemahan. Faktor inisiasi (IF-2mt
dan IF-3mt), faktor pemanjangan (EF-Tumt, EF-Tsmt dan EF-G1mt) dan
faktor terminasi dan daur ulang (RF-1Lmt, EF-G2mt dan RRFmt), 2 g
masing-masing, diselesaikan dengan 12% SDS-PAGE dan diwarnai dengan
Coomassie Bril-liant Blue (CBB). (B) Ribosom. Ribosom 55S dipisahkan pada 6–38%
(b/v) gradien sukrosa sambil memantau serapan pada 260 nm.

sintetase tRNA ditambahkan ke sistem reaksi translasi,

karena saat ini sulit untuk memperoleh jumlah yang cukup
tRNA mitokondria. Kami mencatat bahwa templat DNA untuk
Protein yang dikodekan mtDNA memanfaatkan urutan DNA dari
mtDNA manusia, namun kodon kode genetik non-universal
mitokondria dimutasi menjadi kodon kode universal: kodon
AUA(metionin) dan UGA(triptofan)
masing-masing diubah menjadi AUG dan UGG. Model
protein DHFR dan tiga protein berkode mtDNA (ATP8,
hat
d
Gambar 2. Sintesis protein berkode mtDNA dengan cara dilarutkan
sistem terjemahan mitokondria mamalia. (A – C) Reaksi translasi (transkripsi
berpasangan, aminoasilasi, dan reaksi translasi)
dilakukan dengan menggunakan DNA templat yang ditunjukkan dan campuran tRNA E. coli
dengan adanya [35S] metionin. Setelah reaksi 120 menit, sampel diberi RNase
A dan difraksinasi dengan 15% SDS-PAGE. Itu
Skema mRNA yang dihasilkan dari DNA cetakan selama reaksi ditunjukkan di
bawah panel. (A) Reaksi dengan template standar
DNA; (B) reaksi dengan DNA cetakan kontrol, di mana kodon AUG inisiasi dalam
DNA cetakan standar dimutasi menjadi ACG dan
(C) reaksi dengan DNA cetakan kontrol, di mana urutan cI
dalam templat standar, DNA dihapus. Gambar gel lengkap ditampilkan di
Gambar Tambahan S2. Serangkaian eksperimen lain yang sesuai dengan
(C) ditunjukkan pada Gambar Tambahan S2C. Tanda panah putih menunjukkan
produk terjemahan yang relevan, dan tanda bintang menunjukkan produk
terjemahan yang tidak diketahui. DHFR, E. coli dihidrofolat reduktase; ND1–6 dan ND4L,
subunit NADH dehidrogenase; ATP6 dan ATP8, subunit ATP sintase;
CO1–3, subunit sitokrom c oksidase; CytB, sitokrom b. Molekuler
berat DHFR dan protein yang dikodekan mtDNA, tanpa urutan cI (kDa):
DHFR(18), ATP6(24.8), ATP8(8), CO3(30), CO2(25.6),
CO1(57), CytB(42.7), ND1(36), ND2(39), ND3(13), ND4L(11), ND4(52),
ND5(67), ND6(18).
Machine Translated by Google
ND3 dan ND4L) berhasil disintesis (Gambar
2A), dan kami mengkonfirmasi bahwa protein ini disintesis
dengan cara yang bergantung pada kodon inisiasi (Gambar 2B). Kami
namun perhatikan bahwa spesies yang ditunjukkan pada Gambar 2A untuk ATP8,
ND3 dan ND4L masih terdapat pada Gambar 2B, meskipun pada a
intensitas yang lebih rendah (lihat juga Gambar Tambahan S2E). Dengan demikian,
kita tidak dapat mengesampingkan kemungkinan bahwa produk yang diamati
adalah produk inisiasi penerjemahan alternatif.
Urutan cI mRNA dari bakteriofag lambda adalah
diperlukan untuk sintesis protein ini secara efisien (Gambar 2C).
Agaknya, kodon inisiasi AUG proksimal 5
dalam mRNA akan terekspos dengan baik dalam konteks
urutan lambda cI mRNA. Semua 13 protein yang dikodekan mtDNA
adalah subunit dari kompleks rantai pernapasan, dan
memiliki beberapa domain trans-membran hidrofobik.
Diantaranya, tiga protein dengan molekul terendah
bobot (ATP8, 8 kDa; ND3, 13 kDa; ND4L,11 kDa), dengan
kurang dari tiga domain trans-membran, berhasil disintesis. Untuk
mensintesis sisa protein yang dikodekan mtDNA, mungkin perlu
menyediakan mesin penyisipan membran ko-translasi dalam sistem
translasi. Sintesis protein mitokondria dilaporkan
bergantung pada kehadiran, dan pada pertemuan bersama dengan,
subunit turunan nuklir yang terikat membran (47). Aktivator translasi
untuk mengekspos inisiasi 5 AUG proksimal
kodon dalam mRNA mungkin juga diperlukan. Aktivator translasi
spesifik transkrip diperlukan dalam sistem terjemahan mi-tokondria
ragi (48), dan microRNA terlibat dalam aktivasi terjemahan dari kode
mtDNA.
mRNA mitokondria mamalia (49).
Untuk mempermudah, mRNA dibangun secara keseluruhan
penelitian ini disatukan untuk memiliki fitur tanpa pemimpin dan
poliadenilasi, meskipun setiap mRNA mitokondria
memiliki ciri khas in vivo (2). Dalam terjemahan mRNA nLu-ciferase
(digunakan pada Gambar 3 dan 5), penambahan sedikit
nukleotida di hulu 5 AUG proksimal menekan
terjemahan menjadi ÿ20%, konsisten dengan laporan sebelumnya
(28), dan penghapusan poliadenilasi menunjukkan efek minimal
(data tidak ditampilkan).
Ketergantungan terjemahan mitokondria yang dibentuk kembali
sistem pada setiap komponennya
Kami menganalisis ketergantungan sistem terjemahan yang dibentuk
kembali pada setiap komponen (Gambar 3). Mulai sekarang,
kami menerapkan sistem terjemahan yang independen
transkripsi dan reaksi aminoasilasi. Di tempat lain
kata-kata, reaksi terjemahan dilakukan dengan menggunakan
mRNA dan campuran ragi aminoasil-tRNA yang telah diisi sebelumnya.
Kami menyiapkan mRNA tanpa pemimpin yang mengkode nanoLu-
ciferase (nLuc) diapit oleh urutan pemimpin, yang disusun
dari 3xFLAG dan N-terminal 36 asam amino ragi
Pgk1 (fosfogliserat kinase 1) (Pgk1-36), dan tag HA (Gambar 3A,
atas). Reaksi sintesis nLuc menyertakan mRNA ini dengan masing-
masing faktor dikurangi darinya
campuran reaksi, dan aktivitasnya dianalisis dalam a
rentang linier (Gambar 3A, lebih rendah).
Penghilangan MTF atau IF-2mt sangat menghambat sintesis nLuc.
Meskipun tingkat formilasi inisiator Met-tRNA dalam reaksi saat ini
tidak diketahui.
D
Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1 375
hat
d
diketahui, hasil ini menunjukkan bahwa terjemahan dimulai dengan
formil-Met-tRNA di sistem kami. Kelalaian dari
IF-3mt juga sangat menghambat sintesis nLuc, sesuai dengan laporan
sebelumnya bahwa IF-3mt merangsang
pembentukan kompleks inisiasi menggunakan mitoribosom 55S
dan mRNA tanpa pemimpin (28). Penghambatan sebagian nLuc
sintesis dapat menunjukkan bahwa inisiasi translasi adalah a
campuran mode yang memerlukan dan tidak memerlukan IF-3mt.
Penghilangan faktor perpanjangan EF-Tumt atau EF-G1mt
pada dasarnya tidak menghasilkan terjemahan, sedangkan EF-Tsmt
memiliki efek minimal. Kami sebelumnya mengamati bahwa EF-Tsmt
mempromosikan sintesis poli(Phe) ketika jumlah terbatas
EF-Tumt hadir dalam reaksi (50). Efek EF-Tsmt mungkin tidak
terdeteksi karena adanya kelebihan EF-Tumt.
Penghilangan faktor pelepasan peptida RF-1Lmt tidak terjadi
menekan sintesis nLuc. Seperti yang kami konfirmasi sebelumnya
menghentikan aktivitas pelepasan peptida yang bergantung pada kodon RF-1Lmt
pada mitoribosom (40), kami memeriksa apakah nLuc berukuran
sintesis memang dilepaskan oleh RF-1Lmt. Analisis ini
mengungkapkan bahwa nLuc yang disintesis dilepaskan dari dada
bahkan tanpa adanya RF-1Lmt (Tambahan
Gambar S3A), dan dengan demikian bisa menjadi alasan mengapa
RF-1Lmt berdampak minimal pada sintesis nLuc. Saat ini, kami tidak
dapat menjelaskan mekanisme pasti dari RF-1Lmt-independent ini
pelepasan peptida pada kodon stop. Namun, saat kita berdiskusi
kemudian, pelepasan peptida yang tidak biasa seperti itu dapat terjadi di
sistem kita, terutama ketika situs A ribosom kosong untuk sementara waktu.
lama.
Penghilangan faktor daur ulang (EF-G2mt, RRFmt)
tidak menekan sintesis nLuc. Karena faktor-faktor tersebut adalah
mampu mendaur ulang mitoribosom (35), salah satu kemungkinannya adalah
bahwa nLuc disintesis dalam satu putaran terjemahan di bawah
kondisi sistem. Jadi, kami juga menganalisis
ketergantungan sintesis peptida yang lebih pendek pada faktor-faktor
ini (Gambar 3B), karena oligopeptida dilaporkan disintesis melalui
translasi multi-putaran dalam E. coli yang dilarutkan.
sistem terjemahan coli dan ragi (40,51). Kami menyiapkan
mRNA tanpa pemimpin yang mengkode peptida 3xFLAG (Gambar 3B,
atas). Setelah reaksi translasi dilakukan menggunakan
campuran aminoasil-tRNA berlabel metionin [35S], peptida 3xFLAG
yang disintesis diselesaikan dengan Tricine SDS-PAGE, dan hasil
pasang surut 3xFLAG yang disintesis dinilai dengan penggabungan
metionin [35S].
Analisis ini mengungkapkan bahwa peptida disintesis
dengan cara yang bergantung pada EF-G2mt dan RRFmt (Gambar
3B, lebih rendah, EF-G2mt(–), RRFmt(–)), menunjukkan bahwa
sintesis berlangsung sekitar dua hingga tiga putaran
penerjemahan, sebagaimana dinilai oleh penggabungan metionin
[35S] ke dalam peptida. MRNA pendek juga berikatan dengan
subunit mitoribosom kecil, tetapi dengan afinitas yang jauh lebih
rendah dibandingkan dengan mRNA panjang (52). Jadi, tidak efisien
Sintesis peptida 3xFLAG dengan kekuatan paling banyak tiga putaran
akibat dari proses inisiasi yang lambat. Kami mencatat bahwa sintesis
oligopeptida dari mRNA lebih pendek dari 3xFLAG
tidak terdeteksi (hasil tidak dipublikasikan). EF-G2mt dan
RRFmt memisahkan ribosom hanya setelah peptidil-tRNA
dihidrolisis oleh RF-1Lmt (40). Oleh karena itu, multi-putaran
sintesis peptida 3xFLAG harus ditekan jika
Machine Translated by Google

