EFEK PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL BIJI

LABU KABOCHA KUNING (Cucurbita pepo)

TERHADAP AKTIVITAS 5α-REDUCTASE 2
DAN FAKTOR FERTILITAS MENCIT JANTAN
Mus musculus GALUR BALB/C

Hani Solihah
Magister Biologi – 20619014
Dosen Pembimbing: Dr. Ahmad Ridwan

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati

Institut Teknologi Bandung
 DAFTAR ISI

01 Pendahuluan 02 Metode Penelitian

03 Hasil dan Pembahasan 04 Kesimpulan

01. Pendahuluan
Latar Belakang

(Robitaille dkk., 2020)

Dalam kondisi in vivo pada jaringan target, testosteron secara irreversibel dikatalisis menjadi
dihidrotestosteron (DHT) oleh enzim 5-alpha reductase 2 (5AR-2) (National Center for Biotechnology
Information, 2022)
 Latar Belakang
• Cucurbita diketahui kaya akan senyawa
fitosterol seperti brassicasterol, Δ5-, Δ7-
and Δ8-sterol, asam linoleate, asam oleat,
asam palmitat, asam stearat, karotenoid,
dan vitamin yang larut dalam lemak
(Damiano dkk., 2016)
• Terdapat penelitian yang menyebutkan
bahwa fitosterol pada Cucurbita pepo
efektif dalam menghambat perkembangan
kanker prostat dengan menghambat
aktivitas aromatase (5AR-2) (Kang dkk.,
2021)

(Kang dkk., 2021)

Latar Belakang

• Hingga saat ini belum banyak penelitian

yang melaporkan bagaimana pengaruh
pemberian ekstrak Cucurbita pepo sebagai
inhibitor 5AR-2 terhadap faktor fertilitas.

Pengaruh pemberian ekstrak etanol biji Cucurbita

pepo terhadap aktivitas 5AR-2 serta kaitannya dengan
faktor fertilitas pada mencit jantan galur Balb/C

(Wilson dkk., 1993)

Tujuan Penelitian

1.
Mengetahui kandungan fitokimia
ekstrak etanol biji labu kabocha
kuning (Cucurbita pepo).
2.
Mengetahui toksisitas dan nilai
LD50 ekstrak etanol biji labu
kabocha kuning (Cucurbita pepo).
3.
Mengetahui pengaruh ekstrak
etanol biji labu kabocha kuning
(Cucurbita pepo) terhadap
aktivitas 5AR-2 mencit jantan
BALB/c.

4.
Mengetahui pengaruh ekstrak
etanol biji labu kabocha kuning
(Cucurbita pepo) terhadap kadar
testosterone serum mencit
jantan BALB/c.
5.
Mengetahui pengaruh ekstrak etanol
biji labu kabocha kuning (Cucurbita
pepo) terhadap nilai GSI, konsentrasi,
motilitas, dan viabilitas sperma
mencit jantan BALB/c.
02. METODE
PENELITIAN
 Waktu dan • Laboratorium Analisis Bahan Alam, ITB dan UPI
Tempat • Laboratorium Fisiologi Hewan, ITB
Penelitian • Laboratorium Instrumentasi III, ITB
• Laboratorium Perkembangan Hewan, ITB
• Laboratorium Instruksional Barat, ITB
• Kandang VI, ITB
• Waktu Penelitian November 2020-Juni 2022 Subjek
Uji
• Subjek uji: mencit (Mus musculus) galur BALB/c jantan berumur 2-3 bulan (n=32, massa tubuh 33-35 g)
• Luas kandang 77,4 cm2 dan tinggi 12,7 cm
• Suhu ruangan kandang 24° ± 1° C, penerangan 12 jam terang 12 jam gelap
• Hewan diberi pakan ad libitum dan air minum
• Serbuk kayu kandang diganti secara rutin setiap 3 hari sekali.

