Alat untuk Proteomika Jamur: Vektor Neurospora Multifungsi

untuk Penggantian Gen, Ekspresi Protein dan Pemurnian Protein

Ikhsan Perdana D.131.16.0096

Sri Witdowati D.131.16.0112
 Abstrak
Penyelesaian proyek sekuensing genom untuk sejumlah jamur mengatur
tahapan untuk penyelidikan rinci protein. Kami melaporkan generasi vektor
ekspresi serbaguna untuk deteksi dan isolasi protein dan kompleks protein
dalam jamur berserabut Neurospora crassa. Vektor, yang dapat diadaptasi
untuk jamur lain, mengandung C-atau N-terminal FLAG, HA, Myc, GFP, atau tag
epitop HAT-FLAG dengan linker poli-glisin yang fleksibel dan termasuk urutan
untuk penargetan ke lokus her-3-nya dalam Neurospora.
Untuk memperkenalkan mutasi di lokus asli, kami juga membuat
serangkaian vektor knock-in yang berisi tag epitope diikuti oleh hph marker
yang dapat dipilih (menghasilkan resistensi hygromycin) diapit oleh dua situs
loxP. Kami mengadaptasi sistem Cre / loxP untuk Neurospora, memungkinkan
hph marker yang dipilih untuk dieksisi dengan memasukkan Cre recombinase
ke dalam strain yang mengandung kaset knock-in. Selain itu, metode
pemurnian protein dikembangkan berdasarkan sistem tag afinitas tandem HAT-
FLAG, yang digunakan untuk memurnikan HETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(HP1) dan protein terkait dari Neurospora. Seperti yang diharapkan
berdasarkan percobaan dua-hibrida ragi dan co-imunopresipitasi (Co-IP),
Neurospora DNA methyltransferase DIM-2 ditemukan dalam kompleks dengan
HP1. Fitur-fitur vektor baru diizinkan untuk verifikasi interaksi antara HP1 dan
DIM-2 in vivo dengan tes Co-IP pada protein yang diekspresikan baik dari lokus
asalnya atau dari lokus-3-nya.
 Protein jelas memainkan peran penting dalam beragam proses biologis melalui
interaksi dengan protein lain, DNA, RNA, dan molekul kecil baik di dalam maupun di
luar sel. Antibodi sangat berharga untuk deteksi dan isolasi protein in vivo, tetapi
pembentukan antibodi spesifik untuk protein yang menarik tidak selalu berhasil dan
bisa mahal. Pendekatan alternatif adalah menandai protein yang menarik dengan
epitop yang dapat dideteksi dengan antibodi yang tersedia secara komersial (Jarvik
dan Telmer 1998; Brizzard 2008). Meskipun ini menghilangkan kebutuhan untuk
meningkatkan antibodi, tag epitope yang menyatu dengan terminal C atau terminal
N dapat memengaruhi pelipatan protein, menutupi domain atau urutan sinyal yang
berdekatan, menghambat pemrosesan dan modifikasi protein, dan mengganggu
fungsi protein yang tepat (Booher dan Kaiser 2008 ; Sung et al. 2008). Demikian
pula, penggunaan beberapa epitop dapat meningkatkan sensitivitas, tetapi epitop
yang besar juga dapat mengganggu fungsi protein. Suatu penghubung polipeptida
yang fleksibel, seperti rantai 10-glisin (fleksibel karena tidak adanya gugus
samping) yang ditempatkan di antara epitop dan protein yang ditandai, dapat
meminimalkan masalah seperti itu dan meningkatkan aksesibilitas epitop ke
antibodi (Borjigin dan Nathans 1994; Sabourin et al. 2007).
Kami dan yang lain sebelumnya membuat vektor ekspresi generasi pertama
untuk Neurospora dengan tag epitope seperti FLAG, hemagglutinin (HA), Myc,
protein fluorescent hijau (GFP), dan protein fluoresen merah, tetapi situs kloning dan
fitur lainnya tidak selalu konsisten ( Freitag et al. 2004b; Freitag dan Selker 2005;
Dia et al. 2005; Dementhon et al. 2006; Kawabata dan Inoue 2007). Dengan
demikian sulit untuk menghasilkan konstruksi tag yang berbeda, seperti yang
umumnya diperlukan untuk mendapatkan protein tag-epitop yang berfungsi penuh
dan dapat dideteksi karena kekhasan epitop spesifik yang ditempatkan pada termini
C atau N (Booher dan Kaiser 2008; Sung et al. 2008). Di sini kami melaporkan
standar, vektor multi-tujuan canggih yang menyederhanakan konstruksi serentak
dari keluarga konstruksi ekspresi yang ditandai dengan epitop.
Material Dan Metode
Strain neurospora dan isolasi DNA genom: Strain N. crassa yang
digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam informasi pendukung,
Tabel S1 dan ditanam, dipelihara, dan dilintasi sesuai dengan prosedur
standar yang diterbitkan (Davis 2000). Untuk isolasi DNA genomik, strain
Neurospora ditumbuhkan dengan pengocokan dalam medium minimal
Vogel dengan sukrosa 1,5% dan diperlukan suplemen pada suhu 32 °
selama 2 hari; DNA genom diisolasi dan digunakan untuk PCR dan
hibridisasi Selatan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Freitag et al.
2004a).
Konstruksi vektor antar-ragi yang mengandung tautan 10xGly: Semua
primer dan oligonukleotida sintetis yang digunakan dalam penelitian ini
tercantum pada Tabel S2. Oligonukleotida sintetis # 1790 dan # 1791,
yang mengandung urutan linker 10xGly, situs EcoRI di satu sisi, dan situs
PacI diikuti oleh situs HindIII di ujung lainnya, diinkubasi pada suhu kamar
selama 30 menit setelah dididihkan selama 5 menit. Oligonukleotida anil
dicerna dengan EcoRI dan HindIII dan dimasukkan ke dalam vektor yeast
shuttle pRS416 (NEB) yang dicerna oleh EcoRI + HindIII, menghasilkan
pRS416-10xGly.
 Konstruksi vektor penargetannya-3 yang mengandung tag C-terminal 3xFLAG atau HAT – FLAG: Kami
memperkuat sebuah fragmen yang mengandung urutan 3xFLAG oleh PCR menggunakan vektor p3xFLAG
CMV14 (Sigma) sebagai templat dengan forward primer # 2014 yang mengandung situs PacI dan reverse
primer # 2015 yang mengandung situs EcoRI. Produk PCR dicerna dengan PacI dan EcoRI dan dimasukkan
ke dalam PacM + EcoRI-dicerna pMF270, yang merupakan vektor penargetan-3 yang berisi tag epitop C-
terminal 3xHA-epitope. Dengan cara ini, kami mengganti tag 3xHA dengan tag 3xFLAG, menghasilkan
pCCG∷C-3xFLAG. Dalam beberapa kasus, kurang dari 10 glisin dimasukkan dalam tautan poli-glisin untuk
membuat konstruksi praktis. Untuk membuat vektor yang berisi tag HAT∷5xGly∷FLAG, sebuah fragmen
yang berisi tag HAT diamplifikasi oleh PCR dari vektor pHAT10 (Clontech) dengan forward primer # 2036,
yang berisi situs PvuI, dan membalikkan primer # 2037, yang berisi linker 5xGly dan situs PacI diikuti oleh
situs XhoI. Fragmen PCR dicerna dengan XhoI dan PvuI dan dimasukkan ke pRS416-10xGly dicerna dengan
XhoI dan PacI, yang menghasilkan ujung yang kompatibel dengan PvuI, menghasilkan pRS416-10xGly-HAT-
5xGly. Sebuah fragmen yang berisi tag HAT∷5xGly∷FLAG dibuat oleh PCR menggunakan pRS416-10xGly-
HAT-5xGly sebagai templat dengan forward primer # 1939, yang berisi urutan 1xFLAG diikuti oleh situs
PacI, dan sebaliknya primer # 1940, yang berisi Situs AscI. Produk PCR dicerna dengan PacI dan AscI dan
dimasukkan ke pMF270 yang dicerna PacI + AscI, menghasilkan pCCG∷C-HAT∷FLAG.