D
376 Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1

RF-1Lmt(-)), menunjukkan bahwa peptida 3xFLAG disewakan kembali

dengan cara yang tidak bergantung pada RF-1Lmt. Kami memeriksa
apakah peptida 3xFLAG yang disintesis dilepaskan oleh
RF-1Lmt, dan menemukan bahwa mereka memang dilepaskan dari
ribosom bahkan tanpa adanya RF-1Lmt (Gambar Tambahan S3B),
yang kompatibel dengan pelepasan nLuc yang tidak bergantung pada
RF-1Lmt dari mitoribosom yang dijelaskan
di atas (Gambar Tambahan S3A).
hat
d
Gambar 3. Ketergantungan sistem translasi mitokondria mamalia yang dibentuk kembali pada setiap komponen. (A) Sintesis nLuc: Skema
mRNA yang digunakan dalam reaksi (atas). Reaksi translasi dilakukan dengan menggunakan campuran ragi aminoasil-tRNA berlabel mRNA dan [35S]metionin, dengan
setiap faktor dikurangi dari campuran reaksi. Setelah reaksi 120 menit, sampel diberi perlakuan dengan RNase A dan diselesaikan dengan Tricine SDS-PAGE (kiri
bawah), atau alikuot dikenai uji nLuc (kanan bawah). Jumlah nLuc yang disintesis dalam 'Lengkap' kira-kira sama
0,026 nm. Bilah kesalahan mewakili deviasi standar dari tiga percobaan independen. Di jalur paling kanan gel, produk terjemahan 3XFLAG
mRNA di (B) juga ditampilkan, untuk dibandingkan dengan produk nLuc mRNA non-spesifik 2–5 kDa (lihat juga Gambar Tambahan S4). (B) peptida 3xFLAG
sintesis: Skema mRNA yang digunakan dalam reaksi (atas). Reaksi translasi dilakukan seperti pada (A). Setelah reaksi terjemahan 120 menit,
sampel diperlakukan dengan RNase A dan diselesaikan dengan Tricine SDS-PAGE (kiri bawah). Hasil peptida 3xFLAG yang disintesis dinilai dengan
penggabungan metionin [35S] ke dalam peptida, dan jumlah peptida yang disintesis pada 120 menit diplot (kanan bawah). Jumlah
Peptida 3xFLAG yang disintesis dalam 'Lengkap' setara dengan ÿ0,039 nM. Bilah kesalahan mewakili deviasi standar dari tiga percobaan independen.

