MATERI 1: UJI BAKTERI PROTEOLITIK

1. PENDAHULUAN
1.1. LATAR BELAKANG
Produk hewani merupakan produk yang mudah sekali rusak, dikarenakan kandungan
protein yang tinggi. Protein mengandung unsur N yang merupakan salah satu nutrisi
penting bagi mikroba. Cara menguji cearan mikroba pada produk daging, unggas dan
ikan ada beberapa. Berdasarkan tujuan pengujiannya makan dibedakan menjadi :
isolasi, seleksi, differensiasi, dan identifikasi (silakan mencari referensi). Pembusukan
merupakan penyebab utama dari penyia-nyiaan bahan pangan. Kebanyakan bahan
pangan dalam kondisi penyimpanan normal akan mengalami reaksi eaksi atau
perubahan sehingga bahan pangan tersebut tidak dapat dipakai lagi.
embusukan bahan pangan dapat diartikan sebagai setiap perubahan dari bahan pangan
ang masih segar maupun setelah dimana perubahan sifat-sifat kimiawi, fisik atau
rganoleptik dari bahan pangan tersebut mengakibatkan ditolaknya bahan
angan ini oleh konsumen (Buckle et al., 1987).
1.2. Maksud dan Tujuan
Maksud praktikum penghitungan bakteri proteolitik pada produk perikanan
dalah untuk mengetahui adanya bakteri proteolitik yang terdapat dalam produk
akanan. tujuan raktikum ini adalah agar praktikan dapat melakukan analisa
erhitungan bakteri proteolitik pada produk pangan dan mengetahui status kemanan
angan produk tersebut berdasarkan SNI atau standar keamanan pangan lain.
1.3. DASAR TEORI
Bakteri pembusuk makanan banyak ditemukan pada produk yang tinggi protein, hal
ni karena protein mengandung unsur N (nitrogen) pada ikatannya kimiawinya (C-H-
O-N)yang merupakan nutrisi utama yang dibutuhkan bakteri. Produk dengan
kandungan tinggi protein seperti hasil perairan dan hasil ternak banyak beresiko tinggi
mengalami kerusakan akibat cemaran bakteri. Adanya cemaran bakteri pada produk-
produk tersebut dapat menyebabkan masalah kesehatan bila penanganan sebelum
konsumsi kurang tepat. Utuk itu diperlukan batasan yang jelas terkait jumlah cemaran
pada setiap produk pangan untuk menjaga kemanan pangannya.Banyak yang tidak
menyadari bahwa makanan merupakan perantara penyebaran penyakit yang paling
umum. Sayangnya, makanan yang terkontaminasi bakteri bisa tidak
menunjukkan perubahan rasa, warna, dan aroma apapun. Begitu pula dengan gejala
kontaminasi makanan yang sekilas mirip dengan sakit perut biasa. Makanya, gejala
keracunan makanan sering tidak disadari benar. Padahal pada beberapa kasus,
keracunan makanan dapat berujung kematian.Jadi, bakteri apa saja yang bisa
menyebabkan keracunan makanan? Jenis makanan apa saja yang mudah
terkontaminasi?
Salmonella
Salmonella adalah kelompok bakteri yang paling sering menyebabkan diare karena
keracunan makanan. Kontaminasi Salmonella diakibatkan karena kebersihan yang
buruk serta pengolahan makanan yang tidak benar.Beberapa makanan diketahui
memiliki kandungan salmonella yang sangat tinggi, seperti telur, daging, serta daging
ayam yang belum matang. Susu yang belum dipasteurisasi juga berisiko memiliki
salmonella di dalamnya. Sayur dan buah-buahan, meski secara alami tidak
mengandung Salmonella, namun dapat terkontaminasi jika tidak dicuci
bersih.Salmonella aktif bertumbuh pada kisaran pH 3,6 – 9,5 dan optimal pada nilai
pH mendekati normal. Infeksi oleh bakteri Salmonella sp. Pada salmonella penelitian
rata-rata kemembaban di setiap sampel perlakuan dan kontrol berturut-turut ialah
33,49%, 34,33%, 34,61%, 33,00%, 33,44%. Kelembaban optimum bagi bakteri untuk
pertumbuhan adalah 85 %.Bakteri Escherichia coli.Bakteri Salmonella sp. tumbuh
pada suasana aerob dan fakultatif anaerob, pada suhu 15-41ͦC (suhu pertumbuhan
optimum 37,5 ͦC) Zoonosis merupakan penyakit yang dapat menular dari hewan ke
manusia dan sebaliknya.Terbukti menurut laporan kasus dari Indonesian One Health
University Network (INDOHUN) bahwa Salmonella adalah bakteri yang menempati
nomor tiga tertinggi penyebab penyakit yang menular dari makanan.Salmonellosis ini
merupakan penyakit yang menjadi permasalahan di seluruh dunia karena masalah
kesehatan dan dampak dari kerugian ekonomi.Bakteri Salmonella ini merupakan
penyebab diare akut dan kronis bahkan hingga kematian yang signifikan pada hewan
maupun manusia.Sumber infeksi dari bakteri ini bisa melalui feses dari hewan karier
dan manusia serta juga bisa melalui air minum dan makanan yang terkontaminasi
bakteri Salmonella.Kejadian salmonellosis pada manusia sering dilaporkan di dunia
hingga saat ini.Salmonella typhi merupakan salah satu spesies bakteri yang sering