Konstruksi vektor penargetannya-3 yang berisi tautan 10xGly diikuti oleh tag C-terminal 3xFLAG, GFP,
atau HAT-FLAG: Kami memperkuat fragmen yang berisi tag 3xFLAG oleh PCR menggunakan vektor p3xFLAG
CMV14 (Sigma) sebagai templat dengan forward primer # 2084, yang berisi 10xGly linker plus situs PacI,
dan membalikkan primer # 2015, yang berisi situs EcoRI. Produk PCR dicerna dengan PacI dan EcoRI dan
dimasukkan ke pMF270 yang dicerna PacI + EcoRI untuk mengganti tag 3xHA dengan tag 10xGly∷3xFLAG,
menghasilkan pCCG∷C-Gly∷3xFLAG. pCCG∷C-Gly∷GFP, yang merupakan vektor penargetan-3-nya yang
mengandung 10xGly linker diikuti oleh tag GFP pada terminal C-nya, dihasilkan dengan cara yang sama
menggunakan forward primer # 2085, reverse primer # 2086, dan pMF272 (Freitag et al . 2004b) sebagai
templat. Sebuah fragmen yang berisi tag 10xGly∷HAT∷5xGly∷FLAG diamplifikasi oleh PCR dengan forward
primer # 1938 yang mengandung situs PacI, primer terbalik # 1940 yang mengandung situs AscI, dan
pRS416-10xGly-HAT-5xGly sebagai templat. Produk PCR dicerna dengan PacI dan AscI dan dimasukkan ke
dalam PacI + AscI-dicerna pMF270, menghasilkan pCCG∷C-Gly∷HAT∷FLAG.
 Konstruksi vektor penargetannya-3 yang berisi tag N-terminal 3xFLAG, GFP, 3xMyc, 3xHA, atau FLAG – HAT diikuti oleh
penghubung poli-glisin: Kami memperkuat sebuah fragmen yang berisi promotor Neurospora ccg-1 (Pccg-1) (McNally
and Free 1988) oleh PCR dari pMF270 dengan forward primer # 1954, yang berisi situs EcoRI, dan primer pembalik #
1953, yang berisi situs BamHI. Produk PCR dicerna dengan EcoRI dan BamHI dan dimasukkan ke dalam pBM61 yang
dicerna dengan enzim restriksi yang sesuai (Margolin et al. 1997), menghasilkan pCCG-N. Untuk mendapatkan fragmen
yang berisi tag FLAG diikuti oleh tag HAT, kami memperkuat urutan tag HAT oleh PCR dari vektor pCCG∷C-HAT∷FLAG
dengan forward primer # 1967, yang berisi situs BamHI diikuti oleh kodon awal (ATG) ), urutan FLAG tunggal, dan linker
3xGly, dan membalikkan primer # 1946, yang berisi urutan ekor 5xGly diikuti oleh situs AscI, PacI, dan SpeI. Produk-
produk PCR dicerna dengan BamHI dan SpeI dan dimasukkan ke dalam pCCG-N yang dicerna BamHI +, menghasilkan
pCCG∷N-FLAG∷HAT. Sebuah fragmen yang berisi tag 3xFLAG diamplifikasi oleh PCR dari pCCG∷C-FLAG dengan forward
primer # 2341, yang berisi situs BamHI diikuti oleh kodon start (ATG), dan reverse primer # 2342, yang berisi linker
8xGly diikuti oleh Situs AscI. Produk PCR dicerna dengan BamHI dan AscI dan dimasukkan ke dalam pCCG∷N-FLAG∷HAT
yang dicerna dengan enzim restriksi yang sesuai untuk menggantikan tag FLAG∷HAT dengan tag 3xFLAG, menghasilkan
pCCG∷N-3xFLAG. pCCG∷N-GFP dan pCCG∷N-3xMyc, yang merupakan vektor penargetannya-3 dengan N-terminal GFP
atau tag 3xMyc yang diikuti oleh 8xGly linker, dihasilkan dengan cara yang sama menggunakan primer forward # 2343,
reverse primer # 2344, dan pMF272 sebagai template atau meneruskan primer # 2345, membalikkan primer # 2346,
dan pMF276 sebagai templat. Untuk menghasilkan pN-3xHA, sebuah fragmen yang mengandung tag 3xHA diamplifikasi
oleh PCR dari pMF270 dengan forward primer # 2347, yang berisi situs BglII, dan membalikkan primer # 2348 dan
kemudian dimasukkan ke dalam pBM61 SmaI + SpeI-digested.

Konstruksi vektor untuk menargetkan dim-2-3xFLAG atau hpo-gfp ke lokus-3-nya: Segmen 500-bp dari dim-2,
termasuk daerah promotor, diamplifikasi oleh PCR dengan forward primer # 1970, yang berisi situs NotI dan primer
terbalik # 2087, yang berisi situs XbaI. Produk PCR dan vektor pCCG∷C-3xFLAG dicerna dengan NotI dan XbaI dan diikat
untuk mengganti Pccg-1 dengan promotor dim-2. Plasmid yang mengandung promotor dim-2 kemudian dicerna dengan
XbaI dan PacI dan diikat dengan sebuah fragmen yang berisi daerah pengkodean gen dim-2, yang telah diamplifikasi
oleh PCR dari DNA genom Neurospora dengan forward primer # 1517, yang berisi suatu Situs XbaI, membalikkan primer
# 1518, yang berisi situs PacI, dan dicerna dengan XbaI dan PacI. Untuk konstruksi HP1, wilayah promotor 500-bp hpo
diamplifikasi oleh PCR dengan primer # 2066 dan # 2067. Wilayah pengkodean hpo dipotong dari pMF308 (Freitag et al.
2004a) melalui pencernaan dengan BamHI dan XbaI. Kedua fragmen dimasukkan ke dalam pCCG∷C-GFP. Konstruksi
untuk HP1 dan FLAG-tagged GFP-tagged DIM-2 yang dilinearisasi dan dimasukkan pada lokus-3 nya dari strain hpo
N3395 dan dim-2 null mutan N3396, masing-masing, dengan metode penggantian gen yang dijelaskan sebelumnya
(Margolin et al. 1997).
