Tutorial Mikrobiologi Klinik

Uji Serologis Widal

dr.Theresia Novi
Dr. dr. Prihatini, SpPK(K)

Surabaya, 17 Desember 2003

1
 Prinsip Dasar Uji Widal:
Uji aglutinasi

Antigen adalah suspensi kuman

Salmonella (tidak larut) yang direaksikan
dengan antibodi spesifik terhadap kuman
tersebut yang ada di dalam serum
penderita.

2
 Cara mempersiapkan Antigen

Identifikasi kuman:

Identifikasi morfologi kuman: media SS

(Salmonella Shigella agar): halus, opaque,
transparan dan tidak berwarna.

Pengecatan Gram: batang Gram negatif.

3
Uji Biokimia pada media:
TSI (Triple Sugar Iron),
LIM (Lysine Indole Moltility) dan
SC (Simmons Citrate),
inkubasi suhu 37C; 18-24 jam.

Uji serologis:
antisera O dan H (S. typhi),
antisera H (S. paratyphi A dan B)

4
 Spesies TSI SC L I M

Slant Butt Gas H2S

S. typhi Alk Acid - + - + - +

S. Paratyphi Alk Acid + - - - - +

A
S. Paratyphi Alk Acid + + - + - +
B

5
 Antigen H (Bailey/Scott)
Pilih strain kuman Salmonella yang motil,
dan halus. Motilitas: dikultur pada agar
0,3-0,4%.
Inokulasi pada infusion broth atau
trypticase soy broth, inkubasi pada suhu
ruangan 24-48 jam.
Tambahkan formalin (40% formaldehyde)
konsentrasi menjadi 0,3%, letakkan pada
lemari es 48 jam.
6
Encerkan suspensi stok dengan larutan
bufer fosfat (pH 6,87) yang berisi 0,3%
formalin hingga kepadatan sel setara
dengan standar 3 Mc Farland.

Biarkan stabil dalam lemari es 2 minggu

sebelum digunakan.

7
 Antigen H (Mikrobiologi PK)
Pilih strain kuman Salmonella yang motil, dan
halus. Inokulasi pada agar Mueller Hinton,
inkubasi 37C, 24 jam.
Kerok dengan ose, masukkan pada TSB atau
TPB, aduk, inkubasi 37C, 24 jam.
Tambahkan formalin (40% formaldehyde) hingga
konsentrasi menjadi 0,3%, letakkan dalam
lemari es 3-4 hari, sentrifus dan cuci dengan
salin hingga jernih.
Encerkan dengan bufer fosfat hingga 3 Mc
Farland. Simpan dalam lemari es.

8
 Antigen O (Bailey/Scott)

Tanamkan koloni kuman yang halus dari

agar pada botol Roux yang mengandung
2% kaldu atau pada trypticase soy agar.
Inkubasikan suhu 36C; 18-24 jam.

Panen kuman dan letakkan pada botol

sentifus dengan sejumlah salin.

9
Tambahkan 95% alkohol dengan rasio 4:1
(Alkohol:suspensi kuman). Kocok 30
menit, letakkan pada suhu kamar, dalam
gelap selama 48 jam.

Sentrifus, buang supernatan, cuci 2 kali

dengan salin 0,85%.

Resuspensi dengan bufer fosfat pH 6,8-7

yang berisi 0,3% formalin.

Encerkan dengan salin hingga kepadatan

sel setara dengan standar 3 Mc Farland.
10
 Antigen O (Mikrobiologi PK)
Tanamkan koloni kuman yang halus pada
Mueller Hinton agar. Inkubasikan suhu
37C; 18-24 jam.

Panen kuman dan letakkan pada botol

sentifus dengan sejumlah salin.

Tambahkan 95% alkohol dengan rasio 4:1

(Alkohol:suspensi kuman). Kocok 30
menit, letakkan dalam lemari es 3-4 hari.

11
Sentrifus, buang supernatan, cuci 2 kali
dengan salin 0,85%.

Resuspensi dengan bufer fosfat pH 6,8-7

yang berisi 0,3% formalin.

Encerkan dengan salin hingga kepadatan

sel setara dengan standar 3 Mc Farland.
Simpan dalam lemari es.

12
Cara Uji Widal

Ada dua cara:

1. Tes slide
2. Tes Tabung

13
 Tes Slide
Uji penyaring:
Pada gelas objek:
2 tts serum penderita + 2 tts suspensi antigen,
campur dengan gelas pengaduk, gerakkan
gelas objek dengan gerakan memutar perlahan
5 menit, suhu kamar,
aglutinasi dilihat dengan bantuan lampu neon
atau cahaya matahari dekat jendela kaca.

Uji titrasi:
Serum penderita diencerkan serial

14
Contoh pengenceran serial (dari kit reagensia
lokal)
Titer Perbandingan
Serum (l) Pengencer Antigen
serum (l) (l)
1:20 10 30 40
1:40 7 34 40
1:80 5 35 40
1:160 4 36 40
1:320 3 38 40

15
 Tes Tabung
Bahan : Serum penderita

Alat : 1. Rak kecil berlubang 24 dan

tabung venoject 3 ml.
2. Pipet serologi 1 ml dengan
skala 0,01 ml.
3. Mikropipet 50L.
4. Inkubator.