menimbulkan masalah kesehatan penting pada manusia.Sedangkan salmonellosis
pada hewan adalah penyakit infeksius yang paling berpengaruh terhadap produksi
unggas komersial, contohnya pada peternakan ayam pedaging.Karena selain
penularan secara horizontal melalui kontak langsung atau tidak langsung dengan
hewan kariers atau bahan-bahan yang mengandung Salmonella, dapat juga penularan
secara vertikal yaitu melalui telur ayam terinfeksi.Salmonella juga bisa mencemari
daging ayam, hal ini disebabkan karena sanitasi yang buruk pada peternakan atau
pada Rumah Potong Unggas (RPA).Kemudian untuk pengendalian salmonellosis
dapat dimulai dengan menggunakan bibit ayam dan bahan pakan yang bebas
Salmonella, serta sanitasi lingkungan yang baik di sekitar peternakan. Karena upaya
untuk mendapatkan produk makanan asal hewan yang ASUH (Aman, Sehat, Utuh,
dan Halal) serta bebas Salmonella merupakan tanggung jawab bersama antara
pemerintah, produsen, dan konsumen.Bakteri pembususk berdasarkan media yang
digunakan atau nutirisi yang diurai
dibagi menjadi 3, yaitu:
Bakteri Proteolotik
Bakteri yang tergolong proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim
proteinase ekstrakseluler yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel
kemudian dilepaskan keluar dari sel. Bakteri proteolitik dapat dibedakan atas
beberapa kelompok (Fardiaz, 1992): Beberapa bakteri proteolitik asam, misalnya:
streptococcus, faecalis, Var. Linguifaciens dan Micrococcus careolyticus.
Beberapa bakteri putrefaktif misalnya kebanyakan spesies dari Clostridium, beberapa
spesies Proteus, Pseudomonas dan bakteri tidak berspora lainnya (Fardiaz,
1993).
Bakteri amilolitik
Hanya beberapa bakteri yang bersifat amilolitik yaitu memproduksi
enzim amilase memecah pati diluar sel. Misalnya Bacillus sp. dan Clostridium
botulinum (Fardiaz, 1992). Pati dapat dipecah oleh berbagai mikroba amilolitik
menjadi polimer yang lebih sederhana atau gula monosakarida dimana
monosakarida selanjutnya akan dipecah lagi menjadi energi, contoh bakteri
pemecah pati yaitu Bacillus Subtilis (Fardiaz, 1993).
Bakteri lipolitik
Lipase merupakan enzim yang mampu merombak lemak menjadi asam
lemak bebas dan gliserol. Mikroba yang mampu menghasilkan adalah
Pseudomonas, Alcaligenes, Moraxella, Staphylococcus, Rhizopus,
Geotrichum, Aspergillus, Candida ,Rhodotorulla, Flansenulla,
(Hidayat et al., 2006).
Skim Milk Agar (SMA)
Bakteri proteolitik menimbulkan masalah pada produk bahan pangan atau
makanan. Bakteri jenis Clostridium yang bersifat patogen dapat menyebabkan
keracunan makanan. Jika tumbuh pada susu, spesies bakteri ini dapat membentuk
asam dan gas sehingga menggumpalkan susu, proses ini disebut “Stormy
fermentation”. Bacillus sering menyebabkan kerusakan pada makanan kaleng dengan
memproduksi asam tanpa gas, sehingga kerusakannya disebut ”Flat Sour”. Beberapa
bakteri bersifat yaitu memecah protein secara anaerobik dan memproduksi
komponen-komponen yang berbau busuk seperti hydrogen sulfide, merkaptan,
amin,idol dan asam-asam lemak. Media selektif bakteri proteolitik ialah media SMA
(Skim Milk Agar), yang berwana agak keruh. Bakteri proteolitik akan mengurai
kasein susu, sehingga pertumbuhan koloni bakteri proteolitik ditandai dengan adanya
atau area bening di sekitar koloni.Isolasi dan seleksi bakteri proteolitik dilakukan pada
media selektif Skim Milk Agar (SMA) atau media Susu Skim Agar (SSA) sebagai
sumber protein. Media ini mengandung nutrisi utama berupa laktosa sebagai sumber
karbon dan kasein sebagai sumber nitrogen. Kasein merupakan protein susu yang
terdiri dari fosfoprotein yang berikatan dengan kalsium membentuk misel kasein atau
koloid berwarna putih . Kadar kasein pada media ini cukup tinggi sehingga medium
SMA berwarna putih kekuningan atau putih tulang. Bakteri proteolitik yang tumbuh
pada media susu skim akan membentuk zona bening disekitar koloni, karena terjadi
hidrolisis kasein oleh protease yang dihasilkan bakteri proteolitik tersebut , seperti
ditunjukkan pada . Umumnya pada tahap ini menghasilkan berbagai macam koloni,
bahkan antar koloni satu dan lainnya menumpuk hingga sulit dipisahkan seperti .
Maka diperlukan tahap pengenceran sampel dan menginokulasikan masing-masing
hasil pengenceran ke media selektif untuk mendapatkan koloni yang terpisah
seperti.Masing-masing koloni diduga masih belum murni maka dilanjutkan dengan
tahap pemurnian isolat bakteri proteolit

