SPEKTROFOTOMETER

UV-VIS
Materi Pengantar praktikum fisika farmasi
Spektrofotometri
adalah suatu metode untuk
mengukur interaksi antara
radiasi elektromagnetik
dengan molekul suatu zat
kimia melalui banyaknya
energi radiasi yang diserap
oleh molekul tersebut.
• alat untuk mengukur interaksi tersebut
dinamakan Spektrofotometer
• Alat ini mengukur transmitan atau
absorban(serapan) suatu sampel zat sebagai
fungsi panjang gelombang
• Spektrofotometer sesuai dengan namanya
merupakan alat yang terdiri dari spektrometer
dan fotometer.
• Spektrometer  menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu
• fotometer  alat pengukur intensitas cahaya
yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi.
• Spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk
pengukuran absorban di daerah ultra violet (190-
380 nm) dan di cahaya tampak (380-780 nm)
•Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) biasa digunakan dalam
menganalisa suatu senyawa kimia
Prinsip kerja :
•Alat memancarkan radiasi elektromagnetik yang akan diabsorbsi oleh
molekul zat kimia mengakibatkan transisi elektron, yaitu promosi elektron
dari orbital dasar berenergi rendah ke orbital tereksitasi berenergi lebih
tinggi. Molekul-molekul yang membutuhkan lebih banyak energi untuk
promosi elektron akan menyerap cahaya pada panjang gelombang lebih
pendek (misal spektrum UV), sedangkan molekul-molekul yang menyerap
energi lebih sedikit akan menyerap cahaya pada panjang gelombang lebih
panjang (misal di area cahaya tampak).
•Eksitasi
elektron yang memberikan absorban maksimum berada pada
panjang gelombang maksimum (λ maks) yang khas pada setiap zat kimia.
• Umumnya digunakan dalam
analisis kualitatif dan kuantitatif
suatu senyawa yang memiliki
kromofor, yaitu suatu gugus
fungsional yang mengabsorbsi
energi pada area cahaya tampak
dan UV. Kromofor ini dapat
berupa gugus dengan ikatan
rangkap terkonjugasi, misal
benzene, asetilen, karboksil,
gugus azo, dll.
Bagian-bagian Spektrofotometer
Hukum Lambert-Beer
cahaya yang diabsorbsi pada suatu frekuensi tertentu dipengaruhi oleh jumlah
molekul zat kimia, sehingga dapat terlihat bahwa konsentrasi suatu zat kimia
sebanding dengan banyaknya absorban yang diserap oleh zat tersebut. Persamaan
hukumnya adalah sbb:
•A= Ɛ.b.c atau A=a.b.c
Dimana A= Absorbansi (tanp a satuan)
Ɛ= tetapan absorbtivitas molar (M-1cm-1)
a= tetapan absorbtivitas (ppm-1.cm-1)
b= tebal kuvet (cm)
c= konsentrasi zat (M atau ppm)
Tahapan Mengukur Kadar Zat Obat dengan
Spektrofotometer UV-Vis
1. Menetapkan panjang gelombang maksimal pengukuran zat
2. Membuat kurva baku senyawa murni zat (mencari persamaan regresi linier)
3. Mengukur serapan zat
4. Mengeplot serapan pada persamaan reg & menghitung kadar sampel
Menetapkan panjang gelombang Maks.
• Memasukkan larutan obat ke dalam
kuvet & diskrining oleh
spektrofotometer
• Akan tergambar gelombang yang
dapat dilihat absorbansi tertinggi pada
puncaknya
Membuat kurva baku zat murni
• Misal vitamin B1, λmax = 232 nm , A (1%, 1 cm) = 566 menurut Clarke,s
• Perlu dibuat seri kadar vitamin B1 murni, tapi berapa konsentrasinya?
• Mengacu pada A1% 1cm-nya dan absorbansi ideal di spektrofotometer 0.1-0.8
Menurut hukum Lambert-Beer :
A=a.b.c 1% = 1 g/100 mL=1.000.000 mcg/100 mL = 10.000 mcg/mL atau ppm
566 = a x 1 cm x 10.000 ppm  a= 0.0566 ppm-1.cm-1
Jika abs.ideal bawah 0.2, maka  0.1 = 0.0566x 1x [c]1  [c]1= 1.77 ppm
Jika abs.ideal atas 0.8, maka  0.8= 0.0566 x 1x [c]2  [c]2= 14,13 ppm
 Seri kadar (x) dan Absorbansi/serapan (y)
• Persamaan Regresi Linier
X (ppm) Y
1 ppm
Y= bx + a

Grafik Regresi linier

15 ppm
Studi Kasus
•Penetapan Kadar Vitamin B1 menggunakan Spektrofotometer UV-Vis

Untuk menetapkan kadar suatu sampel Thiamin HCl (vit.B1) seorang

mahasiswa farmasi membuat kurva kalibrasi dengan B1 murni menggunakan
metode spektrofotometri pada panjang gelombang 232 nm. Hasil pengukuran
serapan baku Vit B1 ditunjukkan pada tabel berikut:

Konsentrasi Serapan (A)

(ppm)
1 0,178
3 0,256
5 0,322
7 0,401
11 0.482
• Suatu sampel vit.B1 ditimbang 106 mg kemudian dilarutkan dalam 100 mL
aquadest, kemudian dipipet 1 mL dan diarutkan dalam labu ukur 100 mL ad
tanda batas. kemudian diukur serapannya menggunakan spektrofotometer.
Replikasi dilakukan 3 kali. Bila didapat rerata serapan 0,228. Berapa % kah
kadar vit.B1 dalam sampel tersebut?
Jawab:
Analisis dg excel/kalkulator, persamaan reg.linier
y=0.0306x + 0.1623
0.228 = 0.0306x + 0.1623
• X= (0.228-0.1623)/0.0306
• X= 2,147 ppm atau 2,147 mcg/mL

• Faktor pengenceran (fp) = 100 ml x 100 ml/1 ml = 10.000 ml

• Kadar sebenarnya = x .fp = 2,147 mcg/ml x 10.000 ml = 21.470 mcg = 21,47 mg
• % kadar = 21,47 mg/106 mg x 100% = 20,25%

• Kadar sebenarnya vit.B1 dalam sampel adalah 20,25%

Latihan soal
• Untuk menetapkan kadar suatu sampel isoniazid (INH) Konsentrasi Serapan
seorang mahasiswa farmasi membuat kurva kalibrasi (ppm) (A)
dengan INH murni menggunakan metode spektrofotometri 4 0,239
pada panjang gelombang 263 nm. Hasil pengukuran
6 0,321
serapan baku INH ditunjukkan pada tabel di samping.
8 0,405
• Suatu sampel INH ditimbang 102 mg kemudian dilarutkan 9 0,453
dalam 100 mL HCl 0,01 N, kemudian dipipet 1 mL dan 12 0.592
diarutkan dalam 100 mL HCl 0,01 N kemudian diukur 20 0,869
serapannya menggunakan spektrofotometer. Replikasi
dilakukan 3 kali. Bila didapat rerata serapan 0,478 dan
persyaratan Farmakope untuk isoniazid adalah
mengandung tidak kurang dari 98,0 % dan tidak lebih dari
102 %, apakah sampel tersebut memenuhi persyaratan
farmakope ?