pelepasan peptida oleh RF-1Lmt dihambat. Namun, kami

menemukan bahwa penghilangan RF-1Lmt tidak menghambat
sintesis multi-putaran peptida 3xFLAG (Gambar 3B,
Resistensi asam fusidat dari mitokondria yang dilarutkan
sistem terjemahan

Sejauh ini, kerentanan mitokondria terhadap antibiotik

sistem sintesis protein in vitro telah diselidiki menggunakan
sistem sintesis poli(Phe), terjemahan yang dibentuk kembali
proses pemanjangan (53–55). Dengan menerapkan sistem
penerjemahan mi-tokondria yang dikembangkan, kami mencoba
menguji antibiotik yang mempengaruhi proses penerjemahan selain
langkah elon-gasi.
Salah satu ciri homolog EF-G adalah
sensitivitas terhadap asam fusidat (FA). FA mengunci EF-G di
Machine Translated by Google
D
hat
d
Konformasi GTP setelah hidrolisis GTP, dan dengan demikian
mencegah faktor tersebut berdisosiasi dari ribosom (56–
58). Dengan demikian, FA menghambat translokasi multi-putaran (59-62),
serta daur ulang ribosom oleh bakteri EF-G (63-65).
Translocase EF-G1mt dilaporkan resisten terhadap FA in
sintesis poli(Phe) yang bergantung pada poli(U) (53–55). Penyisipan
dalam loop switch1 domain EF-G1mt G dapat dilakukan
menyebabkan penurunan ikatan FA dengan EF-G1mt pada dada
mitori (66). Namun, sensitivitas FA terhadap aktivitas GTPase yang
bergantung pada ribosom oleh EF-G1mt belum diketahui
didemonstrasikan. Kerentanan FA terhadap faktor daur ulang EF-
G2mt hampir tidak pernah diteliti, dan penyisipannya
di loop switch1 domain G tidak ada di EF-G2mt.
Kami memeriksa aktivitas GTPase yang bergantung pada ribosom
EF-G1mt dan EF-G2mt, dan menemukan bahwa FA tidak
mempengaruhi salah satu dari keduanya (Gambar 4A). Akibatnya, FA
memberikan efek minimal pada terjemahan multi-putaran
Peptida 3xFLAG, dengan EF-G1mt dan EF-G2mt berada
diperlukan (Gambar 4B). Mekanisme yang mendasari
Resistensi FA pada EF-G1mt dan EF-G2mt memerlukan lebih lanjut
penyelidikan.
Ribosom yang dimediasi poliprolin terhenti saat dilarutkan
sistem terjemahan mitokondria
Sintesis protein yang mengandung residu poliprolin
menyebabkan penangkapan terjemahan, yang diselamatkan oleh pemanjangan
faktor a/eIF5A pada archaea dan eukariota dan oleh faktor elon-
gation P (EF-P) pada bakteri (67-70). Tidak lebih dari
tiga residu prolin berturut-turut ditemukan dalam protein yang
dikodekan mtDNA, dan tidak ada homolog mitokondria dari EF-P
atau a/eIF5A telah diidentifikasi dalam urutan genom.
Kami bertanya-tanya apakah ribosom mitokondria mensintesis a
poliprolin yang mengandung protein menjadi terhenti. Kami
menyiapkan mRNA yang bermotif poliprolin, baik Pro x4
atau Pro x12, disisipkan di tengah-tengah urutan pengkodean, hilir
3xFLAG dan urutan Pgk1–36, dan hulu nanoLuciferase (Gambar 5A),
dan menganalisis sintesis nLuc dari mRNA ini.
Kami menemukan bahwa Pro x4 dan Pro x12 mengurutkan keduanya
sangat menekan terjemahan nLuc (Gambar 5B).
Selain itu, protein terpotong berlabel metionin [35S] dari
mRNA yang mengandung poliprolin diamati oleh Tricine
Analisis SDS-PAGE (Gambar 5C). Hasil ini menunjukkan
bahwa ribosom mitokondria memang terhenti
motif poliprolin.
Kami sebelumnya mengamati bahwa motif poliprolin menyebabkan
represi terjemahan secara eksklusif dalam kondisi rendah
Konsentrasi Mg2+ dan poliamina dalam dilarutkan
sistem terjemahan ragi, dan peningkatan konsentrasi Mg2+ dalam
reaksi mengurangi efek yang dimediasi poliprolin
penangkapan ribosom (51). Oleh karena itu, kami memeriksa
konsentrasi Mg2+ untuk penerjemahan mR-NA yang mengandung
poliprolin dalam sistem penerjemahan mitokondria yang dibentuk kembali.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa stalling dimediasi oleh poliprolin
ribosom mitokondria tidak diatasi dengan konsentrasi magnesium
hingga 13 mM (Gambar 5D), menunjukkan mekanisme unik
penangkapan terjemahan yang dimediasi poliprolin dalam terjemahan
mitokondria yang dilarutkan
sistem.
Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1 377
DISKUSI
Mekanisme inisiasi translasi mRNA tanpa pemimpin di
mitokondria mamalia
Dalam penelitian ini, kami telah menyusun kembali mamalia
sistem terjemahan in vitro mitokondria yang mampu mensintesis
polipeptida panjang. MRNA tanpa pemimpin, dalam hal ini
nanoLuciferase, dimulai dengan setia tanpa perlu
faktor tambahan apa pun selain IF-2mt dan IF-3mt. Untuk
Urutan 3XFLAG ditambahkan ke konstruksi nLuciferase,
kami merancangnya agar memiliki konten GC rendah dan untuk menghindarinya
kodon AUG, termasuk kodon AUG out-frame, sebagai
sebanyak mungkin. Aktivator translasi tambahan
mungkin tidak diperlukan, selama 5 Agustus proksimal
kodon inisiasi pada mRNA terekspos dengan baik dan ada
tidak ada elemen lain di ORF yang mengganggu penerjemahan.
mS39, protein pentatri-copeptida repeat (PPR) spesifik ribosom
mitokondria, terletak di mRNA
pintu masuk subunit kecil ribosom, dan telah
diusulkan untuk mempromosikan pengikatan mRNA melalui interaksi
dengan urutan kaya-U di hilir dari urutan ketujuh
kodon mRNA mitokondria (19,26). Memang benar, gangguan mS39
mengakibatkan penurunan aktivitas translasi mitokondria (71),
meskipun hal ini sebagian disebabkan oleh cacat pada perakitan
ribosom mi-tokondria (72). Ribosom bakteri 70S tidak memiliki
homolog struktural mS39, tetapi protein ribosom S1 yang terletak di
pintu masuk mRNA berfungsi dalam
merekrut mRNA dengan berinteraksi dengan urutan kaya-U
hulu urutan SD dalam mRNA kanonik (73,74).
Namun perlu dicatat bahwa S1 tidak diperlukan dalam inisiasi mRNA
tanpa pemimpin (75,76). Sekitar 30–50%
dari ribosom 55S dalam persiapan kami terikat dengan
mS39 (Gambar Tambahan S5), dan mS39 mungkin tidak
terlibat dalam inisiasi penerjemahan, setidaknya, nLuc
mRNA tanpa pemimpin. Mengandung motif PPR kaya leusin
protein dan pengikatan RNA yang berinteraksi dengan loop batang SRA
kompleks protein (kompleks LRPPRC-SLIRP) berikatan dengan
wilayah pengkodean mRNA mitokondria untuk mengekspos kodon
inisiasi pada ujung 5 mRNA (77), dan selanjutnya dapat merekrut
mRNA ke mitoribosom melalui interaksi
dengan mS39 (78). Interaksi LRPPRC-SLIRP•mS39•mRNA mungkin
diperlukan secara khusus untuk inisiasi translasi mRNA mitokondria
yang sangat terstruktur. Lebih jauh
penelitian diperlukan untuk memperjelas fungsi mS39.
Mekanisme penangkapan terjemahan yang dimediasi poliprolin di
sistem terjemahan mitokondria yang dibentuk kembali
Menggunakan sistem terjemahan ragi yang dilarutkan secara in vitro ,
kami sebelumnya menunjukkan bahwa poliprolin menangkap trans-
lasi dengan cara yang mirip dengan 'destabilisasi ribosom intrinsik
(IRD)' (51). IRD adalah fenomena yang baru ditemukan pada bakteri,
dimana asam amino asam yang berurutan dan diselingi prolin
mengganggu kestabilan ribosom 70S dari dalam terowongan peptida
dan membatalkan translasi (79). Dalam sistem penerjemahan ragi
yang dilarutkan, dalam kondisi dengan Mg2+ rendah, poliprolin
mengganggu kestabilan keduanya.
peptidilpoliprolin-tRNA itu sendiri dan ribosom, dan menghambat
reaksi transfer peptidil. Namun, dalam kondisi dengan Mg2+ tinggi,
di mana ribosom stabil, dis-
Machine Translated by Google