PEMPEK
Pempek adalah makanan yang dibuat dari daging ikan yang digiling lembut yang
dicampur tepung kanji atau tepung sagu, serta komposisi beberapa bahan lain seperti
telur, bawang putih yang dihaluskan, penyedap rasa, dan garam.[1] Pempek biasanya
disajikan dengan kuah yang disebut cuko yang memiliki rasa asam, manis, dan pedas.
Pempek merupakan makanan khas Palembang - Sumatera Selatan.Pada tahun 1880-
an, penjual biasa memikul satu keranjang penuh pempek sambil berjalan kaki
berkeliling menjajakan dagangannya.Di kota nya pempek , palembang. cara makan
pempek yang benar adalah dengan mengunakan mangkuk kecil sebagai tempat
cukonya lalu di makan pempeknya setelah itu pempek dicocol dan cukonya diseruput
untuk menambah rasanya nikmatnya.kandungan yang terdapat pada pempek ialah Air
63.40 g, Energi 152.00 kkal, Protein 4.50 g, Lemak total 2.30 g, Karbohidrat total
28.20 g, Abu 1.60 g, Natrium 628.00 mg, B-Karoten 0.00 mcg, Karoten total 0.00
mcg,
2. PROSEDUR KERJA
2.1. Waktu dan Tempat
Waktu : Selasa&Rabu,6&7 Desember 2023 , jam 08.00 - 11.00 WIB
Rabu (13.00-15.00) WIB
Tempat : Laboratorium Biologi & Mikrobiologi FTP, gedung V lantai 2 (V.2.1)

