SEROLOGY

SECTION
OUTLINE
A. Teknik Sampling Dan Jenis Sampel
B. Prosedur Penerimaan Sampel
C. Prosedur Pengetesan Sampel
 TEKNIK SAMPLING
A. Serology adalah ilmu yang mempelajari reaksi antara antigen dan antibody

Sampel Monitoring Status Kesehatan

Hasil Vaksinasi (titer antibodi)
Diagnosa Case sampel
Random Setiap individu memiliki kesempatan yang sama
Sampling Mengetahui kondisi kandang yang sebenarnya
 Prosedur Sampling Serum
A. Menggunakan spuit & needle steril (baru) untuk masing-masing ayam
B. Darah diambil dari vena brachialis dengan volume darah yang diambil :
< 10 W : 1 ml
>10 W : 2-3 ml
C. Area Jawa Timur : bisa dikirim dalam bentuk darah (spuit), dikirim dengan ice pack
D. Area luar Jawa Timur : harus dikirim dalam bentuk serum
E. Memisahkan serum dengan RBC : spuit diletakkan dengan posisi miring suhu 25-30 0C selama 1-2 jam, setelah
terpisah, serum dimasukan dalam mikrotube.
F. Serum di tube atau spuit dimasukkan dalam plastik, diberi informasi data (Nama farm, Alamat, Umur, Kandang,
Date Collect, Request Test, 3 vaksin terakhir, Start problem (jika case sample))
Darah Serum

Serum Rusak
 Prosedur Sampling Feed
a. Pakan diambil dari gudang utama, gudang kandang dan through
b. Pakan diambil dari 9 titik
c. Pakan dari 1 kandang dimasukkan dalam 1 plastik
d. Informasi data : nama farm, alamat, kandang, kode feed, date collect, tanggal
kirim, tanggal produksi, tanggal kedatangan, keterangan (gudang utama gudang
kandang, through), medikasi atau perlakuan pakan

Prosedur Sampling Fresh Organ

a. Sampel fresh organ berasal dari ayam sakit yang
Plastik berisi masih hidup
air b. Sampel fresh organ yang sudah dikemas sesuai
Organ prosedur harus disimpan dalam freezer dan saat
pengiriman harus menggunakan ice pack
Plastik kecil c. Sampel organ : Otak, Trachea, Lung, Liver, Hock
joint
d. Informasi data : Nama farm, Alamat, Kandang,
Organ, Request test
Prosedur Sampling Swab
Media :
1. Viral transport media : ND, AI
2. Amies : MG. MS
Swab :
3. Swab kloaka
4. Swab trachea
5. Swab Choane
6. Swab synovial

Informasi data : Nama farm, Alamat, Kandang, Organ, Request test

Viral Transport media Amies media

 Jenis Pengetesan, Jenis & Jumlah Sampel
ND Jumlah sampel maksimal 24 tiap HH
Jumlah sampel minimal 16,
Serum
HA-HI jika <16 maka tidak dilakukan
pengetesan
AI H5, H9
Jumlah sampel minimal 18 (perwakilan 1
Pengetesan farm 5 HH)
15 penyakit Serum
Sampel monitoring DOC semua ditest
Jumlah sampel serum PIP minimal 20
Elisa
Feed Jumlah sampel minimal 500gr

Mycotoxin

Liver Jumlah sampel minimal 3

 Jenis Pengetesan, Jenis & Jumlah Sampel
S. pulorum
Plate test Serum Jumlah sampel maksimal 16
MG

Rapid test AI Serum

Pengetesan MG / MS Swab Amies Trachea

Jumlah sampel swab
PCR Air sac minimal 5 swab per HH

Swab VTM Trachea

ND / AI Kloaka
Fresh Organ Otak
Jumlah sampel minimal
Lung 3 per HH
Trachea
Prosedur Penerimaan Sampel

Registrasi Lab. Registrasi Sero. Daily Book Pengetesan &

Sampel
(asisten) (asisten) (Vet) Pembacaan hasil
Uji HA (Haemaglutinasi)
Uji HA digunakan untuk mendeteksi virus yang memiliki hemaglutinasi, titer virus dapat dilihat pada pengenceran terakhir yang
menunjukkan adanya hemaglutinasi positif (end point ) dan untuk mengetahui apakah antigen memiliki titer 4HA
Bahan dan alat : - PBS
- Diluter 0,025 ml
- mikroplat
- Antigen ND/ AI
- RBC 1%

Uji HA-HI (Haemaglutinasi Inhibition)

Uji HI digunakan untuk mengetahui adanya antibodi yang mampu menghambat hemaglutinasi. Bila antibodi mencukupi
maka hemaglutinasi akan dihambat sehingga eritrosit mengendap, sebaliknya jika antibodi tidak mencukupi maka eritrosit
akan diaglutinasi.
Bahan : - PBS
- Ag ND/AI
- Serum
- RBC 1%
Metode HA
Membuat RBC 1 %

