METODE PEMISAHAN

HPLC
PRINSIP

Fase gerak cair dipompa dengan tekanan

melewati kolom stainless steel yang
mengandung partikel fase diam dengan
diameter 3-10 μm. Sampel (analit) diletakkan
dibagian atas kolom menggunakan katup dan
pemisahan campuran terjadi berdasarkan
lama waktu (relatif) komponen didalam fase
diam.
PRINSIP

Monitoring hasil kolom menggunakan

berbagai variasi detektor
APLIKASI

 Kombinasi HPLC dengan monitoring oleh

deteksi UV/visible merupakan metode yang
akurasi, kuat (presisi) dan robust (kuat)
untuk analisis kuantitatif senyawa farmasi
dan metode standar industri.
 Monitoring stabilitas senyawa obat murni
dan obat di dalam formulasi dengan
sejumlah senyawa yang terdegradasi.
APLIKASI

 Pengukuran obat dan metabolitnya didalam

cairan tubuh (biological fluids).
 Penentuan koefisien partisis dan nilai pKa
obat dan ikatan obat dengan protein.
INSTRUMEN

SISTEM STANDAR INSTRUMEN UNTUK

ELUSI ISOKRATIK TERDIRI DARI :
 Pelarut
 Pompa yang mampu mempompa pelarut
hingga tekanan 4000 psi dan waktu alir 10
ml/min.
 Katup injeksi dengan katup volume antara
1 dan 200 μl (20 μl digunakan sebagai
standar).
INSTRUMEN

SISTEM STANDAR INSTRUMEN UNTUK

ELUSI ISOKRATIK TERDIRI DARI :
 Kolom, tabung stainless steel dengan silica
gel octadecylsilane dengan partikel ( 3, 5
atau 10 μm ).
 Detektor, biasanya detektor UV/visibel,
meskipun untuk aplikasi khusus tersedia
berbagai macam detektor
INSTRUMEN

SISTEM STANDAR INSTRUMEN UNTUK

ELUSI ISOKRATIK TERDIRI DARI :
 sistem pengambilan data, yang terintegrasi
dengan komputer atau PC dengan
perangkat lunak yang cocok untuk
memproses data kromatografi.
INSTRUMEN

SISTEM STANDAR INSTRUMEN UNTUK

ELUSI ISOKRATIK TERDIRI DARI :
 Kolom terhubung dengan injektor dan
detektor dengan diameter tabung dalam 0,2
mm, untuk meminimalkan "dead volume".
Yaitu terjadinya ruang kosong dalam sistem
dan perluasan pita dapat terjadi dengan
difusi longitudinal
INSTRUMEN

SISTEM STANDAR INSTRUMEN UNTUK

ELUSI ISOKRATIK TERDIRI DARI :
 instrumen yang lebih advanced, memiliki
injeksi sampel otomatis dan oven kolom dan
mampu mencampur dua atau lebih pelarut
dalam berbagai proporsi dengan waktu
untuk menghasilkan gradien fase gerak.
RUANG LINGKUP KCKT

KCKT dapat digunakan untuk senyawa yang

labil oleh pemanasan dan tidak menguap.

Keunggulan KCKT : ketepatan analisis dan

kepekaan yang tinggi dan cocok untuk
memisahlan senyawa non volatile yang tidak
tahan pemanasan.
a. Propil Kromatogram

Kromatogram KCKT merupakan hubungan

antara waktu sebagai absis dan tanggap
detektor sebagai ordinat pada sistem
koordinat Cratesian.
Titik nol dinyatakan : dimulainya injeksi
sampel.
Propil Kromatogram
b. Waktu Retensi atau waktu hambat
( Retention Time : TR)
Selang waktu yang diperlukan oleh analit
mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom
dan sinyalnya secara maksimal di tangkap
oleh detektor disebut waktu retensi (retention
time).
Waktu retensi analit yang tertahan pada fase
diam dinyatakan dengan tR,
Waktu retensi analit yang tidak tertahan pada
fase diam (waktu retensi pelarut pengelusi) : to
Waktu Retensi atau waktu hambat
( Retention Time : TR)
Waktu retensi analit dikurangi dengan waktu
retensi pelarut pengelusi atau pelarut
pengelusi campur adalah waktu retensi
terkoreksi (tR’)

tR’ = tR – tM
Waktu Retensi atau waktu hambat
( Retention Time : TR)
Waktu retensi (dalam satuan menit)
merupakan hal penting dalam analisa
kualitatif dengan KCKT
c. Faktor kapasitas/faktor retensi

Faktor kapasitas : ciri khas suatu analit pada

kondisi tertentu, yaitu komposisi fase gerak,
suhu dan jenis kolom (panjang kolom,
diameter kolom dan ketebalan lapisan film)
tertentu.
c. Faktor kapasitas/faktor retensi

Faktor kapasitas : memberikan gambaran

dimana puncak-puncak analit terelusi secara
relatif terhadap puncak fase geraknya.