 Konstruksi vektor knock-in yang mengandung 10xGly linker diikuti oleh tag 3xFLAG, 3xHA, GFP, atau 13xMyc di
terminal C dan gen hph diapit oleh urutan loxP: Kami memperkuat sebuah fragmen yang mengandung gen hph bakteri,
yang memberikan resistensi higromisin (hygR) di Neurospora, dari pCSN44 (Staben et al. 1989) oleh PCR dengan
forward primer # 1977, yang berisi situs SpeI, dan membalikkan primer # 1976, yang berisi urutan loxP diikuti oleh situs
BamHI. Produk PCR dicerna dengan SpeI dan BamHI dan dimasukkan ke dalam vektor yang dicerna SpeI + BamHI
pZErO-2 (Clontech), menghasilkan pZErO-hph∷loxP. Untuk menyisipkan tag epitope dan 10xGly linker untuk pembuatan
modul knock-in, pertama-tama kami membuat konstruksi yang mengandung gen hpo dengan 10xGly linker diikuti oleh
tag epitope dan kemudian menggunakannya sebagai templat untuk PCR. Sebuah fragmen wilayah pengkodean hpo
dengan promotornya diperkuat oleh PCR dari DNA genom Neurospora N623 dengan forward primer # 2040, yang berisi
situs BamHI, dan reverse primer # 2041, yang berisi situs MfeI. Produk PCR dicerna dengan BamHI dan MfeI dan
dimasukkan ke pRS416-10xGly antara situs BamHI dan EcoRI (ujungnya kompatibel dengan yang dihasilkan oleh MfeI),
menghasilkan pRS416-HP1∷10xGly. Sebuah fragmen yang mengandung gen hpo dengan ekor 10xGly dipotong dari
pRS416-HP1∷10xGly oleh pencernaan NotI dan PacI dan dimasukkan ke pCCG∷C-3xFLAG, pMF270, pMF272, atau
pMF276 antara situs NotI dan PacI, menghasilkan pHP1∷ 10xGly∷3xFLAG, pHP1∷10xGly∷3xHA, pHP1∷10xGly∷GFP, atau
pHP1∷10xGly∷13xMyc, masing-masing. Akhirnya, kami menggunakan forward primer # 1979, yang mengandung situs
XhoI, dan reverse primer # 1978, yang berisi urutan loxP diikuti oleh situs XbaI, untuk memperkuat tag 10xGly dan
epitope dari pHP1∷10xGly∷3xFLAG, pHP1∷10xGly∷3xHA , pHP1∷10xGly∷GFP, atau pHP1∷10xGly∷13xMyc. Produk PCR
kemudian dicerna dengan XhoI dan XbaI dan dimasukkan ke pZErO-hph∷loxP antara situs XhoI dan SpeI (overhang
kompatibel dengan XbaI), menghasilkan p3xFLAG∷hph∷loxP, p3xHA∷hph∷loxP, pGFP∷hph∷lox,, atau p13xMyc∷hph∷loxP,
masing-masing.

Rekayasa protein yang ditandai dengan epitop untuk ekspresi gen di tempat asal mereka: Kami memodifikasi
prosedur knock-out gen (Colot et al. 2006) untuk berfungsi sebagai strategi knock-in yang nyaman untuk gen
Neurospora. Kami menggunakan konstruksi plasmid yang dimediasi rekombinasi di S. cerevisiae (Oldenburg et al. 1997)
untuk membuat kaset knock-in. Sistem ini bekerja dengan baik: 58 dari 66 transforman (87,9%) dari 12 konstruksi
berbeda ditemukan telah menghasilkan kaset yang dimaksud. Strain ragi ditumbuhkan dan dipelihara menurut Yeast
Protocol Handbook (Clontech), dan strain S. cerevisiae PJ69-4A digunakan sebagai strain inang (James et al. 1996).
Untuk kaset knock-in DIM-2-FLAG, pRS416 dilinearisasi oleh pencernaan dengan BamHI dan EcoRI, dan modul knock-in
3xFLAG (3xFLAG∷loxP∷hph∷loxP) diisolasi dari p3xFLAG∷hph∷loxP oleh pencernaan dengan KpnI dan XhoI. Sebuah
fragmen 1-kb termasuk 3 end-ujung wilayah pengkodean dim-2, tanpa kodon stop, diamplifikasi oleh PCR dengan
forward primer # 1988, yang berisi 29 nt homologi pada salah satu ujung pRS416 yang dilinearisasi, dan membalikkan
primer # 2013, yang berisi 29 nt homologi pada ujung 5 of dari modul knock-in 3xFLAG. Sebuah fragmen 500-bp dari
daerah mengapit 3 ′ dim-2 diamplifikasi dengan forward primer # 1989, yang berisi 29 nt homologi dengan ujung 3 end
dari modul knock-in 3xFLAG, dan reverse primer # 1990, yang berisi 29 nt homologi pada ujung pRS416 yang
dilinearisasi. Strain ragi PJ64-4A diubah secara cotransformasi dengan pRS416 linier, modul knock-in 3xFLAG, dan dua
produk PCR untuk perakitan dalam ragi dengan menggunakan sistem rekombinasi homolog endogen (Oldenburg et al.
1997). Plasmid diekstraksi dari transforman yang terkumpul dan dimasukkan ke dalam sel Escherichia coli DH5α dengan
elektroporasi. Kaset yang benar dipotong oleh pencernaan dengan XhoI dan XbaI dan diubah menjadi Δmus-52
Neurospora strain (N2930) dengan elektroporasi. Langkah-langkah selanjutnya dilakukan seperti yang dijelaskan (Colot
et al. 2006). Kaset knock-in HP1 – GFP dihasilkan dengan cara yang sama dengan menggunakan primer: # 1996, #
1997, # 1998, dan # 1999.
 Konstruksi strain dengan cre recombinase digerakkan oleh Pccg-1 di lokus-3-nya:
Gen cre recombinase dari bacteriophage P1 diamplifikasi oleh PCR dari plasmid HZ-73
(pemberian H. Zong) dengan forward primer # 2459, yang berisi situs XbaI, dan
reverse primer # 2460, yang berisi situs EcoRI. Produk tersebut kemudian dicerna
dengan XbaI dan EcoRI dan dimasukkan ke dalam pCCG∷C-3xFLAG antara situs XbaI
dan EcoRI, menghasilkan pCCG∷Cre. Plasmid ini kemudian dilinearisasi oleh
pencernaan dengan DraI dan dimasukkan pada lokus-3 strain-nya (N3322) yang
mengandung kaset hpo-gfp∷loxP∷hph + ∷loxP dengan metode penggantian gen kami
(Margolin et al. 1997). Sepuluh transforman dipastikan memiliki kejadian integrasi
yang benar dengan Southern blotting dan digunakan untuk analisis lebih lanjut.

Visualisasi HP1 – GFP dengan mikroskop fluoresensi: Suspensi konidia terlihat pada
kaca geser dan segera ditutup dengan kaca penutup. Gambar diambil menggunakan
mikroskop fluoresensi Axioplan2 dan kamera digital AxioCam HRm (Carl Zeiss,
Thornwood, NY).

Konstruksi strain yang mengandung hpo-HAT-FLAG di lokus-3-nya: Sebuah fragmen

yang mengandung gen hpo dengan ekor 10xGly dipotong dari pRS416-HP1∷10xGly
oleh pencernaan dengan NotI dan PacI dan dimasukkan ke pCCG∷C-HAT∷FLAG antara
situs NotI dan PacI, menghasilkan pHP1∷HAT∷FLAG. Konstruk HP1-HAT-FLAG
dilinearisasi oleh pencernaan dengan SapI dan NheI dan disisipkan di lokus HPO-
N2556-nya dengan penggantian gen. Integrasi yang benar dan metilasi DNA yang
tepat dikonfirmasi untuk transforman dengan Southern blotting, dan strain
homokaryotik (N3278) dipilih untuk penelitian selanjutnya.
