Aktivitas Imunomodulator dari Ekstrak Air Daun Moringa oleifera Lam.

Dalam Sel CD4+, CD8+, dan B220+ di Mus musculus Secara In Vitro

Imunomodulator merupakan senyawa tertentu yang dapat meningkatkan

mekanisme pertahanan tubuh baik secara spesifik maupun non spesifik, dan
terjadi induksi non spesifik baik mekanisme pertahanan seluler maupun humoral.
Pertahanan non spesifik terhadap antigen ini disebut paramunitas, dan zat
berhubungan dengan penginduksi disebut paraimunitas. Induktor semacam ini
biasanya tidak atau sedikit sekali kerja antigennya, akan tetapi sebagian besar
bekerja sebagai mitogen yaitu meningkatkan proliferasi sel yang berperan pada
imunitas. Sel tujuan adalah makrofag, granulosit, limfosit T dan B, karena
induktor paramunitas ini bekerja menstimulasi mekanisme pertahanan seluler.
Mitogen ini dapat bekerja langsung maupun tak langsung misalnya melalui sistem
komplemen atau limfosit, melalui produksi interferon atau enzim lisosomal untuk
meningkatkan fagositosis mikro dan makro. Mekanisme pertahanan spesifik
maupun non spesifik umumnya saling berpengaruh. Dalam hal ini pengaruh pada
beberapa sistem pertahanan mungkin terjadi, hingga mempersulit penggunaan
imunomodulator.
Imunomodulator adalah zat yang mampu memodulasi fungsi dan
mengaktivitas sistem kekebalan tubuh. Moringa oleifera Lam. adalah salah satu
spesies yang dikenal memiliki aktivitas imunomodulator pada sistem kekebalan
tubuh.
Mekanisme pertahanan tubuh ini dibagi atas 3 fase :
1. Immediate phase, ditandai oleh terdapatnya komponen sistim imun
kongenital (makrofag dan neutrofil), yang beraksi langsung terhadap
patogen tanpa diinduksi. Jika mikroorganisme memiliki molekul
permukaan yang dikenali oleh fagosit (makrofag dan neutrofil) sebagai
benda asing, akan diserang atau dihancurkan secara langsung. Bila
mikroorganisme dikenali sebagai antibodi, maka protein komplemen yang
sesuai yang berada diplasma akan berikatan dengan mikroorganisme,
kompleks ini kemudian dikenal sebagai benda asing oleh fagosit dan
kemudian diserang atau dihancurkan.
 2. Acute-phase proteins atau early phase, muncul beberapa jam kemudian,
diinduksi, tetapi masih bersifat non spesifik, timbul bila fagosit gagal
mengenal mikroorganisme melalui jalur diatas. Mikroorganisme akan
terpapar terhadap acute-phase proteins (APPs) yang diproduksi oleh
hepatosit dan kemudian dikenali oleh protein komplemen. Kompleks
mikroorganisme, APPs, dan protein komplemen kemudian dikenali oleh
fagosit dan diserang serta dihancurkan.
3. Late phase, merupakan respon imun didapat timbul 4 hari setelah infeksi
pertama, ditandai oleh clonal selection limfosit spesifik. Pada fase ini
dibentuk molekul dan sel efektor pertama.

Moringa oleifera Lam.

Class : Equisetopsida
Subclass : Magnoliidae
Superorder : Rosanae
Order : Brassicales
Family : Moringaceae
Genus : Moringa

Moringa oleifera Lam. adalah Keluarga Moringaceae yang paling dikenal dan
didistribusikan secara luas di dunia. Tanaman ini memiliki nilai tinggi karena
hampir semua bagian tanaman (daun, akar, batang, bunga, kulit buah dan biji)
dapat digunakan sebagai makanan bergizi tinggi dan juga telah dilaporkan
memiliki senyawa antimikroba. Tanaman ini juga berfungsi sebagai pembangun
sistem kekebalan tubuh dan digunakan di beberapa negara untuk mengatasi
kekurangan gizi dan malaria. Ramuan ini telah terpilih karena senyawa fitokimia
yang kaya, yang termasuk saponin, karotenoid, senyawa fenolik dan flavonoid.
Saponin dan flavonoid berfungsi sebagai imunomodulator alami yang diharapkan
dapat meningkatkan pengembangan sel limfosit yang sangat penting dalam sistem
kekebalan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Hefni, ekstrak air
Moringa oleifera yang diberikan secara oral kepada tikus yang terinfeksi
Salmonella typhi menunjukkan efek imunomodulator karena mampu
meningkatkan jumlah populasi sel HSC (CD34 +), limfosit B ( B220 +), prekursor
eritrosit (TER119 + 4 + VLA-), eritrosit dewasa (TER119 +), ekspresi sel T naif
(CD62L +) dan sitokin proinflamasi IFN-γ. Oleh karena itu, penelitian ini
bertujuan untuk menilai efek dari ekstrak air Moringa oleifera Lam. daun untuk
populasi sel T CD4 +, CD8 + dan B220 + pada Mus musculus melalui studi in
vitro dan untuk menganalisis perbedaan respon imun dalam pengobatan dan
kelompok non-perlakuan (kontrol).

