Rekayasa Sel:

Hibridoma dan Transplantasi Sel/Jaringan

Hibridoma
Hibridoma:
Hasil fusi sel B dengan sel mieloma (kanker sel B) Memproduksi antibodi monoklonal Sel B diperoleh dari binatang yang telah diimunisasi dengan antigen tertentu sel mieloma yang digunakan dalam proses fusi adalah sel mieloma yang tidak memproduksi enzim HGPRT (Hypoxanthine guanine phosphoribosyltranseferase) Dapat diseleksi agar diperoleh sel hibridoma yang menghasilkan antibodi sesuai keinginan Hibridoma dapat berkembang biak secara cepat dan tidak terbatas karena memiliki sifat sel kanker, tetapi memproduksi antibodi sesuai dengan antibodi yang dihasilkan oleh sel B yang berfusi dengan sel mieloma

CELLS OF THE IMMUNE SYSTEM

Hibridoma
Sel B untuk fusi hibridoma:
Merupakan populasi sel-sel plasma spesifik terhadap suatu antigen tertentu (memproduksi antibodi spesifik) Berasal dari limpa (spleen) mencit yang telah diimunisasi dengan antigen tertentu selama beberapa minggu melalui tahapan priming dan booster :
Sebagian besar populasi sel B dalam limpa merupakan selsel B spesifik terhadap antigen yang digunakan dalam imunisasi

Sel B dari limpa mencit mengandung enzim HGPRT (HGPRT+) Sel B tidak bersifat imortal :
pada kultur sel tidak berkembang biak sehingga akhirnya akan mati

Hibridoma
Sel mieloma untuk fusi hibridoma:
Harus kompatibel dengan sel-sel B yang akan digunakan pada proses fusi:
Berasal dari spesies yang sama Berasal dari galur yang sama

Terlebih dahulu kultur sel mieloma yang akan digunakan pada proses fusi dipastikan tidak memproduksi enzim HGPRT (HGPRT-) Pemastian kultur sel mieloma tidak mengandung sel-sel yang memproduksi HGPRT (HGPRT+) dilakukan dengan kultur sel dalam medium mengandung 8-azaguanine:
Sel mieloma mengandung HGPRT (HGPRT+) tidak tahan terhadap 8-azaguanine, suatu analog purin kematian sel mieloma HGPRT+

Hibridoma
HGPRT (Hypoxanthine guanine phosphoribosyltranseferase)
Berfungsi dalam menyelamatkan purin pada degradasi DNA (salvage pathway) agar terjadi pembaruan sintesis purin Salvage pathway:
jalur sintesis nukleotida (purin dan pirimidin) dari bentuk intermedier pada jalur degradasi nukleotida Digunakan untuk memakai kembali basa dan nukleosida yang terbentuk dalam proses degadasi RNA dan DNA Jalur ini penting untuk sel-sel/jaringan yang tidak dapat melakukan sintesis de novo (sintesis baru tanpa menggunakan bentuk intermedier hasil degradasi nukleotida)

Hibridoma
Medium HAT (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine)
Medium selektif untuk kultur sel mamalia Aminopterin menghambat kerja enzim dihidrofolat reduktase suatu enzim yang berperan dalam sintesis DNA secara de novo (sintesis baru tanpa melalui salvage pathway) Timidin dan Hipoxantin merupakan bahan baku untuk mengatasi hambatan sintesis de novo dengan menggunakan salvage pathway Timidin dalam medium HAT dapat diserap oleh sel dan difosforilasi oleh Thymidine kinase (TK) menjadi TMP (timidin monofosfat), TMP digunakan untuk sintesis timidin trifosfat (TTP) Hypoxantin dalam medium HAT dapat diserap oleh sel dan bereaksi dalam sel dengan PRPP melalui reaksi yang dikatalisis oleh enzim HGPRT jalan pintas salvage pathway tanpa sintesis de novo

Hibridoma
Dihydrofolate Reductase
Memproduksi tetrahidrofolat (THF) melalui reduksi dihidrofolat:
Tetrahidrofolat dibutuhkan untuk sintesis dUMP yang dibutuhkan untuk sintesis timidin monofosfat (TMP), TMP digunakan dalam sintesis timidin trifosfat (TTP) sebagai salah satu prekursor nukleotida yang diperlukan dalam sintesis DNA oleh polimerase DNA Sintesis IMP (prekursor GMP dan GTP) juga membutuhkan THF