D
378 Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1

hat
d
Gambar 4. Resistensi asam fusidat (FA) dari sistem translasi mitokondria mamalia yang dibentuk kembali. (A) Pengaruh FA pada aktivitas GTPase
yang bergantung pada ribosom. E. coli EF-G/EF-G1mt/EF-G2mt (konsentrasi akhir 0,5 M) diinkubasi dengan ribosom (konsentrasi akhir 0,2 M) dan [-
32P]GTP dengan adanya jumlah FA yang ditunjukkan, dan [32P ] ] Pelepasan pi diukur. Kiri, uji dengan ribosom E. coli 70S; benar, uji dengan ribosom
55S mitokondria. Jumlah Pi yang dilepaskan pada 0 mM FA setara dengan 1.400 pmol (E. coli EF-G), 650 pmol (EF-G1mt), dan 170 pmol (EF-G2mt)
pada ribosom 70S, dan 4.300 pmol (EF-G1mt) dan 1.600 pmol (EF-G2mt) pada ribosom 55S. Perhatikan bahwa aktivitas GTPase E. coli EF-G tidak
terdeteksi pada ribosom 55S. (B) Pengaruh FA pada sintesis peptida 3xFLAG (atas). Peptida 3xFLAG disintesis seperti pada Gambar 3B, dengan
adanya jumlah FA yang ditunjukkan. Setelah reaksi translasi 120 menit, sampel diperlakukan dengan RNase A dan diselesaikan dengan Tricine SDS-
PAGE (kiri atas), dan jumlah peptida 3xFLAG yang disintesis diplot (kanan atas). Bilah kesalahan mewakili deviasi standar dari tiga percobaan independen.
Pengaruh FA pada sintesis nLuc dengan sistem terjemahan E. coli (PURE frex ver. 2.0) juga dianalisis untuk referensi (lebih rendah). Deviasi standar
dari tiga percobaan independen tidak melebihi 0,3%.
Machine Translated by Google

D
Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1 379

terhentinya ribosom yang dimediasi poliprolin

(51).
Berbeda sekali dengan pengamatan dalam sistem translasi ragi,
sistem translasi mitokondria mengungkapkan bahwa poliprolin
menahan translasi, bahkan dalam kondisi dengan Mg2+ tinggi
(Gambar 5D). Apalagi kami menemukan
bahwa peptidilpoliprolin-tRNA pada ribosom 55S yang terhenti
terhidrolisis sebagian, dan peptida yang baru lahir
dirilis (Gambar Tambahan S6). Seperti yang kami amati
pelepasan peptida independen RF-1Lmt pada kodon stop
(Gambar Tambahan S3), pelepasan peptida prematur tersebut
bisa juga terjadi di sistem kita, ketika situs ribosom A kosong untuk
waktu yang lama. Faktor yang bertanggung jawab
pelepasan peptida belum dapat diidentifikasi. Di sini, kami akan melakukannya
ingin mencatat pengamatan kami dalam sistem terjemahan ragi in
vitro yang dilarutkan: (i) ribo- yang dimediasi poliprolin
hat
d
Gambar 5. Ribosom yang dimediasi poliprolin terhenti dalam sistem translasi mitokondria mamalia yang dibentuk kembali. (A) Skema mRNA
digunakan dalam reaksi. Motif poliprolin (Pro x4 atau Pro x12) disisipkan di depan wilayah pengkodean nLuc. (B) Reaksi translasi dilakukan
menggunakan campuran aminoasil-tRNA ragi berlabel metionin dan [35S] yang ditunjukkan, dengan 7 mM Mg2+. Setelah reaksi translasi dilakukan untuk
periode waktu yang ditunjukkan, alikuot menjadi sasaran uji nLuc (kiri). Aktivitas nLuc pada titik reaksi 120 menit diplot (kanan). Kesalahan
batang mewakili deviasi standar dari tiga percobaan independen. (C) Reaksi translasi dilakukan seperti pada (B). Setelah reaksi 120 menit,
sampel diperlakukan dengan RNase A dan dikenakan Tricine SDS-PAGE. Panah hitam, produk terjemahan lengkap; mata panah putih, kios
produk. (D) Reaksi translasi dilakukan seperti pada (B), tetapi dengan konsentrasi Mg2+ yang ditunjukkan . Aktivitas nLuc pada 120 menit diplot.
Bilah kesalahan mewakili deviasi standar dari tiga percobaan independen.

