Uji Acid Hams Test

 Tujuan : untuk melihat adanya gangguan bentuk morfologi dari sel eritrosit bila
ditambahkan larutan asam ( peningkat fragilitas osmotik ) test ini digunakan
jika ada dugaan PNH.

 Prinsip : sel darah merah penderita dengan adanya komplemen akan lebih mudah
pecah dalam suasana asam.

 Dasar Teori : Pada acid hams test eritrosit diinkubasi dengan serum segar & heated
serum untuk tes hemolisis. Asam lemah ditambahkan untuk
memaksimalkan aktivitas hemolisis. Hemolisis dapat terjadi pada
Eritrosit yang tersensitisasi antibodi, Sferosit , dan PNH.

 Langkah Kerja :
 Alat :
1. Tabung venoject 6 buah
2. Waterbath 1 buah
3. Sentrifuge 1 buah
4. Rak tabung 1 buah
5. Timer 1 buah
6. Mikropipet dan tip
 Bahan :
1. Defibrinated nlood
2. NaCl 0,85 %
3. HCl 0,2 N

 Cara kerja :
1. Alat dan bahan disiapkan
2. dilakukan pencucian darah, cuci darah dengan NaCl 0,85 %, sentrifuge
2000 rpm selama 5 menit, buang supernatan, tambahkan NaCl lagi
pada tabung. Lakukan pencucian sebanyak 3 kali, pada pencucian
terakhir NaCl dibuang, sisakan darahnya saja.
3. dibuat suspensi sel normal dan sel pasien
 suspensi sel 50 % : ( dilakukan untuk penderita dan kontrol )
- dibuat suspensi sel eritrosit 50 % sebanyak 5 ml
maka 50% x 5 = 2,5 ml PC, kemudian ditambah 2, 5 ml NaCl 0,85
%
4. dibuat serum normal dan serum inaktif
- serum normal →darah dalam tabung bertutup merah disentrifuge
selama 3000 rpm 5 menit, kemudian ambil serumnya.
- Serum inaktif → serum diinkubasi dalam waterbath dengan suhu
56°C selama 30 menit
5. Disiapkan 6 tabung venoject, diberi label
6. Setiap tabung diisi dengan ketentuan sebagai berikut

Tabung Normal Normal Suspensi Suspensi HCL

Serum Serum Sel Sel 0.2 N
Inaktif Normal Pasien
1 500µl - - 50 µl -
2 500 µl - - 50 µl 50 µl
3 - 500 µl - 50 µl 50 µl
4 500 µl - 50 µl - -
5 500 µl - 50 µl - 50 µl
6 - 500 µl 50 µl - 50 µl

7. Keenam tabung dihomogenkan. Inkubasi dalam waterbath dengan suhu

37°C selama 1 jam.
8. Sentrifuge 1000 rpm selama 2 menit
9. Setiap tabung diamati ada tidaknya hemolisis.

 Interpretasi Hasil
 Tabung 1 : untuk melihat kecocokan antara darah penderita dan normal
 Tabung 2 : + asam → lisis → PNH
 Tabung 3 : sebagai kontrol terhadap semua tabung karena komplemennya
sudah tidak aktif
 Tabung 4, 5, dan 6 : sebagai kontrol
 Uji Sugar Water Test

 Tujuan : mendeteksi sel eritrosit yang rapuh dan mudah pecah serta kemampuan sel
eritrosit untuk bertahan dalam larutan yang memiliki kekuatan ion yang
rendah.

 Prinsip : Darah dicampur dengan larutan gula pada suhu kamar. Eritrosit PNH
akan mudah lisis pada kondisi tersebut.

 Dasar Teori : Sugar water test merupakan tes screening PNH ( paroksismal nocturnal
hemoglobinuria ). Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) adalah
kelainan kronis didapat (acquired) yang ditandai terjadinya hemolisis
intravaskuler dan hemoglobinuria yang pada umumnya terjadi pada saat
pasien tidur di malam hari. Pada sugar water test ini eritrosit PNH lisis
bila terpapar larutan serum dengan kekuatan ion rendah yg mengandung
komplemen selain itu dapat menunjukkan sensitivitas eritrosit terhadap
komplemen. Pada keadaan ini eritrosit normal tidak mengalami lisis

 Langkah Kerja :
 Alat dan Bahan :
1. Larutan gula, pH 7,4 ±0,1 :
- sucrose9,5 g
- air suling(aquadest) 100 mL
- larutaninidipakaidalamkeadaansegar

2. Darah sitrat (Na sitrat 0,109 M) dengan perbandingan 1:9

3. Tabung reaksi 12 x 75 mm 2 buah
4. Pipet serologic 2mL dan mikropipet 200 µL

 Cara Kerja

1. Tabung reaksi disiapkan sebanyak 2 buah, beri label untuk pasien dan kontrol.
2. Larutan gula1,8 mL dimasukkan ke masing-masing tabung.
 3. Tabung pasien ditambah sampel darah pasien 200 µL, sedangkan tabung
control juga ditambah sampel darah control (orang sehat) 200 µL.
4. Tabung tersebut dihomogenkan,inkubasi suhu kamar selama 20 menit.