 Pengujian Co-IP: Strain N. crassa ditanam pada suhu 32 ° dengan
goncangan dalam tabung kaca 20x150-mm yang mengandung 7 ml media
minimal Vogel dengan sukrosa 1,5% dan histidin. Setelah 16 jam, jaringan
dipanen dengan filtrasi, dicuci dalam PBS [10 mm fosfat, pH 7,4, 137 mm
KCl], dan 2,7 mm KCl] dan disuspensikan dalam 1 ml buffer lisis dingin-dingin
[50 mm HEPES, pH 7,5, 150 mm NaCl, 10% gliserol, 0,02% NP40, EDTA 1 mm,
1 μg / ml leupeptin, 1 μg / ml pepstatin A, dan 1 mm PMSF]. Ekstrak disonikasi
(Branson Sonifier 450) tiga kali pada interval 10 menit selama 20 detik
dengan siklus kerja 80 dan output diatur ke 2. Setelah sentrifugasi pada
12.000 rpm selama 10 menit dalam microfuge, alikuot supernatan diinkubasi
dengan 10 μl gel afinitas anti-FLAG M2. Kompleks imun dicuci dua kali dalam
buffer lisis dan ditangguhkan dalam buffer sampel SDS. Sampel dipisahkan
oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF dalam 48 mm Tris, 39 mm
glisin (pH 9,2) yang mengandung 20% ​metanol pada 150 mA selama 2 jam.
Membran diblokir dalam 10 mm Tris, pH 7,5, 150 mm NaCl, dan 0,05% Tween
20 (TBS-Tween) yang mengandung 3% susu bubuk skim selama 30 menit dan
diinkubasi dengan antibodi anti-FLAG M2 di TBS-Tween yang mengandung
skim 3% susu dan antibodi anti-GFP (ab290, Abcam) di TBS-Tween yang
mengandung 3% BSA selama 2 jam pada suhu kamar. Protein yang ditandai
ditandai dengan menggunakan antibodi sekunder horseradish-peroxidase-
conjugated dan substrat chemiluminescent SuperSignal West Femto (Pierce)
seperti yang diinstruksikan oleh produsen.
Hasil Pengamatan
Konstruksi vektor entri dengan tautan yang fleksibel dan vektor baru untuk
penandaan epitop C-terminal: Kami sebelumnya melaporkan konstruksi vektor
ekspresi GFP (pMF272; Gambar 1A) dan menunjukkan kegunaannya dalam
Neurospora (Freitag et al. 2004a, b). Vektor penargetannya yang ke-3 ini dibangun
untuk mengekspresikan GFP di bawah kendali Neurospora ccg-1 promotor (Pccg-1),
yang secara kuat diinduksi oleh kekurangan atau stres glukosa (McNally dan Free
1988). Vektor serupa dihasilkan untuk epitop yang berbeda: tag 3xHA (pMF270), tag
13xMyc (pMF276), tag 3xFLAG (pCCG∷C-3xFLAG), dan tag tandem HAT-FLAG
dengan linker 5xGly (pCCG∷C-HAT∷FLAG) , seperti yang diilustrasikan pada Gambar
1A. Semua vektor berisi beberapa situs kloning (MCS) yang sama diikuti oleh urutan
tag epitope dan kodon penghentian dalam bingkai; dengan demikian, gen yang
menarik yang diamplifikasi dengan pasangan primer dapat dimasukkan secara
bersamaan ke beberapa vektor ekspresi ini. Pccg-1 sangat berguna untuk visualisasi
protein fusi GFP di Neurospora karena kekuatannya (Freitag et al. 2004b), dan
promotor ini membantu dalam mendeteksi protein yang tidak dapat terdeteksi
ketika diekspresikan di bawah kendali promotor endogen mereka. Ekspresi berlebih
dapat menyebabkan efek artifaktual (Rigaut et al. 1999). Karena itu, kami membuat
plasmid sehingga Pccg-1 dapat diganti dengan gen yang diminati dengan promotor
endogennya menggunakan situs NotI dan MCS, yang mengapit Pccg-1.
 Entri dan vektor ekspresi generasi pertama. (A) Peta parsial dari vektor ekspresi
pCCG∷C-3xFLAG (aksesi GenBank no. FJ456996), pMF270 (3xHA) (FJ456997), pMF272
(GFP) (AY598428) (Freitag et al. 2004b), pMF276 (13) FJ456998), dan pCCG∷C-
HAT∷FLAG (FJ456999) dan urutan MCS mereka. Situs pembatasan unik digaris bawah
dan ditunjukkan oleh bilah vertikal. Rangkaian vektor ini berisi promotor N. crassa
ccg-1 (Pccg-1) (McNally dan Free 1988) dan MCS diikuti oleh 3xFLAG, 3xHA, GFP,
13xMyc, atau 1xFLAG∷5xGly∷HAT. Gen yang menarik dapat dimasukkan ke MCS atau
disisipkan dengan promotor endogennya antara situs NotI dan MCS, menggantikan
Pccg-1. Sekuens sisi-3 mengapitnya memungkinkan konstruk ditargetkan ke lokus N.
crassa his-3 (Margolin et al. 1997). (B) Peta dan urutan MCS vektor entri pRS416-
10xGly (FJ457000). Kotak ini menandai tautan fleksibel 10xGly. Gen yang menarik
dapat dimasukkan ke MCS menggunakan enzim restriksi atau dengan rekombinasi
homolog dalam ragi (Oldenburg et al. 1997). Situs PacI cutter 8-base dimasukkan
 Kami sebelumnya mencatat bahwa fusi GFP terminal-C dengan gen
Neurospora tidak selalu berhasil. Tidak jarang ditemukan ekspresi
protein fusi GFP yang tidak terdeteksi meskipun diekspresikan
berlebihan oleh Pccg-1 (Freitag et al. 2004b). Salah satu dari sejumlah
alasan untuk ini adalah bahwa tag GFP dapat memengaruhi pelipatan
protein yang ditandai, yang mengakibatkan ketidakstabilan protein fusi
GFP. Penghubung protein fleksibel dapat digunakan untuk
meningkatkan lipatan dan fungsi protein yang ditandai dengan epitop
(Sabourin et al. 2007). Oleh karena itu kami membuat vektor entri
yang mengandung linker poli-glisin fleksibel (10xGly). Kami
memasukkan poly-glycine linker yang fleksibel ke dalam vektor shuttle
ragi pRS416 untuk menghasilkan pRS416-10xGly (Gambar 1B). Setelah
subkloning ke dalam vektor entri, gen yang diminati dengan
penghubung poli-glisin dapat dengan mudah ditransfer ke serangkaian
vektor ekspresi penandaan epitop yang dibuat, yang berisi situs MCS
dan PacI yang sama. Gen dapat dimasukkan ke dalam pRS416-10xGly
oleh sistem subkloning konvensional dengan menggunakan situs
enzim restriksi dalam MCS atau dengan menggunakan sistem
rekombinasi homolog ragi (Oldenburg et al. 1997).
 Vektor baru untuk penandaan epitop N- dan C-terminal
dengan tautan fleksibel: Sistem entri vektor yang
dijelaskan di atas memungkinkan seseorang untuk
mengambil keuntungan dari vektor yang dihasilkan
sebelumnya seperti pMF272 tetapi membutuhkan dua
langkah kloning. Untuk mempercepat konstruksi untuk
mengekspresikan protein dengan tag epitope dengan
poly-glycine linker yang fleksibel, kami menghasilkan
vektor baru yang mengandung poly-glycine linker dan
epitop alternatif 3xFLAG (pCCG∷C-Gly∷3xFLAG) dan GFP
(pCCG∷C-Gly ∷GFP) atau kombinasi HAT – FLAG yang
dipisahkan oleh tautan fleksibel (pCCG∷C-
Gly∷HAT∷FLAG) (Gambar 2A). Vektor linker fleksibel ini
menampilkan fitur-fitur vektor generasi pertama
(Gambar 1A dan and2A), 2A), yang memungkinkan gen
yang dimasukkan ke dalam vektor yang dihasilkan
sebelumnya untuk langsung ditransfer ke vektor
ekspresi baru.