Alat
Timbangan analitik, alat gelas, botol maserasi, rotary
evaporator, soxhlet, kertas saring, timbangan hewan,
sonde, syring, alat bedah minor, hemasitometer
Neubaeur, hand counter, kaca objek, cover glass,
mikropipet, centrifuge, mikroskop cahaya, water bath,
incubator, microplate reader, alat HPLC, alat GC-MS.
Bahan
Ekstrak etanol biji C. pepo, akuades, kit ELISA
testosteron, NaCl fisiologis, etanol 96%, pewarna eosin,
alkohol, PBS, pereaksi Meyer dan Wagner, Fe𝐂𝐥𝟑,
𝐇𝟐𝐒𝐎𝟒, kloroform, ammonia, asam asetat anhidrat, RIPA
buffer, methanol HPLC grade, dichloromethane, NADPH,
testosteron untuk substrat HPLC, deion, BCA buffer.
 Metode Penelitian
Pengukuran nilai GSI,
Ekstraksi dan
Aklimatisasi dan konsentrasi, motilitas, dan
Analisis Fitokimia
Perlakuan viabilitas sperma

01 02 03 04 05 06

Uji Toksisitas Pengukuran Kadar Uji Aktivitas 5AR-2

Testosteron Serum dengan HPLC
 Ekstraksi dengan Metode Soxhletasi
Filtrat dievavorasi
Biji C. pepo dikering Seluruh bagian biji Tepung simplisia
menggunakan rotary
anginkan di tempat digiling sampai disaring dan
evavorator pada suhu 60℃
teduh (tidak terkena halus hingga diekstraksi dengan
dan putaran 55 rpm sehingga
sinar matahari berbentuk tepung etanol 96% dengan
dihasilkan ekstrak kental biji
langsung). halus metode soxhletasi
labu kabocha kuning.
 Analisis Fitokimia Ekstrak Cucirbita pepo
Analisis
Fitokimia

Kualitatif Kuantitatif

Uji Steroid Uji Uji

Uji Uji Tanin GC-MS
Uji Fenolik Alkaloid Flavonoidv
Terpenoid
 Uji Toksisitas Akut Oral
Pengujian toksisitas akut oral menggunakan metode Acute Toxic Class
sesuai dengan pedoman pengujian pada The Organisation for
Economic Co-operation and Development (OECD) 423 (OECD, 2001). Tabel 1. Kriteria Penggolongan Sediaan Uji

Tingkat
Nilai LD50 Klasifikasi
Toksisitas
1 ≤ 5 mg/kg Super Toksik
2 5-50 mg Sangat
Toksik
3 >50-500 mg Toksik
4 >500-2000 mg Toksik
Sedang
5 >2000-5000 Toksik
mg Ringan
6 >5000 mg Tidak Toksik
(Hodge dan Sterner (1995) dalam BPOM, 2020)

Gambar 1. Bagan uji dengan starting dose 300 mg/kg bobot badan pada
uji Acute Toxic Class Method (OECD, 2001).
 Aklimatisasi dan Perlakuan
Mencit dibagi ke dalam 3 kelompok. Kelompok
Mencit BALB/c jantan berumur 2- I (kontrol diberi larutan CMC 10%), kelompok
3 bulan diaklimatiasasi selama 7 II (diberi ekstrak dengan dosis 200 mg/kgBB ),
hari di kandang dengan suhu Kelompok III (diberi ekstrak dengan dosis 600
24±1°C. Mencit diberikan pakan mg/kgBB)
ad libitum dan air.
*Ekstrak dilarutkan dalam larutan CMC 10%
 Pengukuran Aktivitas 5-Alpha Reductase 2
Sampel diinkubasi pada suhu
Larutan reaksi disiapkan Reaksi diinisiasi dengan 37℃ selama 30 menit.
dengan menambahkan ditambahkannya 33 µl NADPH Kemudian reaksi dihentikan
0,02 mM phosphate buffer 0,77 mg/ml yang dilarutkan dengan menambahkan pelarut
(pH 6,5), 0,56x10−8 M dalam phosphate buffer. Volume organic diklorometan sebanyak
testosterone, dan 65,51µg total larutan reaksi dibuat 333,33 µl.
sampel ekstrak prostat. sebanyak 200 µl.