3. METODELOGI
3.1. ALAT
Alat yang digunakan dalam materi ini adalah :
Tabung reaksi
Petridish
Mikropipet
Blue tip
Vortex mixeR
Timbangan
Lampu spirtus
Erlenmeyer
Inkubator
Autoclave
Water bath
3.2. BAHAN
Sampel
Aquadest
NaCl
SMA (Skim Milk Agar) steril
NA (Natrium Agar) steril
Spirtus
Alkohol 70% , desinfektan
3.3. LANGKAH KERJA
Membuatpengenceranbertingkat
1. Buat larutan garam fisiologis dengan melarutkan 0.85% NaCl pada aquadest.
2. Disaring larutan garam fisiologis tadi menggunakan kertas saring.
3. Dituang sebanyak 225 ml larutan kedalam erlenmeyer (jumlah
erlenmeyer dapan menyesuaikan yang dibutuhkan). Tutup erelenmeyer dengan
kapas hingga rapat lalu balut dengan alumunium foil.
4. Dimasukkan larutan ke dalam tabung reaksi sebnayak 9 ml. Lakukan pada 5
tabung. Tutup tabung reaksi dengan rapat.
5. Disterilisasi larutan pengenceran ke dalam autoclave pada suhu 121oC dengan
tekanan 2 ATM selama 15 menit. Dinginkan.
6. diukur dan ditimbang sebanyak 25 ml sampel cair atau 25 gram sampel padat,
kemudian dimasukkan ke dalam erelemeyer berisi 225 ml Na.fisiologis 0,85% steril.
Dihomogenkan. Berikutnya disebut pengenceran 10 -1 .
7. Diambil suspensi pengenceran 10 -1 sebanyak 1 ml dengan mikro pipet kemudian
dipindahkan pada tabunga reaksi berisi 9 ml Na fisiologis steril (pengenceran 10 -2 )
lalu dihomogenkan.
8. Buang mikro tip ke dalam wadah yang telah disediakan/safety box setiap kali
selesai mengambil suspensi pengenceran.
9. Diambil 1 ml suspensi pengenceran 10-2 dan dipindahkan ke dalam tabung berisi
9 ml Na.fis steri, lalu dihomogenkan (pengenceran 10-3 ).
10. Dibuang mikro tip lalu lakukan cara yang sama hingga pengenceran 10 -5 .
Membuat Media SMA
1. Dihitung kebutuhan media yang akan digunakan, dengan cara menghitung jumlah
pencawanan dikalikan 15 ml media yang dituang.
2. Ditimbang media SMA berdasarkan rasio penggunaan yang tertera dalam
kemasan.
Misal: rasio penggunaan SMA adalah 40 gr per 1000 ml aqudest.
Maka :

(setiap merek dapat memiliki rasio penggunaan yang berbeda).

3. Dimasukkan SMA serbuk ke dalam erlenmeyer, ditambahkan aquadest yang telah
diukur lalu dihomogenkan.
4. Panaskan larutan SMA pada duhu 80 oC sampai tidak terdapat gumpalan.
5. Ditutup erlenyer dengen kapas dan dibalut alumunium foil.
6. Disterilisasi media SMA pada suhu 121 oC dengan tekanan 2 ATM selama 15
menit.
7. Dinginkan media sampai suhu mencapai 45oC sebelum digunakan.

