FLOWCYTOMETRY

Definisi
Flowcytometry adalah metode pengukuran (metry)
jumlah dan sifat-sifat sel (cyto) yang dialirkan ke dalam
cairan (flow) melalui celah sempit yang ditembus oleh
seberkas sinar laser
Kegunaan Flowcytometry
• Menganalisis ekspresi permukaan sel dan molekul
intraseluler
• Mengkarakterisasi dan mendefinisikan berbagai jenis
sel dalam populasi sel heterogen
• Menilai kemurnian subpopulasi yang terisolasi dan
menganalisis ukuran dan volume sel.
• Analisis dan pemisahan subpopulasi limfosit
• Pemisahan limfosit yang memproduksi berbagai kelas
imunoglobulin
• Memisahkan sel hidup dari sel mati.
• Analisis kinetik atau siklus sel dan kandungan DNA atau
RNA
Gambar 1. Ikhtisar sitometer
aliran. Cairan selubung
memfokuskan suspensi sel,
menyebabkan sel melewati
sinar laser satu sel pada satu
waktu. Cahaya yang tersebar
ke depan dan samping
terdeteksi, serta fluoresensi
yang dipancarkan dari sel yang
tercat
• Cahaya yang tersebar dari sel atau partikel terdeteksi saat
mereka melewati sinar laser. Sinyal-sinyal itu dikonversikan
menjadi angka digital dan diperlihatkan pada suatu histogram
yang dapat dianalisis untuk memperoleh informasi tentang
karakteristik sel bersangkutan

• Sebuah detektor di depan berkas cahaya mengukur hamburan

ke depan (FS) dan beberapa detektor untuk hamburan ukur
sisi (SS). Detektor fluoresensi mengukur fluoresensi yang
dipancarkan dari sel atau partikel bernoda positif.
Gambar 2. Pancaran sinar laser saat melewati sel dan ditangkap oleh detektor
• FS berkorelasi dengan ukuran sel dan SS sebanding dengan
granularitas sel (kompleksitas bagian dalam partikel, seperti
ukuran nukleus, tipe granula sitoplasma, dan kekasaran
membran plasma)
• Dengan cara ini, populasi sel sering dapat dibedakan
berdasarkan perbedaan ukuran dan granularitasnya saja.
Gambar 3. Cahaya
tersebar saat laser hijau
menginterogasi sel. Arah
cahaya yang tersebar oleh
sel berkorelasi dengan
ukuran sel dan
granularitas
Contoh penggunaan flow cytometer pada sampel darah.
• Sel granulosit yang lebih besar dan lebih granular menghasilkan
populasi besar dengan SS dan FS tinggi.
• Monosit adalah sel besar, tetapi tidak begitu granular, sehingga ini
menghasilkan populasi terpisah dengan FS tinggi tetapi SS lebih
rendah.
• Limfosit dan limfoblas yang lebih kecil menghasilkan populasi yang
terpisah dengan FS yang lebih sedikit. Mereka bukan sel granular, jadi
memiliki yang SS rendah.
• Selain memisahkan sel berdasarkan FS dan SS, sel juga dapat
dipisahkan dengan apakah mereka mengekspresikan protein
tertentu. Dalam hal ini, fluorokrom sering digunakan untuk menodai
protein yang diinginkan.
• Fluorokrom menyerap dan melepaskan cahaya pada panjang
tertentu.
• Cahaya yang tersebar ke depan dan samping dan fluoresensi dari sel-
sel yang ternoda dibagi menjadi panjang gelombang yang ditentukan
dan disalurkan oleh seperangkat filter dan cermin di dalam sitometer
aliran.
• Cahaya fluoresen disaring sehingga setiap sensor akan mendeteksi
fluoresensi pada panjang gelombang tertentu. Sensor-sensor ini
disebut tabung photomultiplying (PMTs).
Gambar 4. Cahaya fluoresen disaring sehingga setiap PMT
(photomultiplying) mendeteksi panjang gelombang tertentu. PMT mengubah
energi foton menjadi sinyal elektronik - tegangan
• Dalam contoh yang ditunjukkan pada Gambar 4, saluran FITC
(fluorescein isotiosianat) PMT akan mendeteksi cahaya yang
dipancarkan dari FITC pada panjang gelombang sekitar 519 nm. PMT
saluran PE akan mendeteksi cahaya yang dipancarkan dari PE
(phycoerythrin) pada panjang gelombang 575 nm.
• Setiap PMT (photomultiplying) juga akan mendeteksi fluorochromes
lain yang memancarkan pada panjang gelombang yang sama dengan
fluorochrome yang dideteksinya
 FILTER  memilih panjang
gelombang
1. Band Pass (BP) – rentang
1 2 tertentu
2. Long Pass (LP) – sama atau
lebih

3 4 3. Short Pass (SP) – kurang

atau sama
(4) Filter/Cermin Dicroic –
yang gak cocok dibelokin

λ pendek
SP BP LP λ panjang
 1. Pemisahan sinyal

Gambaran Hasil

Hanya sinyal di rank yang

dinilai (ini SP)
 Staining Antibodi
Langsung Tidak Langsung Intrasel

1. Langsung pakai AB 1. Memperkuat sinyal 1. Antigen sasaran ada di

florokrom dengan antibodi dalam sel
2. Menghindari pengikatan perantara
non spesifik 2. 2 atau lebih tahapan
3. Ex: FTIC
 Memilih konjugasi fluorokrom

• Tergantung kontras yang

dibutuhkan untuk membedakan
sel
• Sel umumnya tidak floresensi
alami
• Paling sering FITC (hijau-kuning,
519 nm), DAPI (biru, 455 nm), PI
(merah, 617 nm), PE (merah-
oranye, 578 nm)
 RINGKASAN

http://flowlab-childrens-harvard.com/new_user
https://www.youtube.com/watch?v=ugcYbhUzMvs&t=264s
 PRAKTIKUM
Enumerasi Penanda CD3/CD4/CD45 Pada Sel T
 Alat dan Bahan
1. Sampel darah vena 3 mL
dalam tabung vakum EDTA dan ditutup rapat (pada suhu kamar, sampel stabil
<30 jam). Jika tidak langsung digunakan, dapat disimpan terlebih dahulu pada
suhu 4oC. Dapat membeku (menggumpal/hemolisis) setelah 48 jam
2. Tabung BD Trucount
berisi lycophilized pellet yang akan melepaskan fluorescent beads yang
diketahui jumlahnya apabila ke dalam tabung ditambahkan reagen
monoklonal antibodi dan darah EDTA, gunanya adalah untuk menghitung
jumlah absolut leukosit.
3. Reagen BD Tritest CD3/CD4/CD45
terdiri dari CD3 FITC/ CD4 PE/ CD45 Per-CP. Reagen tersebut merupakan
reagen imunofluoresen tiga warna untuk identifikasi absolut limfosit T CD3,
limfosit T CD3+CD4+.
4. FACS Lysing Solution
 Preparasi Sampel

* 450 µL FACS Lysing

2 µL reagen BD 50 µL darah (revers
Solution
Tritest pipetting)

Beri label
di tabung
*
Trucount
*Campur/aduk dengan
vorteks, inkubasi 15 menit
suhu ruang, gelap Siap Analisis
 ANALISIS

1. Buka software
2. Kalibrasi {pilih Lyse Wash (LW)/Lyse No Wash (LNW) } dan setup
3. Pasang sampel, tekan run dan medium
4. (muncul hasil)
5. Adjustment dan manual gatting
HASIL