Tes Serologi

Tes Western Blot

Oleh kelompok 2 :
• JURMALIA LA’AMU
• MERISTEVI FRIANSARI PELENG
• NADITYA TOLINGGI
• AMELIA ABD. LATIF
• NADIRA KALUKU
• MUTMAINAH SUPU
• SITI RAHMATIA ANCE
• ANISA HUNGGAITA
DEFINISI

The western blot (kadang-kadang disebut imunoblot protein ), atau western blotting , adalah banyak digunakan teknik analisis
dalam biologi molekuler dan immunogenetics untuk mendeteksi spesifik protein dalam sampel dari homogenat jaringan atau
ekstrak.
Western blot menggunakan antibodi yang mengenali protein yang dimodifikasi dengan asam lipoat
Singkatnya, sampel mengalami denaturasi protein , dilanjutkan dengan elektroforesis gel . Sebuah sintetis atau hewani antibodi
(dikenal sebagai antibodi primer ) dibuat yang mengakui dan mengikat dengan protein target tertentu. Membran elektroforesis
dicuci dalam larutan yang mengandung antibodi primer, sebelum antibodi yang berlebih dicuci. Antibodi sekunder
ditambahkan yang mengenali dan mengikat antibodi primer. Antibodi sekunder divisualisasikan melalui berbagai metode
seperti pewarnaan , imunofluoresensi , dan radioaktivitas, memungkinkan deteksi tidak langsung dari protein target spesifik.

Teknik terkait lainnya termasuk dot blot analisis, kuantitatif dot blot , imunohistokimia dan immunocytochemistry , di mana
antibodi yang digunakan untuk mendeteksi protein dalam jaringan dan sel oleh immunostaining , dan enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA).

Nama western blot adalah plesetan dari Southern blot , teknik deteksi DNA yang dinamai menurut penemunya, ahli biologi
Inggris Edwin Southern . Demikian pula, deteksi RNA disebut sebagai noda utara . [1] Istilah "western blot" diberikan oleh W.
Neal Burnette pada tahun 1981, [2] meskipun metode itu sendiri berasal dari tahun 1979 di laboratorium Harry Towbin di
Institut Friedrich Miescher di Basel , Swiss . [3] Antara 1979 dan 2019 "telah disebutkan dalam judul, abstrak, dan kata kunci di
lebih dari 400.000 PubMedpublikasi yang terdaftar "dan mungkin masih merupakan teknik analisis protein yang paling banyak
digunakan
 Tujuan Pemeriksaan
Tes konfirmasi HIV menggunakan western blot untuk mendeteksi
antibodi anti-HIV dalam sampel serum manusia .
Protein dari sel yang terinfeksi HIV dipisahkan dan dibubuhi selaput
seperti di atas. Kemudian, serum yang akan diuji diaplikasikan pada tahap
inkubasi antibodi primer; antibodi bebas dibersihkan, dan antibodi anti-
manusia sekunder yang dihubungkan dengan sinyal enzim ditambahkan.
Pita bernoda kemudian menunjukkan protein yang mengandung antibodi
dalam serum pasien.

Western blot juga digunakan sebagai tes definitif untuk varian Penyakit
Creutzfeldt-Jakob , sejenis penyakit prion yang terkait dengan konsumsi
daging sapi yang terkontaminasi dari sapi dengan Bovine spongiform
encephalopathy(BSE, biasa disebut sebagai 'penyakit sapi gila').
PRINSIP PEMERIKSAAN
Pemeriksaan WESTERN BLOT merupakan metode konfirmasi
yang paling banyak di pakai setelah pemeriksaan penyaring
misalnya dengan EIA.
Prinsip pemeriksaan ini adalah reaksi antara antibodi anti HIV
dengan antigen HIV

Prinsip yang di gunakan dalam WESTERN BLOT adalah

prinsip ikatan antigen-antibodi komplek. Protein pada NC kita
anggap sebagai antigen. Antibodi primer adalah antibodi yang
dapat berikatan secara spesifik pada antigen pada NC. Agar
dapat melihat ikatan dari antigen-antibodi komplek, maka
kita memberikan warna pada antigen-antibodi tersebut
CARA KERJA
Gel hasil elektroforesis direndam bersama kertas saring Whatman dalam TBST (TBS
mengandung Tween-20 0.05%) selama 5 menit. Membran nitroselulosa direndam dalam
transfer buffer selama 5 menit. Kertas saring, membran nitroselulosa, gel dan kertas saring
disusun berurutan pada semidry trasnblot, kemudian transfer dilakukan pada pada arus 0,3
A tegangan 20 V selama 2 jam. Prosedur selanjutnya adalah pewarnaan Ponceau 2%, tapi
pada praktikum ini tidak dilakukan. Setelah running 2 jam, sampel diambil dan dipisahkan
dengan kertas saring. Marker akan terlihat jelas apabila transfer yang dilakukan sempurna.
Kemudian marker dipotong, lalu dilakukan bloking dengan TBS Skim Milk 5 % semalam
pada suhu 40 C. Setelah overnight, dilakukan washing TBS tween 0.05% selama 3x5 menit,
di Shaker pelan.

Kemudian inkubasi dalam antibodi primer dengan rasio pengenceran 1; 200 dalam pelarut
TBS dan BSA 0,02% Selama 2 jam. Selanjutnya dicuci kembali dengan TBS tween 0.05%
selama 3x5 menit, di shaker pelan. Prosedur selanjutnya adalah inkubasi dalam antibodi
sekunder (Peroksidase/Biotin Conjugate) perbandingan rasio pengenceran 1;100 dalam
pelarut TBS, selama 2 jam, suhu ruang dan di shaker pelan. Kemudian cuci kembali dengan
TBS tween 0.05% selama 3x5 menit, di shaker pelan. Inkubasi dalam SAHRP selama 1 jam di
suhu ruang dan di shaker pelan, cuci kembali dengan TBS tween 0.05% selama 3x5 menit, di
shaker pelan. Kemudian ditambahkan substrat TMB ± 20 menit sampai muncul band
protein, selanjutnya untuk menghentikan katalisasi ditambahkan dengan aquades dan
dikeringkan. Selanjutnya hasil band protein yang didapatkan di scanning.
VIDIO

y2mate.com - Western blot_1080p.mp4

THANKYOU