Kadar substrat (testosteron) Fasa organik diambil kemudian

yang tersisa dalam larutan dievaporasi pada suhu 37℃ Sampel divorteks selama 60
dianalisis menggunakan HPLC hingga kering, lalu ditambahkan detik, kemudian disentrifugasi
dengan column C18, fasa gerak methanol HPLC grade 400 x g selama 10 menit
20:80 (air:metanol), dengan flow sebanyak 333,33 µl.
rate 1 ml/menit dan absorbansi
detektor pada panjang
gelombang 240 nm

* Ulangi prosedur diatas namun tanpa diinkubasi untuk membuat larutan tanpa reaksi enzimatis
 Pengukuran Aktivitas 5-Alpha Reductase 2

Aktivitas Enzim 5-alpha Reductase 2 dihitung dengan persamaan sebagai berikut:

𝑢𝑛𝑖𝑡 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 − 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 𝑥 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑅𝑒𝑎𝑘𝑠𝑖
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚 =
µ𝑔 𝑀𝑟 𝑆𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑥 𝑊𝑎𝑘𝑡𝑢 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑥 mg 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚
Pengukuran Testosteron Serum

(Crowther, 2000)
Dokumentasi Pengukuran Testosteron Serum dengan Metode
Competitive ELISA
Pengukuran Gonadosomatic Index
Mencit ditimbang Bobot prostat dan vesikula seminalis
kemudian dikorbankan dibandingkan dengan bobot badan
untuk isolasi organ mencit setelah perlakuan untuk
prostat dan vesikula mendapatkan Gonadosomatic Index
seminalis (GSI)

Gonadosomatic Index diukur dengan rumus sebagai berikut:

GSI = [Gonad weight × 𝑩𝒐𝒅𝒚 𝒘𝒆𝒊𝒈𝒉𝒕−𝟏] × 100%

 Menghitung Motilitas Spermatozoa
1 tetes suspensi homogen cairan
Sperma yang diperoleh epididimis dan larutan fisiologis
dari cacahan kauda digunakan untuk menghitung
epididimis dimasukkan ke motilitas sperma dengan
dalam cawan petri yang merekam pergerakan sperma
telah berisi larutan selama 12 detik menggunakan
fisiologis (NaCl 0,9%). mikroskop cahaya perbesaran
400 x
Motilitas spermatozoa dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Kategori A + Kategori B
% Motilitas =
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑆𝑝𝑒𝑟𝑚𝑎
Pergerakan sperma pada 10 lapang
pandang diamati dan dihitung
berdasarkan kategori: A (Progresif:
bergerak sedang, berputar, bergerak
lurus); B (Non progresif: bergerak
lambat atau gerak ditempat); dan C
(Tidak bergerak)
x 100%
 Menghitung Viabilitas Spermatozoa

Sperma yang diperoleh dari
cacahan kauda epididimis
dimasukkan ke dalam
cawan petri yang telah berisi
apusan sperma dengan pewarna
larutan fisiologis (NaCl
0,9%).
Suspensi homogen dari cairan Pengamatan viabilitas dilakukan dengan
epididimis dan larutan fisiologis mikroskop cahaya perbesaran 400 kali
terhadap 10 lapang pandang untuk setiap
digunakan untuk membuat
pengulangan. Spermatozoa yang
terwarnai merah menunjukkan
eosin 5%
spermatozoa yang mati, sedangkan
spermatozoa yang tidak terwarnai adalah
spermatozoa yang hidup

Viabilitas spermatozoa dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Spermatozoa ℎ𝑖𝑑𝑢𝑝
% Viabilitas = x 100%
𝑆𝑝𝑒𝑟𝑚𝑎𝑡𝑜𝑧𝑜𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑢𝑝+𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑎𝑡𝑜𝑧𝑜𝑎 𝑚𝑎𝑡𝑖
 Menghitung Konsentrasi Spermatozoa