Vektor ekspresi lanjutan dengan tag epitop N- atau C-terminal dan tautan fleksibel poli-glisin. (A) Peta
parsial dari vektor ekspresi tag epitop terminal-C pCCG∷C-Gly∷3xFLAG (FJ457001), pCCG∷C-Gly∷GFP
(FJ457002), dan pCCG∷C-Gly∷HAT∷FLAG (FJ457003) dan urutan MCS mereka. Situs pembatasan unik
digarisbawahi dan ditunjukkan oleh bilah vertikal. Semua vektor mengandung promotor N. crassa ccg-
1 (Pccg-1) (McNally dan Free 1988), MCS, dan penghubung poli-glisin dalam bingkai dan arah yang
sama. (B) Peta parsial dari vektor ekspresi tag-terminal epitope-pCCG∷N-3xFLAG (FJ457004), pCCG∷N-
3xMyc (FJ457005), pCCG∷N-GFP (FJ457006), pCCG∷N-FLAG∷HAT ( FJ457007), dan pN-3xHA (FJ457008)
dan urutan MCS mereka. Situs pembatasan unik digarisbawahi dan ditunjukkan oleh bilah vertikal.
Semua vektor kecuali pN-3xHA mengandung Pccg-1, dan pN-3xHA memiliki situs ApaI, EcoRI, dan BglII
(ujungnya kompatibel dengan yang dihasilkan oleh BamHI) untuk pengenalan Pccg-1 atau promotor
gen yang diminati. Semua vektor berisi linker poli-glisin dan MCS dalam bingkai dan arah yang sama.
 Dalam beberapa kasus, tag epitope terminal-C mengganggu fungsi protein, misalnya, dengan mengganggu situs
penargetan atau modifikasi pasca-translasi yang berdekatan dengan terminal C, bahkan ketika disertakan tautan
fleksibel (Booher dan Kaiser 2008). Untuk menghadapi situasi seperti itu, kami membuat serangkaian vektor ekspresi
baru untuk penandaan epitop N-terminal dengan 3xFLAG (pCCG ∷N-3xFLAG), 3xMyc (pCCG ∷N-3xMyc), GFP
(pCCG∷N-GFP), dan 3xHA (pN-3xHA) diikuti oleh rantai delapan-Gly. Kami juga membangun vektor tag TAP N-
terminal: 1xFLAG∷3xGly∷HAT∷5xGly (pCCG∷N-FLAG ∷HAT) (Gambar 2B). Plasmid ini semuanya cocok untuk
penargetan ke-3 dan semua kecuali pN-3xHA mengandung Pccg-1. Promotor ini dapat diganti dengan promotor asli
gen yang diminati dengan menggunakan situs EcoRI atau ApaI dan situs BamHI. Dalam kasus pN-3xHA, Pccg-1 atau
promotor asli dapat dimasukkan antara situs EcoRI atau ApaI dan situs BglII (yang menghasilkan ujung yang
kompatibel dengan BamHI; urutan 3xHA pada pN-3xHA berisi situs BamHI) . Semua vektor mengandung MCS identik
dalam bingkai yang sama sehingga gen yang menarik dapat dengan mudah dimasukkan ke beberapa vektor ekspresi
ini pada waktu yang bersamaan.

Ekspresi protein yang ditandai oleh epitop dari gen di lokasi kromosom aslinya: Vektor yang
dijelaskan memiliki tulang punggung umum yang cocok untuk menargetkan ke Neurospora-3, mirip
dengan vektor pBM61 yang umum digunakan dan turunannya (Margolin et al. 1997). Kami juga
mengembangkan vektor ekspresi untuk penggantian gen dengan mengambil keuntungan dari defisiensi
mutan untuk NHEJ (Δmus-51 atau Δmus-52) (Ninomiya et al. 2004). Memanfaatkan sistem rekombinasi
homolog ragi (Oldenburg et al. 1997), kami pertama-tama menghasilkan modul knock-in yang berisi tag
epitope dengan linker poli-glikin yang fleksibel diikuti oleh hph marker yang dapat dipilih, diapit oleh
situs loxP (Gambar 3A). Idenya adalah untuk menggunakan sistem Cre / loxP untuk menghapus gen hph
setelah itu tidak lagi diperlukan, memungkinkan penanda yang berharga untuk "didaur ulang." Vektor
dengan empat tag epitop (3xFLAG, 3xHA, GFP, dan 13xMyc) dibuat untuk memungkinkan modul untuk
ditransfer dari salah satu dari mereka (p3xFLAG∷hph∷loxP, p3xHA∷hph∷loxP, pGFP∷hph∷loxP, atau
p13xMyc∷hph∷loxP) melalui pencernaan dengan XhoI dan KpnI. Semua modul berisi urutan identik ujung
5′ dan 3′, memungkinkan konstruksi empat kaset pengetuk tag epitope dengan primer umum yang
dirancang untuk bekerja dengan sistem rekombinasi homolog ragi. Untuk ekspresi bakteriofag Cre
recombinase di Neurospora, kami menghasilkan pCCG∷Cre penargetannya yang 3, yang memungkinkan
cre diekspresikan di bawah kendali Pccg-1 di lokusnya yang ke-3. Skema ini diilustrasikan pada Gambar
3 dan dijelaskan secara rinci dalam bahan dan metode. Singkatnya, fragmen segera sebelum dan
sesudah kodon berhenti dari gen target diamplifikasi dengan empat primer berisi sekuens yang
memungkinkan untuk perakitan dalam vektor antar-jemput ragi pRS416. Dua produk PCR, pRS416 linier,
dan modul knock-in terisolasi dirakit dalam ragi menggunakan sistem rekombinasi endogen. Kaset
knock-in melingkar diisolasi dari ragi, diperkuat, linierisasi, dan diperkenalkan ke Neurospora, memilih
 Strategi membuat konstruksi knock-in yang
mengandung tag epitop C-terminal dan
memungkinkan untuk dilakukan eksisi marker hph
yang dapat dipilih dengan menggunakan sistem Cre
/ loxP di Neurospora. Prosedur knock-in dimodifikasi
dari prosedur knock-out gen yang dijelaskan oleh
Colot et al. (2006). (A) Peta parsial
p3xFLAG∷hph∷loxP (FJ457009), p3xHA∷ hph∷loxP
(FJ457010), pGFP∷ hph∷loxP (FJ457011), dan
p13xMyc∷ hph∷loxP (FJ457012). Modul epitope tag∷
hph∷loxP, yang berisi 10xGly linker dan tag epitope
diikuti oleh hph (congring hygR) diapit oleh situs
loxP (L), diisolasi dengan pencernaan dengan XhoI
dan KpnI. (B) Untuk membangun konstruksi knock-
in kustom, ujung terminal C dari gen target, tanpa
kodon stop, dan daerah mengapit 3 arenya
diperkuat oleh PCR dari DNA genomik dengan
primer Cf + Cr dan 3f + 3r, masing-masing. . Primer
Cf dan 3r berisi 29 nt identitas ke vektor shuttle ragi
pRS416, dan primer Cr dan 3f berisi 29 nt yang
sama dengan setiap ujung modul knock-in. Urutan
yang sama berfungsi di semua modul sehingga
primer yang sama (Cf, Cr, 3f, dan 3r) berfungsi
untuk membuat kaset knock-in dengan salah satu
tag epitope. Dua produk PCR, modul, dan pRS416
yang dilinearisasi ditransformasi menjadi ragi untuk
dirakit dengan rekombinasi homolog (Oldenburg et
al. 1997). Plasmid sirkular yang mengandung kaset
knock-in diekstraksi dari transforman dan
diamplifikasi dalam E. coli. Kaset knock-in kemudian
diisolasi dan dimasukkan ke dalam strain
Neurospora Δmus-52. Strain Knock-in dipilih
berdasarkan pertumbuhan pada medium yang
mengandung hygromycin. Integrasi yang benar dari
kaset knock-in dan ekspresi protein yang ditandai
 Untuk mendemonstrasikan sistem yang dijelaskan, kami menyiapkan dua kaset knock-in,
kaset hpo-gfp∷loxP∷hph∷loxP dan kaset redup-2-3xFLAG∷loxP∷hphPloxP, untuk menghasilkan