Urutan peptidilpoliprolin-tRNA teratasi, sehingga mengurangi
beberapa penghentian tidak disertai dengan pelepasan peptida, dan
peptidylpolyproline-tRNA pada ribosom 80S yang terhenti
hampir tidak terhidrolisis (51). (ii) Ribosom terhenti di CGA
pengulangan kodon dikaitkan dengan pelepasan peptida, yaitu
terminasi dini (51). Pengulangan kodon CGA pada mRNA yang
diterjemahkan diketahui menyebabkan terhentinya ribosom
konformasi mRNA yang tidak kompatibel dengan decoding
situs A (80). Mengingat pengamatan ini, hal ini mungkin terjadi
bahwa penangkapan translasi yang dimediasi poliprolin oleh
mitoribo-some adalah hasil gabungan dari gangguan transfer peptidil
reaksi akibat kelainan peptidilpoliprolin-tRNA,
dan gangguan decoding di situs A karena, misalnya,
struktur mRNA yang tidak biasa. Misalnya saja sebagai Mg2+
konsentrasi meningkat dalam reaksi, gangguan
peptidylpolyproline-tRNA mungkin teratasi sebagian, namun
terminasi dini terjadi karena decoding yang terhambat. Analisis
struktural dari mitori- yang terhenti poliprolin
Machine Translated by Google
380 Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1
kompleks rantai payudara yang baru lahir akan memperjelas
mekanisme yang mendasari dan memberikan wawasan untuk
reaksi transfer peptidil oleh mitoribosom, dan pada akhirnya
terowongan keluar polipep-tide (PET) dari mitoribosom akan
divisualisasikan. Penelitian di masa depan yang menggunakan
tRNA mitokondria, termasuk mt-tRNASer (AGY), dalam sistem
translasi mitokondria ini akan menjadi penting untuk
pemahaman yang lebih tepat tentang reaksi transfer peptida,
serta reaksi pelepasan peptida pada mitoribosom; mekanisme
unik dari penghentian ribosom yang dimediasi poliprolin dan
pelepasan protein yang diamati dalam penelitian ini mungkin
disebabkan oleh penggunaan sistem tRNA ragi heterolog.
Dalam kombinasi dengan aktivator translasi, faktor perakitan,
dan mesin penyisipan membran ko-translasi, seperti
proteoliposom di mana reseptor membran mitoribosom
terintegrasi, sistem translasi mitokondria yang dikembangkan
akan memimpin jalan untuk memahami mekanisme translasi.
dalam mitokondria mamalia.
DATA PELENGKAP
Data pelengkap tersedia di NAR Online.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami berterima kasih kepada Prof. Kimitsuna Watanabe dan
Dr Chie Take-moto atas materinya (vektor ekspresi IF-2mt, EF-
Tumt dan EF-Tsmt) dan diskusi berharga sejak awal proyek.
Kami juga ingin mengucapkan terima kasih kepada seluruh
anggota laboratorium atas dukungannya yang murah hati.
PENDANAAN
Hibah Bantuan Penelitian Ilmiah MEXT/JSPS [18K06054];
Yayasan Naito (ke NT). Pendanaan untuk biaya akses terbuka:
MEXT/JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research [18K06054].
Pernyataan konflik kepentingan. Tidak ada yang diumumkan.
REFERENSI
1. Christian,BE dan Spremulli,LL (2012) Mekanisme protein
biosintesis pada mitokondria mamalia. Biokimia. Biofisika. Akta, 1819, 1035–
1054.
2. Hallberg,BM dan Larsson,NG (2014) Membuat protein di
gardu listrik. Metab Sel, 20, 226–240.
3.Suzuki,T., Nagao,A. dan Suzuki,T. (2011) Mitokondria manusia
tRNA: biogenesis, fungsi, aspek struktural, dan penyakit. Ann.
Pendeta Genet., 45, 299–329.
4. Van Haute,L., Pearce,SF, Powell,CA, D'Souza,AR, Nicholls,TJ dan Minczuk,M.
(2015) Pematangan transkrip mitokondria dan gangguannya. J.Mewarisi. Metab.
Dis., 38, 655–680.
5. Selimoglu,E. (2007) Ototoksisitas yang diinduksi aminoglikosida. Saat ini.
farmasi. Des., 13, 119–126.
6. Soriano,A., Miro,O. dan Mensa,J. (2005) Toksisitas mitokondria terkait
dengan linezolid. N.Inggris. J.Med., 353, 2305–2306.
7. O'Brien,TW (1971) Kejadian umum ribosom 55 S di mitokondria hati
mamalia. J.Biol. Kimia, 246, 3409–3417.
8. Pietromonaco,SF, Denslow,ND dan O'Brien,TW (1991) Protein ribosom
mitokondria mamalia. Biokimia, 73, 827–835.
9. Brown,A., Amunts,A., Bai,XC, Sugimoto,Y., Edwards,PC, Murshudov,G.,
Scheres,SHW dan Ramakrishnan,V. (2014)
Struktur subunit ribosom besar dari mitokondria manusia.
Sains, 346, 718–722.
D
hat
d
10. Rorbach,J., Gao,F., Powell,CA, D'Souza,A., Lightowlers,RN, Minczuk,M.
dan Chrzanowska-Lightowlers,ZM (2016) Ribosom mitokondria manusia
dapat mengubah komposisi RNA strukturalnya. Proses. Natal.
Akademik. Sains. AS, 113, 12198–12201.
11. Goldschmidt-Reisin,S., Kitakawa,M., Herfurth,E.,
Wittmann-Liebold,B., Grohmann,L. dan Graack, HR (1998)
Protein ribosom mitokondria mamalia. Urutan asam amino terminal-N,
karakterisasi, dan identifikasi urutan gen yang sesuai. J.Biol.
Kimia, 273, 34828–34836.
12. Graack,HR, Bryant,ML dan O'Brien,TW (1999) Identifikasi protein ribosom