1. Ambil darah melalui jantung menggunakan spuit steril

2. 2 ml alsever + 10 ml darah
3. Pindahkan ke dalam tube 15 ml
4. Sentrifuge 2000rpm selama 3 menit
5. Buang supernatan
6. Cuci dengan PBS
7. Ulangi langkah ke 4-6 sebanyak 3 x
8. Hitung kebutuhan RBC
misal : V. total RBC 750 ml
RBC 1 % = 7,5 ml RBC + 747,5ml PBS
Metode HA
Membuat antigen stock

1. Antigen beku
2. Thawing
3. Antigen stock ND 1 :1 (misal : 2ml Ag + 2 ml PBS
4. End point

Membuat end point (untuk melihat titer 4 HA)

1. Isi plate dengan PBS 0,025 ml
2. Tambah Antigen stock 0,025 ml , masukkan ke dalam 4 sumur (A1-D1)
3. Dilute sampai lubang ke 12
4. Tambah RBC 0,025 ml, campur, diamkan 30 menit
5. Lihat pengenceran terakhir yang menunjukkan adanya hemaglutinasi
 Metode HA
2¹ 2² 2³ 2⁴ 2⁵ 2⁶ 2⁷ 2⁸ 2⁹ 2¹° 2¹¹ 2¹²
4HA Endpoint 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096
4HA 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
Misal
end point 2⁸ = 256 256 / 4 = 64
Tes 156 plate,1 plate kita anggap vol 3 ml
4HA = 64
V keseluruhan = 156 x 3 = 468 / 64 = 7,3 ml 7,5 ml
480 : Ag = 7,5
PBS = 472,5
RBC : 156 x 3 = 468 = 450 ml
RBC = 4,5 ml
PBS = 445,5 ml
RBC 1% : 1 ml RBC + 99 ml PBS
Antigen terlalu kuat

• Misal: 4HA 64, terlalu kuat 2 ditambahkan PBS

• 4HA menjadi 256 , Ag = 7,5
1920 Ag 7,5
PBS 1440 ( +PBS 967,5)

( 4HA baru * Ag )
Antigen terlalu lemah
• 4HA 64, terlalu lemah 2 ditambahkan Ag
• 4HA menjadi 16, Ag = 7,5, total larutan PBS awal=480
480 30 ( +22,5 ml) ( total PBS : 4HA baru)
126
Metode HI
Plate diisi dengan PBS 0,025 ml dengan mesin mikrofiller

Serum diambil 0,025 ml dan di dilute

Tambah dengan Ag 0,025 ml

Mix dan diamkan 30 menit

Tambah RBC, mix dan diamkan 30 menit

ELISA (Enzim Linked Immunosorbent Assay)
 Prinsip :
ikatan antibodi dengan antigen yang dilabel oleh enzim
 Macam Pengetesan :
1.MG : Mycoplasma gallisepticum (CRD)
2.MS : Mycoplasma synoviae
3.Reo : Avian Reovirus
4.Salmonella Grup D
5.ART / APV : Avian rhinotracheitis / Avian Pneumovirus
6.EDS : Egg Drop Syndrome
7.ILT : Infectious laryngo-tracheitis
8.AE : Avian Encephalomyelitis
9.ND : New castle disease
10.AI : Avian Influenza
11.CAV : Chicken Anemia Virus
12.IBD : Infectious Bursal Disease
13.IBV : Infectious Bronchitis Virus
14.ORT : Ortnithobacterium Rhinotracheaitis
15.FadV : Fowl Adenovirus (Inclusion Body Hepatitis)
 5µl serum + 245 µl dilluent
MG,MS,REO,EDS,AE,ND,
1 10µl dilluted serum + 90µl dilluent AI,IBD,IB,CAV,ILT

2 50µl dilluted serum + 50µl dilluent Salmonella, ORT, FaDV Diluent plate
inkubasi
MG, MS, REO, Salmonella, EDS,
1 30 menit AE, ND, AI, IBD, IB, FadV

2 1 jam CAV, ILT, ART, ORT

Coated plate
Cuci 5 x dengan wash buffer
keringkan
Conjugate 100µl
inkubasi MG, MS, REO, Salmonella, EDS,
1 30 menit conjugate
AE, ND, AI, IBD, IB, FadV

2 1 jam CAV, ILT, ART, ORT Elisa washer

machine
Cuci 5 x dengan wash buffer
next
 Keringkan

Substrate 100µl
inkubasi
MG, MS, REO, Salmonella, EDS,
1 15 menit AE, ND, AI, IBD, IB, FadV Substrate