HP1 yang ditandai dengan GFP (HP1-GFP) ) dan 3xFLAG-tagged DIM-2 (DIM-2-FLAG) di lokus
endogennya. Kedua kaset itu secara terpisah dimasukkan ke dalam Δmus-52 strain penerima
dan kemudian disilangkan dengan strain mus-52 + untuk memulihkan keturunan dengan alel
tipe liar. Kami mengkonfirmasi integrasi yang benar dari urutan knock-in dengan Southern
blotting (Gambar 4, A dan B) dan mengkonfirmasi ekspresi yang tepat oleh Western blotting
dengan antibodi yang spesifik untuk masing-masing tag epitope (lihat Gambar 6). Selain itu,
kami mengkonfirmasi bahwa metilasi DNA tampak normal di beberapa daerah yang dimetilasi
(data tidak ditampilkan), menunjukkan bahwa protein yang ditandai berfungsi karena baik
DIM-2 dan HP1 sangat penting untuk metilasi DNA di Neurospora (Kouzminova dan Selker
2001; Freitag et al . 2004a). Untuk mengeluarkan hph, pCCG∷Cre yang dilinearisasi
dimasukkan ke dalam strain yang berisi kaset hpo-gfp∷loxP∷hph∷loxP. Sepuluh transforman
diisolasi dan menunjukkan integrasi cre yang benar dengan Southern blotting (data tidak
ditampilkan). Dua di antaranya ditampilkan eksisi hph lengkap dan tepat (Gambar 4, A dan B);
tiga menunjukkan campuran inti dengan dan tanpa eksisi yang tepat; lima sisanya
mempertahankan gen (data tidak ditampilkan). Konsisten dengan data ini, kami menemukan
bahwa dua strain yang menunjukkan eksisi lengkap mengembalikan sensitivitas terhadap
hygromycin (Gambar 4C); yang lain tidak (data tidak ditampilkan). Salah satu dari dua
transforman yang sensitif terhadap hygromycin tampaknya homokaryotik sehubungan dengan
penyisipan cre; yang lain tampak heterokariotik. Strain yang tidak sensitif terhadap
hygromycin menunjukkan berbagai integrasi cre dan tidak mengungkapkan hubungan yang
jelas antara sifat integrasi cre dan keberhasilan eksisi hph. Anehnya, strain homokaryotic
untuk insersi cre ditampilkan pertumbuhan dan cacat konidiasi terlepas dari apakah mereka
menunjukkan eksisi sedangkan strain yang muncul heterokaryotik untuk cre, tetapi berhasil
dieksekusi hph, menunjukkan pertumbuhan dan perkembangan yang normal. Pertumbuhan
normal dan konidiasi dipulihkan dengan menghilangkan cre dengan menyilang dengan strain
cre−. Visualisasi mikroskopis HP1-GFP dalam galur yang dieksisi hph menunjukkan lokalisasi
normal HP1-GFP (Gambar 4D). Data ini menunjukkan bahwa sistem Cre / loxP dapat bekerja di
Neurospaora.
Penerapan sistem Cre / loxP untuk mengeksisi penanda jam di Neurospora. (A) Skema lokus hpo tipe
liar dan lokus hpo setelah integrasi kaset knock-in yang berisi gfp diikuti oleh penanda hph diapit
oleh situs loxP (kaset knock-in HP1-GFP) dan setelah pemotongan marker hph dengan
memperkenalkan cre recombinase (lihat bahan dan metode). Fragmen DNA yang dihasilkan oleh
pencernaan dengan NgoMIV dan PvuII ditunjukkan oleh panah, dan daerah yang digunakan sebagai
probe untuk Southern blotting ditandai dengan batang horizontal. (B) Analisis selatan menunjukkan
integrasi kaset knock-in HP1-GFP di lokus hpo dan eksisi penanda hph dengan sistem Cre / loxP. DNA
genom yang diisolasi dari strain dengan (+) atau tanpa (-) hpo-tagged gfp dan / atau di hadapan (+)
atau tidak adanya (-) cre dicerna dengan NgoMIV dan PvuII dan digunakan untuk hibridisasi Selatan
dengan probe yang ditunjukkan. . (C) Sensitivitas terhadap hygromycin dalam strain yang
mengandung kaset knock-in hpo-gfp dikembalikan dengan memotong hph menggunakan sistem
Cre / loxP. Suspensi strain Conidia dengan (+) atau tanpa (-) konstruksi gfp-tag di hpo dan / atau di
hadapan (+) atau tidak adanya (-) cre disepuh pada media minimal (-) atau medium yang dilengkapi
dengan histidin ( + nya) atau hygromycin (+ hyg) dan tumbuh pada suhu 32 ° semalam. (D)
Lokalisasi HP1-GFP tidak terpengaruh oleh eksisi jam menggunakan sistem Cre / loxP. Konidia dari
 Tes Co-IP dari DIM-2 dan HP1 yang ditandai dengan epitop
yang diekspresikan di-3 atau di loci asli mengkonfirmasi
interaksi mereka. Ekstrak dari strain dengan atau tanpa (-)
gen dim-2 tag FLAG dan / atau gen hpo yang ditandai GFP
pada lokus-3 (His) atau lokus asalnya (N) di imunopresipitasi
dengan antibodi anti-FLAG. Sampel input dan
imunopresipitasi (IP) difraksinasi, dipindahkan ke membran
PVDF, dan immunoblotted dengan antibodi anti-FLAG atau
antibodi anti-GFP, seperti yang ditunjukkan. Strain yang
diuji, secara berurutan, adalah N3322, N3323, N3415,
N3418, dan N3436.
 Isolasi protein terkait HP1 menggunakan sistem pemurnian HAT-FLAG: Kami ingin mengembangkan
metode pemurnian yang efisien untuk mengidentifikasi protein yang terkait dengan protein yang
diminati Neurospora. Tag afinitas tandem telah terbukti bekerja secara efisien di berbagai organisme
(Chang 2006). Di antara berbagai tag TAP yang mungkin, sistem FLAG-6xHis menarik karena biaya
rendah dan efisiensinya yang tinggi. Pemurnian menggunakan tag HAT alami terbukti lebih unggul
dari yang menggunakan tag 6xHis sederhana, namun (Chaga et al. 1999), mendorong kami untuk
membangun HAT-FLAG kami, sistem vektor penargetannya 3 (Gambar 1A dan and2 ) .2). Untuk
menguji kegunaan sistem pemurnian HAT-FLAG kami, kami memutuskan untuk memurnikan HP1 yang
ditandai dan protein terkait karena penelitian kami sebelumnya menggunakan sistem dua-ragi telah
menunjukkan bahwa HP1 berinteraksi langsung dengan DIM-2 (Honda dan Selker 2008). Gen hpo
yang ditandai dengan HAT-FLAG dimasukkan di lokus-3-nya di bawah kendali promotor endogennya
dalam mutan hpo null. Kami mengkonfirmasi integrasi yang benar dengan Southern blotting dan
memilih transforman homokaryotik untuk percobaan lebih lanjut (data tidak ditampilkan). Cacat
metilasi DNA dari strain hpo ditemukan benar-benar dilengkapi oleh konstruk HP1-HAT-FLAG (data
tidak ditunjukkan), menunjukkan bahwa protein fusi berfungsi penuh. Kami kemudian memurnikan
HP1 yang ditandai dan protein terkait seperti yang digambarkan dalam Gambar 5A dan dirinci dalam
bahan dan metode. Secara singkat, ekstrak sel yang dibuat dari strain yang mengekspresikan HP1-
HAT-FLAG diaplikasikan pada resin afinitas TALON, dan HP1 yang ditandai dengan HAT-FLAG dan
protein terkaitnya dielusi dengan imidazol dan kemudian diinkubasi dengan gel afinitas anti-FLAG M2.