Faktor kapasitas = k’
c. Faktor kapasitas/faktor retensi

tR – to : waktu retensi terkoreksi

to : waktu retensi fase gerak
c. Faktor kapasitas/faktor retensi

Harga faktor kapasitas (k’) yang baik adalah

berkisar antara 2 – 10.
Bila harga k’ kecil artinya analit ditahan
sedikit oleh kolom dan terelusi dekat dengan
puncak fase gerak.
Harga k’ yang besar (mis 20-30) menunjukkan
pemisahan yang baik tetapi menyebabkan
waktu analisis terlalu lama.
d. Selektifitas

Kemampuan fase diam untuk memisahkan 2

komponen ( komponen 1 dan komponen 2),
dimana komponen 2 sangat tertahan
dibandingkan komponen 1 ditentukan oleh
partisi atau rasio relatifnya, sehingga
tergantung pada faktor kapasitasnya pada
fase diam tertentu.
d. Selektifitas

Selektifitas (α) adalah nilai retensi relatif tiap

komponen oleh fase diam.
Nilai (α) harus lebih besar dari 1 supaya
terjadi pemisahan
e. Efisiensi kolom

Terdapat dua cara paling lazim digunakan

dalam mengukur efisiensi kolom kromatografi
yaitu :
(1)jumlah plat teori (N) dan
(2)jarak setara plat teori (JSPT)
(1) Jumlah Pelat Teori (N)

Jumlah plat teori (N) adalah banyaknya

distribusi keseimbangan dinamis yang terjadi
didalam suatu kolom.
Jumlah plat teori digunakan untuk
mengetahui keefisienan kolom.
(1) Jumlah Pelat Teori (N)

tR ; waktu retensi analit

W : lebar pada dasar puncak
W1/2 : lebar pada setengah tinggi puncak
(1) Jumlah Pelat Teori (N)

Persamaan ini membandingkan lebar puncak

dengan lamanya komponen berada didalam
kolom.
Kolom yang efisien : mencegah pelebaran pita
dan atau menghasilkan puncak yang sempit.
(2) Jarak Setara Plat Teori (JSPT)

JSPT = TSPT ( Tinggi setara Pelat Teori) atau

HETP ( High Equivalent of Theoretical Plate).

JSPT adalah panjang kolom kromatografi

(mm) yang diperlukan sampai terjadinya satu
kali keseimbangan distribusi dinamis molekul
analit dalam fase gerak dan fase diam.
(2) Jarak Setara Plat Teori (JSPT)

Harga HETP = H berkaitan dengan jumlah

pelat teori menurut persamaan :
Dimana :
L = panjang kolom (mm)
N = jumlah pelat teori
f. Optimalisasi Kinerja Kolom

Optimalisasi dengan memvariasikan kondisi

percobaan sampai komponen-komponen
dalam campuran terpisah dengan baik dengan
waktu analisis yang singkat.
(1). Resolusi
(1). Resolusi

Daya pisah (R) antara dua puncak dapat

diukur dengan kuantitatif.
Dimana
tR; Waktu retensi komponen
W : lebar alas puncak
Pemisah dua puncak ideal : R ≥ 1,5 ( harga
resolusi ideal).
(2). Faktor simetri

Faktor simetri atau tailing fakto yaitu terjadi

pengekoran pada kromatogram sehingga
bentuk kromatogram menjadi tidak simetris.
(2). Faktor simetri

Harga TF = 1 berarti kromatogram tersebut

benar-benar simetris.
Harga TF > 1 : kromatogram mengekor
(tailing) makin besar harga TF makin tidak
efisien kolom yang dipakai.
Harga TF < 1 : kromatogram mengandung
(fronting).
TF : pedoman untuk melihat efisiensi kolom
kromatografi
CONTOH SOAL
Senyawa A dan B diketahui memiliki waktu
retensi 17,40 dan 18,63 menit pada pemisahan
menggunakan kolom dengan panjang 30 cm.
Suatu senyawa yang tidak tertahan pada fase
diam melintasi kolom selama 1,30 menit. lebar
puncak A dan B berurutan adalah 1,11 dan
1,21 menit. Hitunglah nilai dari :
(a). Resolusi,
(b). Jumlah pelat teoritis (N),
(c) Jarak setara pelat teori (JSPT),
CONTOH SOAL
(a). Resolusi
SOAL

Berikut ini adalah data dari pemisahan

dengan kromatografi cair :
Panjang kolom ; 24,7 cm
Kecepatan alir : 0,313 ml/menit
Kromatogram yang diperoleh dari pemisahan
campuran zat A, B, C dan D adalah sebagai
berikut :
SOAL
SOAL

Hitunglah :
a. Jumlah plat teoritis pada masing-masing
puncak
b. Nilai tengah dan standar deviasi untuk N
c. Jarak setara pelat teori untuk tiap puncak
d. Waktu retensi masing-masing puncak
e. Resolusi
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI
Tablet :
Tablet mengandung Parasetamol 500 mg,
phenypropanolamine 5mg.
Penjelasan uji :
Parasetamol ditentukan nilai absorbansi A
(1%, 1 cm) dengan panjang gelombang
maksimal 243 nm (668) digunakan untuk
memonitor parasetamol. Fase gerak yang
digunakan asam asetat 0,05 M : asetonitril
(90:15). Parasetamol standar (1,25 mg/100 ml)
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI
a) Parasetamol standar (1,25 mg/100 ml) :
Parasetamol standar berat 125 ± 10 mg
dimasukkan kedalam labu ukur 250 ml,
tambahkan asam asetat 0,05 M kocok hingga
larut ( larutan stok).