Sperma yang diperoleh
dari cacahan kauda
epididimis dimasukkan ke
dalam cawan petri yang
telah berisi larutan
fisiologis (NaCl 0,9%).
Suspensi spermatozoa dalam Sperma dihitung pada 5 kotak
NaCl 0,9% dipipet, kemudian menggunakan counter. Dalam setiap
dilakukan pengenceran 20x kotak ada 16 kotak yang lebih kecil.
dengan NaCl 0,9%, kemudian Seluruh sperma pada setiap 16 kotak
diteteskan pada hemasitometer. dihitung. Apabila ada sperma di batas
luar kotak maka dihitung pada salah satu
sisi saja secara konsisten. Perhitungan
dilakukan secara duplo.

Konsentrasi spermatozoa dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Rata−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑎 𝑥106

% Viabilitas = jt/ml
𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
ANALISIS STATISTIKA

o Data hasil penelitian dinalisis dan divisualisasikan dengan

menggunakan program Prism GraphPad versi 9.2.
o Data terlebih dahulu diuji dengan uji normalitas.
o Semua data dilanjutkan dengan analisis statistik One Way
ANOVA dan Kruskal-Wallis untuk melihat signifikansi
perbedaan rata-rata antar kelompok kontrol dan kelompok
perlakuan.
o Analisis statistika dilakukan pada taraf kepercayaan 95%.
03. HASIL DAN
PEMBAHASAN
 Analisis Fitokimia
Table 2. Hasil Analisis Fitokimia Kualitatif
Fitokimia Ekstrak biji Cucurbita pepo Keterangan
Steroid +++ Terbentuk warna hijau

Terpenoid +++ Terbentuk warna coklat

kemerahan
Fenolik - Tidak terbentuk warna
merah, biru,hijau, sampai
kehitaman
Flavonoid +++ Terbentuk warna kuning
kemudian memudar setelah
penambahan senyawa asam

Saponin - Tidak terbentuk buih/busa

Alkaloid +++ Terbentuk endapan

Tannin - Tidak terjadi perubahan warna

menjadi hijau, merah, ungu,
biru atau hitam

(+): ada, (-): tidak ada

 Analisis Fitokimia
Table 3. Hasil Analisis Fitokimia Kuantitatif

Ekstrak etanol biji Cucurbita pepo

Puncak
(peak) Area Area/
R. Time (%) Nama Senyawa
Height
Hexadecanoic acid, methyl
1 16.703 0,38 2.15
ester (CAS) Methylpalmitate
2 17.277 6,36 3.94 Hexadecanoic acid (CAS) Palmitic acid
Hexadecanoic acid, ethyl ester (CAS)
3 17.400 0,61 3,46
Ethyl palmitate
9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z) methyl
4 18.436 1,13 1,74
ester
5 18.483 3,46 1.66 9-Octadecenoic acid, methyl ester
Octadecanoic acid, methyl ester (CAS)
6 18.708 0,28 1.62
Methyl stearate
Gambar 2.1 Hasil Analisis Fitokimia dengan GC-MS 9-Octadecenal, (Z)- (CAS) CIS-
7 19.196 87,18 11.11
OCTADEC-9-ENAL
8 24.877 0,62 2.31 Lycopersen
 HASIL UJI KUANTITATIF MENGGUNAKAN GC-MS

Puncak Ekstrak etanol biji Cucurbita pepo

(peak)
R. Time Area (%) Area/Height Nama Senyawa

1 16.703 0,38 2.15 Hexadecanoic acid, methyl ester (CAS)

Methyl palmitate Asam lemak jenuh
(asam palmitat)
2 17.277 6,36 3.94 Hexadecanoic acid (CAS) Palmitic acid

3 17.400 0,61 3,46 Hexadecanoic acid, ethyl ester (CAS)