mitokondria mamalia (MRPs) dengan sekuensing N-terminal dari
MRP sapi yang dimurnikan dan perbandingan dengan sekuens bank data:
partikel subribosom besar. Biokimia, 38, 16569–16577.
13. Cavdar Koc,E., Blackburn,K., Burkhart,W. dan Spremulli, LL
(1999) Identifikasi homolog mitokondria mamalia dari protein ribosom S7.
Biokimia. Biofisika. Res. Kommun., 266,
141–146.
14. Koc,EC, Burkhart,W., Blackburn,K., Moseley,A., Koc,H. Dan
Spremulli, LL (2000) Pendekatan proteomik untuk identifikasi protein ribosom
subunit kecil mitokondria mamalia. J.Biol.
Kimia, 275, 32585–32591.
15. Koc,EC, Burkhart,W., Blackburn,K., Koc,H., Moseley,A. Dan
Spremulli,LL (2001) Identifikasi empat protein dari subunit kecil ribosom
mitokondria mamalia menggunakan pendekatan proteomik. Ilmu
Protein, 10, 471–481.
16. Koc,EC, Burkhart,W., Blackburn,K., Moyer,MB, Schlatzer,DM, Moseley,A. dan
Spremulli,LL (2001) Subunit besar ribosom mitokondria mamalia. Analisis
komplemen protein ribosom yang ada. J.Biol. Kimia, 276, 43958–43969.
17. Suzuki,T., Terasaki,M., Takemoto-Hori,C., Hanada,T., Ueda,T., Wada,A.
dan Watanabe,K. (2001) Analisis protein ribosom mitokondria
mamalia. Identifikasi komponen protein pada subunit kecil 28 S. J.Biol.
Kimia, 276, 33181–33195.
18. Suzuki,T., Terasaki,M., Takemoto-Hori,C., Hanada,T., Ueda,T.,
Wada, A. dan Watanabe,K. (2001) Kompensasi struktural untuk defisit rRNA
dengan protein di ribosom mitokondria mamalia. Analisis sistematis
komponen protein subunit ribosom besar dari mitokondria mamalia. J.Biol.
Kimia, 276, 21724–21736.
19. Amunts,A., Brown,A., Toots,J., Scheres,SHW dan
Ramakrishnan,V. (2015) Ribosom. Struktur ribosom mitokondria manusia.
Sains, 348, 95–98.
20. Greber,BJ, Boehringer,D., Leitner,A., Bieri,P., Voigts-Hoffmann,F., Erzberger,JP,
Leibundgut,M., Aebersold,R. dan Ban,N. (2014)
Arsitektur subunit besar ribosom mitokondria mamalia. Alam, 505, 515–519.
21. Greber,BJ, Boehringer,D., Leibundgut,M., Bieri,P., Leitner,A.,
Schmitz, N., Aebersold, R. dan Ban,N. (2014) Struktur lengkap subunit besar
ribosom mitokondria mamalia.
Alam, 515, 283–286.
22. Greber,BJ, Bieri,P., Leibundgut,M., Leitner,A., Aebersold,R.,
Boehringer,D. dan Ban,N. (2015) Ribosom. Struktur lengkap ribosom
mitokondria mamalia 55S. Sains, 348, 303–308.
23. Kaushal,PS, Sharma,MR, Booth,TM, Haque,EM, Tung,CS, Sanbonmatsu,KY,
Spremulli,LL dan Agrawal,RK (2014)
Struktur Cryo-EM dari subunit kecil ribosom mitokondria mamalia.
Proses. Natal. Akademik. Sains. AS, 111, 7284–7289.
24. Sharma,MR, Koc,EC, Datta,PP, Booth,TM, Spremulli,LL dan Agrawal,RK (2003)
Struktur ribosom mitokondria mamalia mengungkapkan peran fungsional
yang diperluas untuk komponen proteinnya. Sel, 115, 97–108.
25. Pfeffer,S., Woellhaf,MW, Herrmann,JM dan Forster,F. (2015)
Organisasi mesin penerjemahan mitokondria dipelajari in situ dengan tomografi
krioelektron. Nat. Kom., 6, 6019.
26. Kummer,E., Leibundgut,M., Rackham,O., Lee,RG, Boehringer,D., Filipovska,A.
dan Ban,N. (2018) Fitur unik inisiasi terjemahan mitokondria mamalia
diungkapkan oleh cryo-EM. Alam, 560, 263–267.
27. Grasso,DG, Christian,BE, Spencer,A. dan Spremulli, LL (2007)
Ekspresi berlebihan dan pemurnian mitokondria mamalia
Machine Translated by Google
faktor inisiasi translasi 2 dan faktor inisiasi 3. Metode Enzimol., 430, 59–
78.
28. Christian,BE dan Spremulli,LL (2010) Pemilihan preferensi kodon start 5
terminal pada mRNA tanpa pemimpin oleh ribosom mitokondria
mamalia. J.Biol. Kimia, 285, 28379–28386.
29. Khawaja,A., Itoh,Y., Remes,C., Spahr,H., Yukhnovets,O., Hofig,H., Amunts,A.
dan Rorbach, J. (2020) Langkah-langkah pra-inisiasi yang berbeda dalam
terjemahan mitokondria manusia. Nat. Komuni., 11, 2932.
30. Christian,BE dan Spremulli,LL (2009) Bukti peran aktif IF3mt dalam inisiasi
penerjemahan di mitokondria mamalia.
Biokimia, 48, 3269–3278.
31. Gaur,R., Grasso,D., Datta,PP, Krishna,PD, Das,G., Spencer,A., Agrawal,RK,
Spremulli,L. dan Varshney, U. (2008) Faktor inisiasi translasi
mitokondria mamalia tunggal secara fungsional menggantikan dua faktor
bakteri. mol. Sel, 29, 180–190.
32. Yassin,AS, Haque,ME, Datta,PP, Elmore,K., Banavali,NK, Spremulli,LL
dan Agrawal,RK (2011) Domain penyisipan dalam faktor inisiasi translasi
mitokondria mamalia 2 berperan sebagai faktor inisiasi eubakteri 1 .Proc .
Natal. Akademik. Sains. AS, 108, 3918–3923.
33. Montoya,J., Ojala,D. dan Attardi,G. (1981) Ciri khas dari urutan 5 terminal mRNA
mitokondria manusia. Alam, 290, 465–470.
34. Schwartzbach,CJ, Farwell,M., Liao,HX dan Spremulli,LL (1996)
Faktor inisiasi dan pemanjangan mitokondria sapi. Metode Enzimol., 264,