Hibridoma
Proses pembuatan hibridoma:
Splenosit (mengandung sel-sel B) tikus yang telah diimunisasi difusikan dengan sel mieloma (HGPRT-) menggunakan PEG (polyethylene glycol) atau virus sendai Campuran sel yang telah melalui proses fusi dikultur dalam medium HAT untuk mematikan sel-sel mieloma yang tidak berfusi Sel B yang tidak berfusi pada akhirnya akan mati karena tidak bersifat imortal

Hibridoma
Seleksi hibridoma:
Kultur dalam medium HAT hanya memungkinkan pertumbuhan Hibrid sel B dan sel mieloma (karena mengandung HGPRT dari sel B dan sifat imortal dari sel mieloma) Sel-sel hibrid hasil fusi perlu ditumbuhkan secara terpisah untuk mendapatkan kultur sel hibridoma yang berasal dari satu sel saja untuk mendapatkan klon tunggal (monoklonal).

Hibridoma
Seleksi hibridoma:
Pemisahan sel hibridoma dilakukan dengan pengenceran suspensi sel dan dimasukkan dalam sumur pelat kultur Setelah sel hibridoma dalam setiap sumur berkembang biak membentuk koloni, dilakukan deteksi antibodi spesifik di dalam setiap sumur untuk identifikasi klon hibridoma penghasil antibodi yang diinginkan

PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY

HYBRIDOMA TECHNOLOGY

PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY

HYBRIDOMA TECHNOLOGY Step 1: - Immunization Of Mice & Selection Of Mouse Donor For Generation Of Hybridoma cells
ANTIGEN ( Intact cell/ Whole cell membrane/ micro-organisms ) + ADJUVANT (emulsification)

Mice immunization

Ab titre reached in Serum

Spleen removed (source of cells)

PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY

HYBRIDOMA TECHNOLOGY Step 2: - Screening Of Mice For Antibody Production
After several weeks of immunization
Mice immunization

Serum Antibody Titre Determined (Technique: - ELISA / Flow cytometery) Titre High
2 weeks

Titre too low

BOOST (Pure antigen)

BOOST (Pure antigen)

PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY

HYBRIDOMA TECHNOLOGY Step 3: - Preparation of Myeloma Cells

Myeloma Cells

+8 Azaguanine

Immortal Tumor Of Lymphocytes

Myeloma Cells
HGPRTHigh Viability & Rapid Growth

PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY

HYBRIDOMA TECHNOLOGY Step 4: - Fusion of Myeloma Cells with Immune Spleen Cells & Selection of Hybridoma Cells
PEG FUSION SPLEEN CELLS MYELOMA CELLS Feeder Cells Growth Medium
1. Plating of Cells in HAT selective Medium Scanning of Viable Hybridomas

HYBRIDOMA CELLS 2. ELISA PLATE HAT Medium

PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY

HYBRIDOMA TECHNOLOGY Step 4: - Cloning of Hybridoma Cell Lines by Limiting Dilution or Expansion A. Clone Each +ve Culture B. Test Each Supernatant for Antibodies C. Expand +ve Clones

Tissue Cultur e Metho d

Mouse Ascite s Metho d

PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY

HYBRIDOMA TECHNOLOGY

Transplantasi
Transplantasi sel punca hematopoietik
Transplantasi sel punca darah yang berasal dari sumsum tulang (bone marrow) transplantasi sumsum tulang Sering digunakan untuk pengobatan orang dengan penyakit darah, sumsum tulang dan beberapa jenis kanker

Transplantasi
Transplantasi sel punca hematopoietik
Adanya faktor-faktor pertumbuhan GM-CSF G-CSF, sebagian besar prosedur transplantasi darah saat inimenggunakan sel punca yang diperoleh dari darah tepi (tidak dari sumsum tulang) :
Lebih banyak sel yang dapat dicangkokkan Tidak memerlukan anestesi umum untuk pengumpulan cangkokan (proses pencangkokan lebih singkat) Laju kekambuhan penyakit lebih rendah dan lebih lama

Soal Biologi sel

Jelaskan mengapa pasca fusi splenosit dengan mieloma digunakan medium HAT untuk seleksi hibridoma?