Isolasi Mikroba
1. Diambil 1 ml larutan dalam tabung pengenceran 10-3 dan dimasukkan ke dalam
cawan petri steril secatra aseptis. Diulang ke 2 cawan (duplo).
2. Lakukan hal yang sama pada pengenceran 10 -4 dan 10-5 .
3. Dituangkan 15 ml SMA secara aseptis kedalam cawan berisi inokulan, dan
kocok cawan perlahan membentuk huruf “S” atau angka 8. (perhatikan jangan
sampai PCA tumpah).
4. Lakukan hal yang sama pada pengenceran berikutnya.5. Diamkan hingga PCA membeku,
kemudian dibalik cawan untuk menghindari
menetesnya air ke media.
6. Inkubator difiksasi sebelum dan setelah digunakan dengan desinfektan.
7. Kemudian cawan diinkubasi dalam kondisi terbalik, pada suhu 30oC ± 1 oC selama
48 jam.
8. Dihitung jumlah koloni yang tumbuh dan dilaporkan jumlah mikroba per ml susu
(colony/ml) atau per ml media (CFU/ml)
Rumus;

Keterangan :
∑ C = jumlah koloni setiap cawan
N1 = jumlah cawan pengeceran awal yang memenuhi syarat dihitung
N2 = jumlah cawan pengeceran berikut yang memenuhi syarat dihitung
d = faktor pengenceran yang pertama dihitung
Satuan = CFU/ml (Colony Form per Unit/ml)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengenceran
Sampel Ulangan
10-4 10-5

pempek 1

58
480

pempek 2

50 416

4.1 Analisa Hasil

Perhitungan :
Pempek
5 5
480 ∙10 416 ∙10
 Proteolitik (1) = 4
= 5
=12 →12>2
58∙ 10 50 ∙ 10
Maka, dipilih nilai yang paling kecil yaitu 50 × 104 = 5,8 × 105 CFU/g
5 5
416 ∙ 10 416 ∙10
 Proteolitik (2) = 4
= 5
=8 ,7 → 8 , 7>2
50∙ 10 50∙ 10
Maka, dipilih nilai yang paling kecil yaitu 103 × 104 = 5,0 × 105 CFU/
g

Pengenceran
Sampel Ulangan CFU/g
10-4 10-5
 Pempek 1 58 480 5,0 × 105
Pempek 2 50 416 5,8 × 105

Dari praktikum yang telah dilakukan dapat diketahui bahwa pempek yang digu
nakan sebagai sampel praktikum mengandung bakteri proteolitik. Hal ini dapat dilihat
dari tabel di atas. Dalam tabel diketahui bahwa sampel pempek pada percobaan perta
ma didapati hasil 5,8 x 10⁵ CFU/gr dan pada percobaan kedua sebesar 5,0 x 10 ⁵ CFU/
gr. Hal ini menandakan bahwa sampel tersebut mengandung bakteri proteolitik. Ada b
eberapa faktor yang menyebabkan pempek mengandung bakteri tersebut, antara lain y
aitu penggunaan ikan yang sudah mati atau tidak segar, pengolahan pempek yang tida
k higienis, dan penyimpanan pempek yang tidak tepat. Pempek dapat mengandung ba
kteri proteolitik karena bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatannya, seperti ika
n. Ikan dapat mengandung bakteri alami yang dapat memecah protein. Selain itu, sela
ma proses pembuatan, jika kebersihan tidak dijaga dengan baik, bakteri dari lingkung
an atau peralatan dapat mencemari pempek dan menyebabkan pertumbuhan bakteri pr
oteolitik. Oleh karena itu, penting untuk memastikan kebersihan selama seluruh prose
s pembuatan dan penyimpanan pempek.
5.1 Kesimpulan
Pada praktikum ini, diketahui bahwa pada sampel pempek terkandung bakt
eri proteolitik.
DAFTAR PUSTAKA

https://hellosehat.com/infeksi/infeksi-melalui-makanan/bakteri-penyebab-keracunan-
makanan/
https://www.neliti.com/publications/148506/pengaruh-ph-terhadap-pertumbuhan-
salmonella-typhi-in-vitro
https://fmipa.um.ac.id/wp-content/uploads/2019/10/KIMIA-Evi-Susanti-Rev-78-
92.pdf
https://nilaigizi.com/gizi/detailproduk/1024/nilai-kandungan-gizi-pempek-telur-
masakan
https://jurnal.poltekkespalu.ac.id/index.php/JIK/article/view/488