Spektrofotometri uv-vis

Pertemuan I
MK PERALATAN LAB KLINIK LANJUT
Pengertian Spektrofotometri
Spektrofotometri merupakan suatu
metoda analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan  sinar
monokromatis oleh suatu lajur larutan
berwarna pada panjang gelombamg
spesifik dengan menggunakan
monokromator prisma atau kisi
difraksi dengan detektor cahaya.
Prinsip spektrofotometri
 Larutan sampel dikenai radiasi
elektromagnetik, sehingga menyerap
energi / radiasi kemudian terjadi
interaksi antara radiasi
elektromagnetik dengan materi
(atom/molekul)
 Jumlah intensitas radiasi yang diserap

oleh larutan sampel dikonversi dengan

konsentrasi analit  data kuantitatif
Analisis Spektrofotometri
 Analisis spektrofotometri : analisis kimia
yang didasarkan pada pengukuran intensitas
warna larutan yang akan ditentukan
konsentrasinya dibandingkan dengan larutan
standar, yaitu larutan yang telah diketahui
konsentrasinya.
 Penentuan konsentrasi didasarkan pada

absorpsimetri, yaitu metode analisis kimia

yang didasarkan pada pengukuran absorpsi
(serapan) radiasi gelombang
elektromagnetik.
 Spektrofotometri adalah pengukuran
konsentrasi larutan dengan menggunakan
instrumen

 Spektrofotometer : instrumen yang

digunakan untuk mengukur jumlah cahaya
yang diserap atau intensitas warna yang
sesuai dengan panjang gelombang

 Pengukuran kuantitatif dari cahaya yang

diserap terukur dalam bentuk Transmitansi
dan absorbansi tersebut.
 Spektrofotometri UV-VIS
 Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara
spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan
dua buah sumber cahaya berbeda, sumber
cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun
untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan
hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan
Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan
monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling
banyak tersedia dan paling populer digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan
baik untuk sample berwarna juga untuk sample
tak berwarna.
Rumus dasar spektrofotometri
V = Wave Number (cm ) -1

l = panjang gelombang (nm-1)

C = kecepata cahaya = 3 x 1010 cm/sec.
u = frekuensi (Hz) V =  

C 
Energi foton :
C C C
E = h = h  =  =
  

h (Tetapan Planck) = 6.62 x 10- (Ergsec) 27

Spektrum elektromagnetik
Panjang
Tipe Radiasi Frekuensi (Hz)
Gelombang
Gamma-rays 1020-1024 <1 pm

X-rays 1017-1020 1 nm-1 pm

Ultraviolet 1015-1017 400 nm-1 nm

Visible 4-7.5x1014 750 nm-400 nm

Near-infrared 1x1014-4x1014 2.5 µm-750 nm

Infrared 1013-1014 25 µm-2.5 µm

Microwaves 3x1011-1013 1 mm-25 µm

Radio waves <3x1011 >1 mm

Hubungan antara warna pada sinar tampak
dengan panjang gelombang :
warna yang Warna yang Panjang
teramati diserap gelombang
Green Red 700 nm

Blue-green Orange-red 600 nm

Violet Yellow 550 nm

Red-violet Yellow-green 530 nm

Red Green 500 nm

Orange Blue 450 nm

Yellow Violet 400 nm

Transmitansi dan Absorbansi
Transmitansi :
T = It/Io
I : intensitas cahaya setelah melewati sampel
Io : intensitas cahaya awal
Hubungan Absorbansi dengan %T :
A = 2-logT = 2-log(It/ Io)
T= (It/Io) = 10-A

%T = (It/Io) x 100

A = 2-logT = 2-log(It/Io)
RUMUS HUKUM BEER LAMBERT
 A = kd C

 A = Absorban
 k = konstanta larutan
 d = lebar kuvet
Blok diagram
Cara kerja
 sumber cahaya digunakan untuk pengukuran
serapan molekul.
 monokromator digunakan untuk memisahkan

spektrum warna sesuai dengan panjang

gelombang yang dipilih.
 detektor digunakan untuk mendeteksi

panjang gelombang cahaya yang telah

melewati sampel
 amplifier digunakan untuk meningkatkan

signal
Komponen: sumber cahaya

Spektrofotometer UV
1. Lampu Gas hidrogen
2. Lampu Merkuri
Spektrofotometer Visible
1. Lampu Tungsen
Komponen: monokromator
 Monokromator  memilih cahaya
monokromatik (Cahaya satu warna )

Cahaya merah
yang diserap
oleh larutan
hijau
Komponen: detektor
Berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari
sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik.
Syarat-syarat sebuah detektor :
 Kepekaan yang tinggi

 Perbandingan isyarat atau signal dengan bising

tinggi
 Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.

 Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa

radiasi.
 Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding

dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor:
 Photo diode
 Photocell, misalnya CdS.
 Phototube
Tipe Instrumen Spektrofotometer
1. Single-beam instrument ( satu berkas sinar
) digunakan untuk kuantitatif dengan
mengukur absorbansi pada panjang
gelombang tunggal. Single beam
menghasilkan pengukuran sinar UV dan
sinar tampak. Skema Instrumen Single
Beam :
 2. Double-beam instrument ( dua berkas
sinar ) Instrument yang digunakan dengan
panjang gelombang 190 samapai 750 nm,
mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh
potongan cermin yang membentuk V yang
disebut pemecahan sinar. Skema instrumen
Double Beam :
Aplikasi spektrofotometer UV
Protein

Glucose Determination
Enzyme Activity
(Hexokinase)
Amino Acids (aromatic)
Aplikasi spektrofotometer visible
 Niacin
 Pyridoxine
 Metal Determination
 Fat-quality Determination (TBA)
 Enzyme Activity (glucose oxidase)
 Larutan yang dapat dianalisis dengan
spektrofotometer visible  senyawa yang
berwarna
 Contoh : KMnO4
 Apabila senyawa tersebut tidak berwarna,
maka perlu ditambahkan pengompleks yang
dapat membentuk warna
 Contoh : analisis logam Pb
 Contoh alat
Spectronik 20 Digital Display Mode Knob
1. Dengan ruang sampel Sample Chamber (set to Trans)
kosong, mengatur
panjang gelombang yang
diinginkan kemudian
menyesuaikan diri
dengan T 0% dengan
tombol kanan pada panel
depan.
2. Masukkan larutan
blanko, tutup dan
menyesuaikan T 100%
dengan tombol kanan
pada panel depan.
Filter Lever
3. Solusi Insertdye, Wavelength Knob
0-100%T Knob
membaca dan mencatat
nilai% T.
4. Mengubah * panjang
gelombang, ulangi
langkah 2-4
Sekian terimakasih