2 30 menit CAV, ILT, ART, ORT

Stop sollution 100µl

Baca dengan elisa reader 405nm

(Biocheck) Elisa reader

Dilluent plate:
Hijau : REO, Salmo, EDS, IBD, IB, ORT, ART, AE
Kuning : CAV, MG, MS, AI, ILT, FadV
Pembuatan wash buffer : 1 sachet wash buffer dalam 1000ml Aquadest steril
Pembuatan reagent substrat : tablet substrate dalam 11 ml substrat buffer
Sebelum pengetesan, seluruh kit harus dalam kondisi sama dengan suhu ruang Kit Elisa
Interpretasi Hasil ELISA
1. Mean titer reff. Control berada di titer range artinya hasil
pengetesan valid
2. Mean titer berada di dalam range target titer artinya ayam
berada dalam titer protektif
3. Jika ayam dalam titer protektif dapat disimpulkan bahwa
ayam menghasilkan antibodi pasca vaksin
4. Jika terdapat titer tetapi ayam tidak divaksin, kemungkinan
ada challenge dari lapangan dan harus dilakukan analisa
kembali terkait kondisi ayam dan lingkungan.
5. %CV (Coefisien Variant) berada pada target % CV artinya
titer antibodi seragam
o <40% excellent
o 40-60% good
o >60% need to improve
5. VI index (vaccination Index) untuk evaluasi keberhasilan
vaksinasi :
o Good vaccination response (high VI score) & poor
vaccination response (low VI score)
MYCOTOXIN TEST
A. Macam pengetesan :
1.Feed : Ochratoxin
T2 Toxin
Aflatoxin
Deoxynivalenol (DON)
Fumonisin
Zearalenon
2. Organ : Aflatoxin HS
MYCOTOXIN FEED
 1 20gr sampel+100ml methanol 70% Ochra, T2, Afla, Fumo, Zea
menggunakan kit Romer
2 20gr sampel +100ml Aquades steril Deoxynivalenol
Preparasi sampel

Kocok ±3 menit (homogen)

Preparasi sampel
Saring supernatan dengan kertas saring
Whatman

Cek pH (6-8), jika <6 + NaOH 1 mol)

1ml ekstraksi + 3ml Aquadest steril Deoxynivalenol Pengenceran hasil ekstraksi

50µl ekstraksi + 950µl Aquades steril Fumonisin

1ml ekstraksi + 4ml Methanol 70% Zearalenon

Hasil ekstraksi Ochra, T2, Aflatoxin

Conjugate
Ekstraksi 100µl +Conjugat 200µl
dalam dillution whell

5 lubang pertama diisi dengan kontrol / standard,

100µl ke dalam test whell dilanjutkan dengan sampel pada lubang berikutnya
next
1 Inkubasi 10 menit Ochra, T2, Afla, Fumo, Zea

2 15 menit Deoxynivalenol

Cuci 5x dengan aquades steril Ochra, T2, Afla, Fumo, Zea Substrate
Cuci 5x dengan wash sollution Deoxynivalenol
concentrate

keringkan
Substrat 100µl ke dalam test whell Stop sollution

Inkubasi 5 menit
Stop sollution 100µl
Baca dengan elisa reader 450nm &
650nm (Gen 5 software)

Romer Mycotoxin kit test

 Interpretasi Hasil Mycotoxin Test (Feed)

Maximum levels depending on feed in ppb : Refers to standard EU

LOD (limit of detection) in ppb :
Ochratoxin A : 0,5-30
Ochratoxin A : 1,9
T2 Toxin : 50-1000
T2 Toxin : 10
Deoxynivalenol (DON) : 200-1750
Aflatoxin :3
Fumonisin : 200-4000
Deoxynivalenol (DON) : 200
Fumonisin : 200 Zearalenon : 20-100
Maximum level dipending on feed in SNI :
Zearalenon : 20
Aflatoxin : 50
MYCOTOXIN ORGAN
Preparasi sampel Fresh organ liver 10gr + 50ml methanol 70%

Blender ±1 menit (homogen)

Saring supernatan
Aflatoxin HS kit test (Neogen)
Cek pH (6-8), jika <6 + NaOH 1 mol)

Ekstraksi 100µl +Conjugat 100µl

Dillute dilluted plate Dillution plate Antibody coated plate

5 whell pertama
100µl ke dalam antibody coated plate
diisi dengan kontrol
0,1,2,4,8 ppb
Inkubasi 10 menit
Pengetesan

Cuci 5x dengan aquades steril

Substrate
keringkan
Substrat 100µl ke dalam test whell

Inkubasi 10 menit

Stop sollution 100µl Stop sollution

Baca dengan elisa reader 450nm (Gen 5 Software)
Interpretasi Hasil Mycotoxin Test (Organ)
LOD aflatoxin HS : 0,5 ppb
Salmonella & MG plate test
25µl serum + 25µl antigen
(1:1)
Shake 2 menit

Baca hasil

Antigen Salmonella pulorum

(-) : non aglutinasi

(+) : aglutinasi
Hasil :

Antigen MG
Rapid test AI
A. Tujuan : untuk deteksi kualitatif antigen avian influenza type A di kloaka
B. Metode :
1.Swab kloaka ayam diambil dengan menggunakan disposable swab atau cotton bud steril
2.Masukkan disposable swab ke dalam diluent tube dan mix hingga sampel swab larut dalam diluent
3.Ambil supernatan dengan dropper
4.Aplikasikan 6 drop dalam sample hole
5.Hasil test dibaca setelah 10 menit
D. Hasil :

1. Invalid test : tidak muncul garis ungu pada C

(control) dan T (test), atau muncul garis hanya pada T
(test)
2. (+) : muncul garis ungu pada C (control) dan T (test)
3. (-) : muncul garis ungu pada C (control)