Ethyl palmitate
18.436 1,13 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z) methyl Asam Linoleat
4 1,74
linoleic acid
5 18.483 3,46 1.66 9-Octadecenoic acid, methyl ester Asam lemak jenuh
18.708 0,28 Octadecanoic acid, methyl ester (CAS) (asam stearat)
6 1.62
Methyl stearate
19.196 87,18 9-Octadecenal, (Z)- (CAS) CIS- Lemak aldehid
7 11.11
OCTADEC-9-ENAL
- Karotenoid
8 24.877 0,62 2.31 Lycopersen, Tetracosahexaene,
(antioksidan)
2,6,10,15,19,23-hexamethyl- (CAS)
- Triterpene
Squalene
 Uji Toksisitas Akut Oral
• Adanya kematian satu ekor hewan uji (kode 3A) pada hari
ke-11 dari kelompok dosis 2000 mg/kgBB Dosis Awal
• Tidak menunjukkan adanya gejala toksik pada setiap
hewan uji (pengamatan selama 14 hari pada kelompok
hewan dengan dosis 300 mg/kg BB, dan 2000 mg/kg)
Ekstrak etanol biji C. pepo 300
mg/kgBB diberikan pada 3 hewan uji

Ekstrak etanol biji C. pepo 50

mg/kgBB diberikan pada 3
hewan uji 2-3 0-1

2-3 0-1 Ekstrak etanol biji C. pepo 2000 mg/kgBB

Ekstrak etanol biji C. pepo
5 mg/kgBB diberikan pada diberikan pada 3 hewan uji
3 hewan uji
Kategori 4
>50-300
2-3 0-1
2-3 0-1

Kategori 4 Kategori 5
Kategori 1 LD50 cut off
Kategori 2 >300-2000 >2000-5000
>0-5
>5-50 2500 mg/kgBB
 AKTIVITAS 5-ALPHA REDUCTASE 2

Tabel 4. Nilai Peak Area dan Konsentrasi Substrat

Kurva standar substrat
Konsentrasi
Peak Area Retention Time 300000
Substrat
y = 212795x + 13987
223291 2,658 200000 R² = 0,9963
1
127109 2,608 100000
0,5
58478 2,933 0
0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
19460 2,700
0,05
Gambar 1. Kurva standar substrat
 AKTIVITAS 5-ALPHA REDUCTASE 2

Tabel 5. Aktivitas Enzim 5-alpha Reductase 2

Rerata Nilai Konsentrasi Substrat ± SD

Aktivitas Enzim
No. Kelompok Konsentrasi ∆KS (µg/ml)
Konsentrasi Substrat (unit/mg)
Substrat Awal
Akhir (µg/m)
(µg/m)
1,265 x 10−4 ± 0,475 x 10−5 ± 1,218 x 10−4 ± 7,153 x 10−8 ±
1. Kontrol
0,716 x 10−4 1,927 x 10−5 0,610 x 10−4 3,582 x 10−8
1,309 x 10−4 ± 3,525 x 10−5 ± 0,956 x 10−4 ± 5,619 x 10−8 ±
2. Dosis 200 mg/kgBB
0,475 x 10−4 4,183 x 10−5 0,457 x 10−4 2,682 x 10−8
1,255 x 10−4 ± 9,421 x 10−5 ± 0,313 x 10−4 ± 1,837 x 10−8 ±
3. Dosis 600 mg/kgBB
1,024 x 10−4 8,270 x 10−5 0,301 x 10−4 1,768 x 10−8

Mengalami penurunan
 AKTIVITAS 5-ALPHA REDUCTASE 2
Tabel 6. Hasil Uji Normalitas

Shapiro-Wilk test
W 0,9684
P value 0,8806
Passed normality test (alpha=0.05)? Yes
P value summary ns

o Aktivitas Enzim 5-alpha Reductase 2 mengalami

penurunan namun tidak signifikan secara statistik
(Uji ANOVA) dengan p value 0,1308 (>0,05).