Bahan yang dimurnikan kemudian dielusi dalam buffer yang mengandung peptida FLAG, dipisahkan
oleh SDS-PAGE, dan divisualisasikan dengan pewarnaan biru Coomassie (Gambar 5B). Setiap pita
bernoda dipotong dan dikenakan spektrometri massa untuk identifikasi protein. Pita kuat yang sesuai
dengan prediksi berat molekul HP1 dipastikan sebagai protein ini (Gambar 5B); cakupan beberapa
peptida oleh spektrometri massa menggambarkan bahwa protein yang ditandai HAT-FLAG diisolasi
secara efisien (Gambar 5C). Kami juga menemukan beberapa protein terkait-HP1, termasuk DIM-2
(Gambar 5, B dan C), yang sangat mendukung kesimpulan kami sebelumnya bahwa DIM-2 dan HP1
berinteraksi langsung (Honda dan Selker 2008). Ini menunjukkan kegunaan sistem TAP HAT-FLAG kami
untuk Neurospora.
 Pemurnian protein terkait HP1 menggunakan sistem pemurnian HAT-FLAG. (A)
Skema pemurnian dan karakterisasi. Ekstrak sel dibuat dari strain yang
mengandung HP1-HAT-FLAG (N3278) dikenakan pemurnian afinitas dua langkah
(pemurnian afinitas logam Co2 + diikuti dengan pemurnian afinitas anti-FLAG). (B)
HP1 dan protein terkaitnya diisolasi oleh sistem pemurnian afinitas dua langkah
dipisahkan oleh SDS-PAGE dan divisualisasikan dengan pewarnaan biru Coomassie.
Berat molekul ditunjukkan di sebelah kiri. DIM-2 dan HP1 diidentifikasi dalam
fragmen gel yang dipotong sesuai dengan pita yang ditunjukkan di sebelah kanan
dan dilakukan analisis MS. (C) Identifikasi DIM-2 dan HP1 dengan analisis
spektrometri massa kromatografi cair-tandem (LC / MS / MS). Urutan asam amino,
massa, dan titik isoelektrik (pI) DIM-2 dan HP1 ditunjukkan. Peptida yang terdeteksi
 Verifikasi interaksi antara HP1 dan DIM-2 menggunakan penandaan,
penargetan, dan sistem knock-in kami: Setelah mengidentifikasi kandidat
protein yang terkait dengan protein yang ditandai TAP dengan kromatografi
afinitas, konfirmasi hubungan mereka dapat dicari dengan melakukan tes
Co-IP pada ekstrak sel yang mengekspresikan protein. Untuk memverifikasi
interaksi antara HP1 dan DIM-2, kami menggunakan sistem tag-epitope
kami. Kami menyiapkan strain yang mengekspresikan HP1-tagged GFP
(HP1-GFP) dan / atau 3xFLAG-tagged DIM-2 (DIM-2-FLAG) di bawah kendali
promotor endogen, yang ditargetkan pada his-3 atau ke lokus asalnya.
Untuk menjaga dari artefak ekspresi berlebih, penargetan ke-3 dilakukan
dengan strain dengan mutasi nol dari gen yang sesuai di lokus asli mereka.
Western blotting menunjukkan bahwa protein yang ditandai diekspresikan
secara merata dari lokus-3 dan lokus endogennya (Gambar 6, kiri). Semua
strain menunjukkan distribusi metilasi DNA yang normal, menunjukkan
bahwa protein yang ditandai fungsional (data tidak ditampilkan). Kami
menemukan bahwa HP1 secara khusus imunopresipitasi bersama dengan
DIM-2 pada strain yang mengekspresikan kedua protein yang ditandai,
terlepas dari apakah mereka diekspresikan dari lokus asli mereka atau dari
urutan yang ditargetkan ke-3-nya (Gambar 6). Ini menunjukkan kegunaan
vektor ekspresi tag epitope kami dan sistem knock-in untuk Neurospora.
 Pembahasan
Dalam penelitian ini kami mengembangkan alat untuk menandai protein epitop
untuk ekspresi dari promotor heterolog atau asli di Neurospora yang ditargetkan baik
ke lokus-3 atau ke lokus asli. Untuk menunjukkan utilitas sistem TAP HAT-FLAG kami,
kami menandai HP1 dan memurnikannya serta protein terkait untuk identifikasi
dengan spektroskopi massa. Ini mengidentifikasi DNA methyltransferase DIM-2
sebagai mitra HP1, konsisten dengan harapan dari penelitian dua-hibrida ragi kami
sebelumnya (Honda dan Selker 2008). Kami kemudian menggunakan sistem
penandaan kami untuk mengkonfirmasi interaksi antara HP1 dan DIM-2 oleh tes Co-IP
dalam strain yang mengekspresikan FLAG-tagged DIM-2 dan GFP-tagged HP1 dari
lokus-3 dan / atau asli di bawah kendali asli. promotor. Beberapa protein lain juga
terkorurifikasi dengan HP1, dan penelitian pendahuluan menunjukkan bahwa mereka
juga mewakili mitra aktual dari HP1 (S. Honda, T. K. Khlafallah, Z. A. Lewis dan E. U.
Selker, data yang tidak dipublikasikan). Dalam studi serupa, kami telah menggunakan
sistem HAT-FLAG untuk mengidentifikasi protein yang terkait dengan histone
methyltransferase DIM-5 (S. Honda, KK Adhvaryu, ZA Lewis dan EU Selker, data tidak
dipublikasikan; Tamaru dan Selker 2001; Tamaru et al. 2003). Perlu dicatat bahwa
protein terkait DIM-5 yang diidentifikasi dengan cara ini tidak diidentifikasi dalam
layar dua-hibrida ragi menggunakan DIM-5 sebagai perpustakaan umpan dan mangsa
(S. Honda dan E. U. Selker, data yang tidak dipublikasikan). Salah satu alasan yang
mungkin untuk kegagalan seperti layar ragi dua-hibrida adalah bahwa interaksi
mungkin tidak langsung. Atau, interaksi dapat bergantung pada protein terkait lainnya
atau aktivasi dengan modifikasi pasca-translasi. Dengan demikian sistem tag HAT-
FLAG berpotensi memungkinkan seseorang untuk secara bersamaan mengisolasi
semua komponen kompleks protein dalam pemurnian afinitas dua langkah yang
 Meskipun kami membangun sistem untuk menandai N dan C termini protein, kami biasanya
menguji tag terminal-C, yang dinyatakan di bawah kendali promotor endogen, karena ini
umumnya bekerja dan mudah, sedangkan penandaan terminal-N memerlukan subkloning
tambahan. Kami telah menguji 13 protein dengan tag epitop C-terminal. Sebelas dari 13 genetis
berfungsi, dan ekspresinya dapat dikonfirmasikan oleh Western blotting dengan antibodi spesifik
untuk tag epitop (S. Honda, K. K. Adhvaryu, T. K. Khlafallah, Z. A. Lewis dan E. U. Selker, data tidak
dipublikasikan). Dua yang tidak berfungsi penuh ketika ditandai di terminal C berhasil
diekspresikan dengan tag epitop N-terminal. Dalam pengalaman kami, fungsi protein umumnya
tidak terhalang oleh tag epitop tetapi perbedaan terjadi. Secara keseluruhan, kami menemukan
hierarki fungsi berikut: 3xFLAG> 3xHA> GFP> 13xMyc. Karena tag dapat berpotensi mengganggu
penargetan dan / atau situs modifikasi di sekitarnya dan berpotensi dapat mengganggu pelipatan
protein, maka perlu memiliki berbagai sistem penandaan epitop untuk termini N dan C.