 Interpretasi Hasil :

- Bila pemeriksaan pada tabung pasien mengalami hemolisis: sugar

water test (+).
- Bila tetap jernih seperti tabung kontrol: sugar water test (-).

Catatan: tabung control selalu harus negative (tetapjernih).

 Pembahasan :
Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) adalah suatu kelainan
kronis yang ditandai dengan terjadinya hemolisis intravaskuler dan
hemoglobinuria yang umumnya terjadi pada saat pasien tidur di malam hari.
Hal ini dapat terjadi karena adanya kelainan seluler karena mutase somatic
pada totipoten hematopoetic stem cell yang menyebabkan kerusakan intrinsik
pada membran sel darah merah. Sehingga sel darah merah lebih rentang
terhadap aksi lisisdari komplemen. PNH ini biasanya terjadi pada usia 30-40
tahun namun prevalensi terjadinya PNH ini adalah 2 dari 1 juta orang di dunia.
Mutasi somatic pada totipoten hematopoetic stem cell ini menyebabkan
terjadinya defisiensi berbagai jenis protein yang diperlukan bagi pembentukan
glycosylphosphatidylinositol anchored (GPI anchored), Akibat defisiensi ini,
GPI anchored yaitu suatu struktur kompleks yang berfungsi mengatur protein
permukaan sel hematopoetik serta mengatur kadar complement-mediated lysis
juga mengalami defisiensi. Hal ini kemudian memberikan efek langsung
terhadap proses hemolisis normal (Desfiyanda,dkk..2018)
Ham’s Test (HT) atau Acid Hemolysin Test memiliki dasar pemeriksaan
bahwa eritrosit lebih rentan untuk pecah (fragile) atau mengalami hemolisis
bila diletakkan di cairan yang bersifat asam lemah. Tes ini sangat spesifik
untuk menegakkan diagnosis PNH. Bila hasil tes ini positif, maka dapat
dipastikan diagnosisnya benar PNH, dan bila hasil tes negatif, maka bukan
PNH. (Tembhare, 2010). diagnosis PNH juga dapat menggunakan sugar water
 test namun test ini memiliki spesifitas lebih rendah dibandingkan dengan acid
ham’s test. Dasar dari pemeriksaan SWT adalah apabila eritrosit diletakkan di
cairan rendah garam (low-salt solution) yang mengandung sukrosa, maka
terjadi aktivasi komplemen, berikatan dengan sel, lalu melisiskannya. Bila
didapatkan hasil positif, maka bukan PNH. Namun, bila didapatkan hasil
negatif, maka dapat ditegakkan diagnosis PNH. Jika hasil pemeriksaan pasien
menunjukkan hasil Ham’s Test positif dan Sugar Water Test negatif, maka
pasien sudah dapat didiagnosis PNH. (Pramono,dkk..2015)
persamaan antara acid hams test dan sugar water test adalah kedua test ini
merupakan test screening untuk mendeteksi PNH dengan prinsip yang sama
yakni eritrosit PNH yang di letakkan pada suhu kamar dengan diberi larutan
gula / asam akan mengalami hemolisis

perbedaan antara acid hams test dan sugar water test ini terdapat pada
reagen yang digunakan dan interpretasi hasil. Reagen yang digunakan pada
Acid Hams Test diantaranya Nacl 0,85% dan HCL 0,2 N,serta sampel yag
digunakan yaitu defribinated blood. Sedangkan pada Sugar Water Test reagen
yang digunakan adalah larutan sukrosa, dan sampel yang digunakan yaitu
darah sitrat (Na sitrat 0,109 M dengan perbandingan 1:9). Seseorang
didiagnosa PNH apabila hasil pemeriksaan Acid ham test positif, dan Sugar
water test negatif.

Gambar hasil pada acid hams

Hasil positif Hasil negatif

Tabung 2 lisis

Gambar hasil pada sugar water test

 Hasil positif Hasil negatif

 Daftar Pustaka

Desfiyanda,Fitrach dkk. 2018. Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) Dengan

Hypercoagulable State. Jurnal fk UNAND.7(2):87-90

Pramono, Laurentius A, dkk.. 2015. Diagnosisdan Tata Laksana Paroxysmal Nocturnal

Hemoglobinuria. Jurnal Penyakit Dalam Indonesia. 2(2):107-115

Tembhare P, Ramani M, Syed K, Gupta AD. Flow cytometric analysis of erythrocytes en

paroxysmal nucturnal hemoglobinuria reveals superiority of CD59 as a diagnostic
maker compared to CD55. Indian J Pathol Microbiol. 2010;53(4):699-703.