16
Reagen : Antigen Widal
O = antigen Salmonella typhi
(somatik)
H = antigen Salmonella typhi
(flagelar)
A = antigen Salmonella paratyphi
A (flagelar)
B = antigen Salmonella paratyphi
B (flagelar)

17
 Cara kerja
Lakukan pengenceran serum
(lihat diagram berikut)
Tambahkan antigen 0,25 ml pada tiap
tabung
Campur dengan cara menggoyang rak 3-
4x
Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam
Lihat adanya aglutinasi pada dasar tabung
dengan bantuan cermin (Widal reader)

18
 Cara membaca aglutinasi
Pola sedimen di dasar tabung, lihat diatas
cermin cekung.
Negatif: sedimen bulat, tepi halus.
Positif: sedimen melebar ke tepi dengan
pola ireguler.
Setelah dilihat, goyangkan tabung:
aglutinin H : agregat flokuler, mudah pecah
aglutinin O : agregat granuler dan halus

19
 +100l serum 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

-100l PZ
B Buang
2ml PZ 1ml PZ 1ml PZ 1ml PZ 1ml PZ 1ml PZ

A 0,25 ml

H 0,25 ml

0,25 ml
O

1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640

Diagram cara pengenceran sebelum

diencerkan dengan penambahan
20
antigen 0,25 ml (2x pengenceran)
 Kontrol
Kontrol Positif
Uji Widal dilakukan terhadap serum yang
mengandung aglutinin dengan titer >1:160
Dalam 1 rak, dikerjakan bersama
beberapa rak yang berisi serum penderita

Kontrol Negatif
4 tabung berisi 0,25 ml PZ dan 0,25 ml
antigen (O, H, A dan B)
21
 Interpretasi

Kriteria diagnostik untuk demam tifoid:

bila titer dari aglutinin O saja atau dan
H 2 kali batas atas titer normalnya,
Aglutinin O: 1:80 Aglutinin H: 1:40
Aglutinin A: 1:40 Aglutinin B: 1:80
atau
bila dalam jangka waktu 5-7 hari terjadi
kenaikan titer aglutinin sebesar 4 kali.
22
Laboratorium Mikrobiologi Patologi
Klinik
Cut off: anak-anak (1-13 th) : 1:80
dewasa : 1:160
Contoh cara penulisan:
Titer 1:160 kemungkinan demam tifoid,
paratifoid tidak dapat disingkirkan.
Titer >1:160 hasil titer O, H lebih tinggi
dari batas normal di laboratorium kami.

23
 Hasil Negatif
Tidak ada infeksi S. typhi
Dalam status carrier
Antigen bakteri belum adekuat
merangsang pembentukan antibodi
Kesulitan teknis atau kesalahan dalam
melakukan uji Widal
Pengobatan dengan antibiotika
sebelumnya
Variasi dalam persiapan antigen
24
 Hasil Positif
Menderita demam tifoid
Imunisasi dengan antigen Salmonella
Reaksi silang dengan Salmonella non-
tifoid
Variasi dan standarisasi yang kurang,
dalam persiapan antigen
Infeksi dengan malaria atau enterobacter
lain
Penyakit lain, seperti dengue
25
 Kelemahan Uji Widal
Antigen: strain bukan dari daerah yang
bersangkutan, kekeruhan suspensi yang
kurang standarisasi.
Kadar aglutinin terlalu tinggi: fenomena
prozone negatif semu
Cara pembacaan: subjektif
Aglutinat tidak berwarna: menyulitkan
pembacaan

26
27
 Salmonella-Shigella (SS) agar
Media agar selektif untuk subkultur kuman
Salmonella dan Shigella.
Buatan OXOID: Lab-Lemco 5g, Pepton
5g, Laktose 5g, garam empedu 8,5g,
natrium sitrat 10g, natrium tiosulfat 8,5g,
ferri sitrat 1g, brilliant green 0,000333g,
neutral red 0,025g, agar 12g, ditambah air
suling sampai 1 liter. pH media 7,3.

28
 Media Triple Sugar Iron (TSI)

Untuk identifikasi kuman patogen enterik

Gram negatif berdasarkan kemampuan
kuman:
meragi laktosa, glukosa dan sukrosa
dengan pembentukan asam dan gas,
memproduksi hidrogen sulfida.

29
 Media Lysine Indole Motility (LIM)
Media untuk reaksi biokimia, untuk
melihat:
Dekarboksilasi lysine
Motilitas kuman
Melakukan tes Indol dengan reagen Kovac
Reagen Kovac diteteskan pada media LIM
setelah inkubasi 24 jam.

30
 Media Simmons Citrate (SC)
Menentukan karakteristik
Enterobacteriaceae dengan cara
mendeteksi pemakaian sitrat.

31
 Mueller Hinton agar
Beef, infusion from 300g
Peptone 17,5g
Starch 1,5g
Agar 17g
pH = 7,4

Untuk Tes Kepekaan Antibiotika

32
 Pewarnaan Gram (Bailey/Scott)
Hapusan kuman difiksasi di atas api
Banjiri gelas objek dengan cat kristal violet, 10
detik.
Buang cat, bersihkan dengan larutan iodine.
Banjiri dengan larutan iodine 10 detik.
Cuci dengan air mengalir.
Hilangkan warna dengan larutan alkohol-aseton
10-20 detik.
Counterstain dengan safranin 10 detik.
Cuci dengan air, keringkan diantara dua kertas
bersih.

33
 Standar Nefelometer Mc Farland
No tab 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Barium 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Klorida (ml)

Asam 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9
sulfur (ml)

Densitas 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
(x108 /ml)

34