Berbagai metode untuk mengkarakterisasi interaksi protein-protein berguna untuk penjelasan
fungsi protein. Baru-baru ini, komplemen fluoresensi bimolekular digunakan dalam Neurospora
untuk mendeteksi interaksi protein-protein (Bardiya et al. 2008). Hal ini didasarkan pada prinsip
bahwa interaksi protein yang secara terpisah menyatu dengan fragmen turunan GFP, yang tidak
secara individual memancarkan fluoresensi, dapat memungkinkan rekonstitusi fluorofor fungsional
jika mereka cukup dekat. Meskipun pengujiannya sederhana dan sangat sensitif, dalam banyak
kasus diharapkan tidak bekerja berdasarkan pengamatan kami sebelumnya bahwa sekitar
setengah dari fusi GFP dengan gen Neurospora tidak terdeteksi bahkan ketika diekspresikan
berlebihan (Freitag et al. 2004b) . Sebaliknya, dengan menggunakan sistem penandaan epitop
yang diuraikan di sini, semua upaya kami untuk mengisolasi protein yang ditandai dengan epitop
yang fungsional dan dapat terdeteksi yang dinyatakan di bawah kendali promotor asli mereka
telah berhasil. Sistem ini berfungsi baik tidak hanya untuk pemurnian protein dan uji Co-IP tetapi
juga untuk tujuan lain seperti uji imunofluoresensi dan kromatin imunopresipitasi (ChIP). Memang,
kami sebelumnya menunjukkan bahwa HP1 dan DIM-2 dilokalkan ke daerah yang dimetilasi
dengan uji ChIP menggunakan sistem penandaan-epitop (Honda dan Selker 2008). Patut dicatat
bahwa salah satu fitur menggunakan antibodi terhadap epitop, bukannya terhadap protein asli,
adalah bahwa protein yang ditandai lebih cenderung tetap fungsional dan dapat diakses saat
terikat oleh antibodi.
 Kami menunjukkan bahwa protein yang ditandai dengan epitop
secara ekuivalen diekspresikan dari lokus-3 dan lokus asalnya di
bawah kendali promotor asli mereka. Kedua situasi bekerja secara
efisien untuk pengujian Co-IP tetapi masing-masing memiliki
kelebihan dan kekurangan. Menargetkan ke-3 biasanya terbatas
pada satu gen per strain. Pada prinsipnya, heterokaryon dapat
digunakan untuk mengekspresikan dua protein berbeda yang
ditandai dari lokus-3-nya tetapi bisa sulit untuk mempertahankan
heterokaryon yang seimbang, dan artefak dimungkinkan (Kawabata
dan Inoue 2007). Oleh karena itu kami merekomendasikan untuk
memotong strain yang mengekspresikan protein yang ditandai
dengan epitop dari lokus yang berbeda untuk mengisolasi strain
knock-in homokaryotic double atau triple. Mutagenesis yang
diarahkan pada situs adalah teknik yang sangat berharga untuk
mempelajari fungsi protein, dan penargetan ke-3-nya mudah untuk
pengenalan protein mutan dengan tag epitope. Memang, kami
menggunakan ini dalam pekerjaan yang diarahkan pada
mendefinisikan situs kritis untuk interaksi HP1 dan DIM-2 (Honda dan
Selker 2008).
 Kami mendemonstrasikan aplikasi sistem Cre / loxP di Neurospora untuk mengeluarkan hph marker
yang dapat dipilih, yang merupakan marker resistensi antibiotik paling populer untuk Neurospora dan
eukariota lainnya. Kami mengamati frekuensi eksisi marker lengkap yang agak rendah (20%, atau
2/10), mirip dengan kasus pada Aspergillus fumigates, yang menunjukkan frekuensi 25% (5/20)
(Krappmann et al. 2005). Sebaliknya, penyelamatan penanda yang sebanding di Aspergillus nidulans
dan S. cerevisiae bekerja pada efisiensi yang lebih tinggi (masing-masing 70-80% dan 80-90%)
(Guldener et al. 1996; Krappmann et al. 2005). Mungkin signifikan bahwa Neurospora memiliki sistem
pertahanan genomik yang kuat (Galagan dan Selker 2004), termasuk metilasi DNA, yang mengganggu
pemanjangan transkripsi (Rountree dan Selker 1997); Namun, kami tidak mendeteksi metilasi DNA
dalam gen cre terintegrasi (data tidak ditampilkan). Perbedaan efisiensi mungkin disebabkan oleh
perbedaan dalam ekspresi Cre yang didorong oleh berbagai promotor. Dalam sistem A. nidulans dan S.
cerevisiae, promotor yang dapat diinduksi secara kimiawi secara ketat mengatur ekspresi Cre,
sementara, dalam sistem Neurospora dan A. fumigates, ekspresi Cre dimulai dengan memperkenalkan
gen Cre melalui transformasi. Penggunaan promotor yang diinduksi dengan ketat, seperti promotor
asam quinic-2 (Pqa-2) (Giles et al. 1985), dapat meningkatkan efisiensi di Neurospora. Perbaikan lebih
lanjut untuk sistem ini dapat mencakup penerapan modul penanda ganda yang dapat dipilih seperti
"tk-blaster," yang menggabungkan hph dan fluorideoxyuridine (FUDR) - penanda sensitif timidin
kinase (tk) (Sachs et al. 1997; Pratt dan Aramayo 2002) , memungkinkan pemilihan strain yang telah
memotong kaset. Pekerjaan di masa depan dapat mengoptimalkan sistem Cre / loxP untuk
Neurospora. Sistem Cre / loxP berpotensi dapat digunakan tidak hanya untuk eksisi marker tetapi juga
untuk rekayasa lanjutan penyusunan ulang kromosom, seperti dalam membangun knock-out
bersyarat di Neurospora.

Karakterisasi dan identifikasi kompleks protein adalah langkah dasar dalam menguraikan fungsi
gen. Kami telah mengembangkan di sini kombinasi pendekatan genetik dan biokimia di Neurospora,
dan teknik ini dapat dengan mudah diterapkan pada jamur berserabut lainnya. Kami telah
menggunakan alat ini untuk menganalisis hubungan antara HP1 dan DIM-2 untuk menjelaskan mesin
metilasi DNA di Neurospora. Alat-alat ini akan memfasilitasi berbagai analisis dalam mengklarifikasi
proses dasar dalam Neurospora dan jamur berfilamen lainnya. Memang, metode kami telah berhasil
diadaptasi untuk menandai dan mengekspresikan protein fusi dalam Fusarium graminearum (L.
Connolly dan M. Freitag, hasil yang tidak dipublikasikan).