248–261.
35. Tsuboi,M., Morita,H., Nozaki,Y., Akama,K., Ueda,T., Ito,K., Nierhaus,KH
dan Takeuchi,N. (2009) EF-G2mt adalah faktor daur ulang eksklusif
dalam sintesis protein mitokondria mamalia. mol.
Sel, 35, 502–510.
36. Hanada,T., Suzuki,T., Yokogawa,T., Takemoto-Hori,C., Sprinzl,M. dan
Watanabe,K. (2001) Kemampuan penerjemahan tRNAsSer
mitokondria dengan struktur sekunder yang tidak biasa dalam
sistem terjemahan in vitro mitokondria sapi. Sel Gen, 6, 1019–1030.
37. Takemoto,C., Spremulli,LL, Benkowski,LA, Ueda,T.,
Yokogawa,T. dan Watanabe,K. (2009) Penguraian kodon AUA yang tidak
konvensional sebagai metionin oleh tRNAMet mitokondria dengan antikodon
f5CAU seperti yang diungkapkan dengan sistem terjemahan in vitro
mitokondria. Res Asam Nukleat, 37, 1616–1627.
38. Soleimanpour-Lichaei,HR, Kuhl,I., Gaisne,M., Passos,JF, Wydro,M.,
Rorbach,J., Temperley,R., Bonnefoy,N., Tate,W., Lightowlers,R . dkk.
(2007) mtRF1a adalah faktor pelepasan terjemahan mitokondria
manusia yang menguraikan kodon terminasi utama UAA dan UAG. mol.
Sel, 27, 745–757.
39. Richter,R., Rorbach,J., Pajak,A., Smith,PM, Wessels,HJ, Huynen,MA,
Smeitink,JA, Lightowlers,RN dan Chrzanowska-
Lightowlers,ZM (2010) Peptidyl-tRNA fungsional hidrolase, ICT1, telah direkrut
ke dalam ribosom mitokondria manusia. EMBO J., 29, 1116–1125.
40. Akabane,S., Ueda,T., Nierhaus,KH dan Takeuchi,N. (2014)
Penyelamatan ribosom dan penghentian translasi pada kodon stop non-
standar oleh ICT1 di mitokondria mamalia. PLos Genet., 10, e1004616.
41. Burroughs,AM dan Aravind,L. (2019) Asal usul dan evolusi faktor pelepasan:
implikasi terhadap penghentian penerjemahan, penyelamatan ribosom,
dan jalur kendali mutu. Int. J.Mol. Sains, 20, 1981.
42. Spremulli,LL (2007) Isolasi ribosom mitokondria skala besar dari
jaringan mamalia. Metode Mol. Biol., 372, 265–275.
43. Abe,T., Nagai,R., Imataka,H. dan Takeuchi-Tomita,N. (2020)
Rekonstitusi pemanjangan dan penghentian translasi ragi secara in vitro
menggunakan mRNA yang mengandung CrPV IRES. J. Biokimia., 167,
441–450.
44. Liao,HX dan Spremulli,LL (1990) Identifikasi dan karakterisasi awal
faktor inisiasi translasi 2 dari mitokondria sapi. J.Biol. Kimia, 265, 13618–
13622.
45. Liao,HX dan Spremulli,LL (1991) Inisiasi sintesis protein pada mitokondria
hewan. Pemurnian dan karakterisasi faktor inisiasi translasi 2. J.
Biol. Kimia, 266, 20714–20719.
46. Shimizu,Y., Inoue,A., Tomari,Y., Suzuki,T., Yokogawa,T.,
Nishikawa,K. dan Ueda,T. (2001) Terjemahan bebas sel disusun kembali
dengan komponen yang dimurnikan. Nat. Bioteknologi., 19, 751–755.
47. Richter-Dennerlein,R., Oeljeklaus,S., Lorenzi,I., Ronsor,C.,
Bareth,B., Schendzielorz,AB, Wang,C., Warscheid,B., Rehling,P.
D
Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1 381
hat
d
dan Dennerlein, S. (2016) Sintesis protein mitokondria beradaptasi dengan
masuknya protein berkode nuklir. Sel, 167, 471–483.
48. Fox,TD (2012) Sintesis protein mitokondria, impor, dan
perakitan. Genetika, 192, 1203–1234.
49. Zhang,X., Zuo,X., Yang,B., Li,Z., Xue,Y., Zhou,Y., Huang,J.,
Zhao,X., Zhou,J., Yan,Y. dkk. (2014) MicroRNA secara langsung meningkatkan
terjemahan mitokondria selama diferensiasi otot. Sel, 158, 607–619.
50. Akama,K., Christian,BE, Jones,CN, Ueda,T., Takeuchi,N. dan Spremulli,
LL (2010) Analisis konsekuensi fungsional dari mutasi mematikan pada
faktor pemanjangan translasi mitokondria.
Biokimia. Biofisika. Akta, 1802, 692–698.
51. Abe,T., Nagai,R., Shimazaki,S., Kondo,S., Nishimura,S.,
Sakaguchi,Y., Suzuki,T., Imataka,H., Tomita,K. dan Takeuchi-
Tomita,N. (2020) Sistem terjemahan ragi in vitro yang dilarutkan
mengungkapkan fungsi eIF5A untuk sintesis polipeptida panjang. J.
Biokimia., 167, 451–462.
52. Liao,HX dan Spremulli,LL (1990) Pengaruh panjang dan struktur sekunder
mRNA pada interaksi ribosom mitokondria sapi dengan messenger
RNA. J.Biol. Kimia, 265, 11761–11765.
53. Chung,HK dan Spremulli,LL (1990) Pemurnian dan karakterisasi
faktor pemanjangan G dari mitokondria hati sapi. J.Biol. Kimia,
265, 21000–21004.
54. Bhargava,K., Templeton,P. dan Spremulli,LL (2004) Ekspresi dan karakterisasi
isoform 1 faktor pemanjangan mitokondria manusia G. Protein Expr. Purif.,
37, 368–376.
55. Zhang,L., Ging,NC, Komoda,T., Hanada,T., Suzuki,T. dan Watanabe,K.
(2005) Kerentanan antibiotik terhadap terjemahan mitokondria
mamalia. FEBS Lett., 579, 6423–6427.
56. Gao,YG, Selmer,M., Dunham,CM, Weixlbaumer,A., Kelley,AC dan
Ramakrishnan,V. (2009) Struktur ribosom dengan faktor pemanjangan G
terperangkap dalam keadaan pascatranslokasi. Sains, 326, 694–699.