Gambar 3. Aktivitas 5-alpha Reductase 2

 KADAR TESTOSTERON SERUM
Tabel 7. Konsentrasi Hormon Testosteron Serum

Kelompok Rerata Konsentrasi (ng/ml) ± SD

Kontrol 4,1616 ± 3,4269

Dosis 200mg/kgBB 13,5913 ± 10,3315
Dosis 600mg/kgBB 11,6748 ± 5,0291

o Kadar testosteron serum lebih tinggi pada

kelompok perlakuan dibandingkan dengan
kontrol.
o Perbedaan testosterone serum pada kelompok
kontrol dan perlakuan tidak signifikan secara
statistik (Uji Kruskal-Wallis) dengan p value
0,0771 (>0,05)

Gambar 4. Kadar Testosteron Serum

 GONADOSOMATIC INDEX
Tabel 9. Gonadosomatic Index
Kelompok GS1 (%) ± SD
Kontrol 1,437 ± 0,30
Dosis 200mg/kgBB 1,137 ± 0,19
Dosis 600mg/kgBB 1,105 ± 0,17

o Terdapat perbedaan yang signifikan pada rasio bobot

prostat terhadap berat badan antar kelompok kontrol
dan kelompok perlakuan yang diberikan ekstrak
etanol biji C.pepo (P Value 0,0265<0,05)

Gambar 5. Rasio bobot prostat terhadap berat badan

 KONSENTRASI SPERMA
Tabel 9. Konsentrasi Sperma
Konsentrasi Sperma (jt/ml) ±
Kelompok
SD
Kontrol 72,429 x 10 ± 16,682 x 106
6

Dosis 200mg/kgBB 46,714 x 106 ± 15,510 x 106

Dosis 600mg/kgBB 31,143 x 106 ± 18,819 x 106

o Terdapat perbedaan yang signifikan pada

konsentrasi sperma kelompok kontrol dan kelompok
perlakuan yang diberi ekstrak biji C.pepo (P value
0,0072<0,05)
o Konsentrasi sperma menunjukkan penurunan pada
kelompok perlakuan yang diberi ekstrak biji C.pepo

Gambar 7. Konsentrasi Sperma

 VIABILITAS SPERMA
Tabel 10. Viabilitas Sperma
Kelompok Konsentrasi Sperma (%) ± SD
Kontrol 64,29 ± 22,80
Dosis 200mg/kgBB 20 ± 22,18
Dosis 600mg/kgBB 21 ± 16,56

A
B

Gambar 8. Viabilitas Sperma

Gambar 9.. Viabilitas Sperma. (A) Sperma Viable; (B) Unviable

 MOTILITAS SPERMA
Tabel 8. Motilitas Sperma
Kelompok Motilitas (%) ± SD
Kontrol 38,503 ± 7,22
Dosis 200mg/kgBB 45,788 ± 5,36
Dosis 600mg/kgBB 28,708 ± 13,47

o Motilitas sperma paling tinggi pada kelompok

perlakuan dengan Dosis 200 mg/kgBB
o Motilitas sperma paling rendah pada kelompok
perlakuan dengan Dosis 600 mg/kgBB
o Tidak terdapat perbedaan yang signifikan secara
statistik pada motilitas sperma antar kelompok
perlakuan.

Gambar 6. Motilitas Sperma

Kesimpulan
❑ Ekstrak etanol biji C.pepo bersifat toksik ringan dengan nilai LD50 cut
off 2500 mg/kgBB.
❑ Senyawa bioaktif C. pepo kaya akan fitosterol yang dapat menurunkan
aktivitas enzim 5-alphareductase 2 dan meningkatkan kadar
testosterone serum.
❑Senyawa C.pepo diduga dapat mempengaruhi regulasi hormon
testosteron sehingga secara signifikan berpengaruh pada faktor fertilitas
mencit jantan BALB/c dengan menurunkan indeks bobot prostat
terhadap berat badan, konsentrasi sperma, dan viabilitas sperma
❑Pemberian ekstrak biji C. pepo tidak berpengaruh signifikan pada
motilitas sperma.
 Terima Kasih
CREDITS: This presentation template was created by Slidesgo, including
icons by Flaticon and infographics & images by Freepik