b) Siapkan rangkaian larutan untuk membuat

kurva kalibrasi dengan : 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ;
2,0 ; dan 2,5 mg/100 ml Parasetamol
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI
c). Timbang dan serbukkan 20 tablet
d). Timbang serbuk tablet setara dengan 125 ±
10 mg Parasetamol.
e). Kocok serbuk sampel kedalam asam asetat
150 ml asam asetat (0,05 M) selama 5 menit
didalam labu takar 250 ml dan cukupkan
hingga 250 ml asam asetat 0,05 M
f). Saring larutan dan ambil 50 ml masukkan
ke dalam kedalam erlenmeyer, dan pindahkan
25 ml larutan kedalam labu ukur 100 ml, dan
cukupkan dengan asam asetat hingga 100 ml
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI

g). Ambil 10 ml larutan ekstrak dan masukkan

kedalam labu ukur 100 ml dan cukupkan
hingga volume dengan asam asetat 0,05 M
h). Analisis standar dan sampel dengan kondisi
kromatografi sebelumnya.
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI

Data yang diperoleh :

Berat 20 tablet = 12,1891 g
Berat serbuk tablet 150,5 mg
Berat pct standar = 126,1 mg
Area puncak parasetamol sampel dari tablet =
45.205
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI

PERTANYAAN :
HITUNGLAH PERSENTASE
PARASETAMOL DIDALAM TABLET YANG
DIANALISA.
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI

Persamaan regresi = y=35656,585x + 80,803

R = 1,000.

Subtitusikan puncak pct kedalam rumus

regresi : 45.205 = 35.656,59 x + 80,1
Larutan x di buat dalam ... Mg/100 ml
Konsentrasi pct didalam tablet = 45205-80/
35.656 = 1,266 mg/100 ml
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI

Tahapan pengenceran :
Ambil 25 ml ad-kan hingga 100 ml ( x 4)
Ambil 10 ml ad-kan hingga 100 ml ( x 10)
Total Faktor pengeceran = x 40

Konsentrasi pct terekstraksi : 1,266 mg/100 ml

x 40 = 50,64 mg/100 ml
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI

Jumlah pct didalam volume terekstraksi

Volume ekstraksi tablet = 250 ml
Jumlah pct didalam 100 ml = 50,64 mg
Jumlah pct didalam 250 ml = 250/100 x 50,64
mg = 126,6 mg.
Jumlah pct yang diperoleh didalam serbuk uji
= 126,6 mg
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI

Berat 20 tablet : 12,1891 g.

Berat satu tablet = 12,1891/20 =0,6094 g =
609,5 mg.
Kandungan pct tiap tablet = 500 mg
Jumlah pct didalam serbuk yang ditimbang =
150,5 mg/609,5 mg x 500 mg = 123, 5 mg
ANALISIS TABLET PARASETAMOL
MENGGUNAKAN KURVA KALIBRASI

Persentase kandungan parasetamol tablet

adalah = 126,6 mg/123,5 mg x 100 % = 102,5
%.
SOAL : hitung persentase tablet pct
menggunakan kurva kalibrasi

Data :
Berat 20 tablet = 12,2243 g
Berat serbuk tablet yang diuji = 152,5 mg
Kandungan pct tiap tablet = 500 mg
Jumlah volume ekstraksi = 200 ml
SOAL : hitung persentase tablet pct
menggunakan kurva kalibrasi

Tahap pengenceran :
20 ml ad-kan hingga volume 100 ml
Ambil 10 ml ad-kan hingga volume 100 ml
Area puncak kromatografi pct uji adalah
44.519
SOAL : hitung persentase tablet pct dan
aspirin menggunakan kurva kalibrasi

Data :
Berat 20 tablet = 11,2698 g
Berat serbuk tablet yang diuji = 283,8 mg
berat pct standar = 125,5 mg
Berat aspirin standar = 127,3 mg
Kandungan pct tiap tablet = 250 mg
Kandungan aspirin tiap tablet = 250 mg
SOAL : hitung persentase tablet pct dan
aspirin menggunakan kurva kalibrasi

Volume awal sampel dalam 250 ml

Tahap pengenceran :
25 ml ad-kan hingga volume 100 ml (x4)
Ambil 10 ml ad-kan hingga volume 100 ml
(x10) ... FP 40

Area puncak kromatografi pct uji = 44535

Area puncak kromatografi aspirin = 15366
 SOAL : hitung persentase tablet pct dan
aspirin menggunakan kurva kalibrasi

Kurva kalibrasi ;
Aspirin y = 12136 x + 139
Parasetamol y = 35374x - 35