57. Savelsbergh,A., Matassova,NB, Rodnina,MV dan Wintermeyer,W.
(2000) Peran domain 4 dan 5 dalam fungsi faktor pemanjangan G pada
ribosom. J.Mol. Biol., 300, 951–961.
58. Seo,HS, Abedin,S., Kamp,D., Wilson,DN, Nierhaus,KH dan
Cooperman,BS (2006) GTPase yang bergantung pada EF-G pada ribosom.
perubahan konformasi dan penghambatan asam fusidat. Biokimia, 45, 2504–
2514.
59. Bodley,JW, Zieve,FJ, Lin,L. dan Zieve, ST (1969) Pembentukan kompleks faktor
ribosom-G-PDB dengan adanya asam fusidat.
Biokimia. Biofisika. Res. Komuni., 37, 437–443.
60. Johanson,U., Aevarsson,A., Liljas,A. dan Hughes,D. (1996) Struktur
dinamis EF-G dipelajari dengan ketahanan asam fusidat dan revertan
internal. J.Mol. Biol., 258, 420–432.
61. Lee-Huang,S., Lee,H. dan Ochoa, S. (1974) Penghambatan inisiasi rantai
polipeptida pada Escherichia coli oleh faktor pemanjangan G. Proc. Natal.
Akademik. Sains. AS, 71, 2928–2931.
62. Tanaka,N., Kinoshita,T. dan Masukawa,H. (1968) Mekanisme penghambatan
sintesis protein oleh asam fusidat dan antibiotik terkait.
Biokimia. Biofisika. Res. Kommun., 30, 278–283.
63. Hirashima,A. dan Kaji, A. (1973) Peran faktor pemanjangan G dan a
faktor protein pada pelepasan ribosom dari asam ribonukleat pembawa pesan.
J.Biol. Kimia, 248, 7580–7587.
64. Hirokawa,G., Kiel,MC, Muto,A., Selmer,M., Raj,VS, Liljas,A., Igarashi,K.,
Kaji,H. dan Kaji, A. (2002) Pembongkaran kompleks pasca-terminasi
dengan faktor daur ulang ribosom, sebuah tiruan tRNA yang fungsional.
EMBO J., 21, 2272–2281.
65. Savelsbergh,A., Rodnina,MV dan Wintermeyer,W. (2009) Fungsi berbeda
dari faktor pemanjangan G dalam daur ulang dan translokasi
ribosom. RNA, 15, 772–780.
66. Kummer,E. dan Ban,N. (2020) Wawasan struktural tentang pemanjangan
translasi mitokondria mamalia yang dikatalisis oleh mtEFG1. EMBO J., 39,
e104820.
67. Doerfel,LK, Wohlgemuth,I., Kothe,C., Peske,F., Urlaub,H. Dan
Rodnina,MV (2013) EF-P sangat penting untuk sintesis cepat protein yang
mengandung residu prolin berturut-turut. Sains, 339, 85–88.
68. Ude,S., Lassak,J., Starosta,AL, Kraxenberger,T., Wilson,DN dan Jung,K.
(2013) Faktor pemanjangan terjemahan EF-P mengurangi terhentinya
ribosom pada peregangan poliprolin. Sains, 339, 82–85.
69. Gutierrez,E., Shin,BS, Woolstenhulme,CJ, Kim,JR, Saini,P.,
Buskirk,AR dan Dever,TE (2013) eIF5A mempromosikan terjemahan motif
poliprolin. mol. Sel, 51, 35–45.
Machine Translated by Google
382 Penelitian Asam Nukleat, 2021, Vol. 49, No.1
70. Schuller,AP, Wu,CC, Dever,TE, Buskirk,AR dan Green,R. (2017)
eIF5A berfungsi secara global dalam pemanjangan dan
terminasi terjemahan. mol. Sel, 66, 194–205.
71. Davies,SM, Rackham,O., Shearwood,AM, Hamilton,KL,
Narsai,R., Whelan,J. dan Filipovska, A. (2009) Protein domain
berulang pentatricopeptida 3 berasosiasi dengan subunit ribosom
kecil mitokondria dan mengatur translasi. FEBS Lett., 583,
1853–1858.
72. Borna,NN, Kishita,Y., Kohda,M., Lim,SC, Shimura,M., Wu,Y.,
Mogushi,K., Yatsuka,Y., Harashima,H., Hisatomi,Y. dkk. (2019)
Mutasi PTCD3 protein ribosom mitokondria menyebabkan cacat
fosforilasi oksidatif dengan sindrom Leigh. Neurogenetika, 20, 9–
25.
73. Boni,IV, Isaeva,DM, Musychenko,ML dan Tzareva,NV (1991)
Pengakuan ribosom-messenger: situs target mRNA untuk protein
ribosom S1. Res Asam Nukleat, 19, 155–162.
74. Tedin,K., Resch,A. dan Blasi,U. (1997) Persyaratan protein ribosom
S1 untuk inisiasi translasi mRNA dengan dan tanpa urutan 5 pemimpin.
mol. Mikrobiol., 25, 189–199.
D
hat
d
75. Moll,I., Hirokawa,G., Kiel,MC, Kaji,A. dan Blasi,U. (2004)
Inisiasi penerjemahan dengan ribosom 70S: jalur alternatif untuk mRNA
tanpa pemimpin. Res Asam Nukleat, 32, 3354–3363.
76. Qi,H., Shimizu,Y. dan Ueda,T. (2007) Protein ribosom S1 tidak
penting untuk mesin trans-translasi. J.Mol. Biol., 368, 845–852.
77. Siira,SJ, Spahr,H., Shearwood,AJ, Ruzzenente,B., Larsson,NG,
Rakham, O. dan Filipovska, A. (2017) pelipatan transkriptom mitokondria
yang dimediasi oleh LRPPRC. Nat. Komunitas, 8, 1532.
78. Aibara,S., Singh,V., Modelska,A. dan Amunt, A. (2020) Dasar
struktural terjemahan mitokondria. Elife, 9, e58362.
79. Chadani,Y., Niwa,T., Izumi,T., Sugata,N., Nagao,A., Suzuki,T.,
Chiba,S., Ito,K. dan Taguchi, H. (2017) Destabilisasi ribosom
intrinsik mendasari penerjemahan dan memberi organisme strategi
penginderaan lingkungan. mol. Sel, 68, 528–539.
80. Tesina,P., Lessen,LN, Buschauer,R., Cheng,J., Wu,CC,
Berninghausen,O., Buskirk,AR, Becker,T., Beckmann,R. dan
Hijau, R. (2019) Mekanisme molekuler penghentian translasi oleh
kombinasi kodon penghambat dan saluran poli(A). EMBO J., 39,
e103365.