Bahan dan Peralatan

Bahan yang digunakan adalah ekstrak air daun Moringa oleifera, Mus
musculus Balb / C, RPMI 1640 media, air steril, α-CD3, FBS (janin bovine
serum), 2 mercaptoethanol, antibiotik (penisilin - streptomycin), PBS, alkohol
70%, dan monoklonal antibodi (FITC tikus conjugated anti-tikus CD4, PE tikus
terkonjugasi anti - tikus CD8, PE / Cy5 tikus terkonjugasi B220 anti mouse
peralatan yang digunakan untuk penelitian ini adalah kaca erlenmeyer, botol
menengah (Schott), CO2. inkubator, membekukan mesin pengering, autoclave,
mikroskop, microtube, membran Millipore, mikropipet, jarum suntik, tabung
propylene, centrifuge, aliran BD FACS Calibur ™ cytometer, cawan petri, kawat,
gunting bedah, cuvettes, LAF (aliran udara laminar), haemositometer dan 48
sumur hidangan budaya.

Ekstraksi Moringa oleifera

Daun Moringa oleifera diperoleh dari Tirtomarto, Kecamatan Ampel
gading, Malang pada bulan Agustus 2013. Metode ini dilakukan di Laboratorium
Biokimia, Departemen Kimia, Universitas Brawijaya. Daun kelor oleifera itu
berturut-turut di ekstraksi dengan air dengan metode maserasi. Proses ekstraksi
dilakukan dengan mengambil daun matang, dicuci dan dikeringkan, kemudian
ditumbuk menjadi bubuk untuk mendapatkan bentuk simplisia. Hasil proses
ekstraksi ini adalah dalam bentuk gel. Untuk mendapatkan ekstrak kering, itu
beku kering selama ± 24 jam.
Isolasi Sel
 Mus musculus digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan, Balb / C
regangan. Hal dibunuh oleh leher dislokasi. Setelah dislokasi, mencit dibedah
menggunakan gunting bedah pada papan bedah di bagian dorsal, dan kemudian
limpa diambil dan dicuci dengan PBS. Limpa ditempatkan dalam cawan petri
yang berisi PBS ± 2ml. Organ kemudian dihancurkan dengan basis jarum suntik,
jarum jam sampai organ itu hancur. Homogenat itu dimasukkan dalam propilen
tabung 15 ml disaring dengan kawat untuk mengambil puing-puing. PBS telah
ditambahkan ke dalam tabung sampai 12 ml. Setelah itu, sel disentrifugasi pada
2500 rpm selama 5 menit dan 4⁰C. Supernatan dibuang dan pelet itu diambil.
Pelet disuspensikan oleh micropippete dalam 1 ml media RPMI. Kemudian
diambil 20 ml ke dalam microtube sebuah, dihomogenisasi dengan 80 ml evans
pewarna biru, dan ditempatkan dalam haemositometer untuk menghitung jumlah
sel-sel hidup dengan mikroskop. Sel-sel hidup yang ditandai dengan sel-sel yang
tidak bernoda biru. Jumlah sel yang diperlukan untuk budaya adalah 3x106 sel
untuk setiap baik.

Kultur Sel dan Pengobatan

Sel-sel ditumbuhkan dalam media RPMI 1640 ditambah dengan 10% fetal
bovine serum (FBS), antibiotik (penisilin & streptomycin), 1% αCD3,
mercaptoethanol, masing-masing Media dicampur dengan tiga dosis ekstrak
Moringa oleifera (0,1 mg / ml, 1 mg / ml, 10 mg / ml) dan 0 mg / ml (kontrol).
Semua proses dilakukan di Laminar Air Flow (LAF) dengan ruang steril dan
metode aseptik untuk menghindari kontaminasi. Peralatan untuk kultur sel berada
di bawah kondisi steril dengan autoklaf di 121⁰ C. Jumlah alkohol 70% digunakan
untuk disterilkan permukaan LAF. Selanjutnya, hidangan disimpan di inkubator
CO2 dengan 37⁰C suhu, 5% CO2 selama empat hari. Pemanenan sel dilakukan
setelah empat hari kultur sel dengan perlahan-lahan pipetting medium, kemudian
meletakkannya di 15 ml propylene tabung. Selanjutnya, hasil disentrifugasi pada
2.500 rpm selama 5 menit dan 4⁰C. Supernatan dibuang dan pelet itu diambil,
diresuspensi dengan 1 ml PBS. Hasilnya dibagi menjadi dua microtube untuk dua
kelompok pewarnaan antibodi. Total 500 mL PBS ditambahkan ke masing-
masing tabung mikro, dan kemudian disentrifugasi lagi. Supernatan dibuang dan
pelet itu diambil. Pelet siap untuk diberi label dengan antibodi spesifik.

Pewarnaan antibodi
Pewarnaan ekstraseluler dilakukan oleh antibodi dan dibagi menjadi dua
kelompok pewarnaan, kelompok A (CD4 +, CD25 +, B220 +) dan kelompok B
(CD4 +, CD8 +, CD62L +). Hal itu dilakukan dengan menambahkan 50 mL
antibodi spesifik untuk pelet sentrifugasi kedua, di pipet, diinkubasi dalam kotak
es, ditambahkan 300 mL PBS dan ditransfer ke aliran cytometry Cuvet.

Analisis Arus Cytometry

Analisis aliran cytometric adalah untuk menentukan jumlah sel CD4 +,
CD8 + dan B220 +. Setelah transfer ke dalam aliran cytometry Cuvet, sampel siap
untuk analisis sesuai dengan parameter yang telah ditetapkan dalam aliran
cytometry Mesin FACS Calibur. Diperoleh hasil dianalisis dengan Sel Quest
ProTM perangkat lunak dan data dianalisis menggunakan ANOVA satu arah
dengan α = 0,05 dengan SPSS 16.0 for windows dengan rancangan acak lengkap.

KESIMPULAN
Ekstrak air daun M. oleifera memiliki aktivitas sebagai imunomodulator
melalui itu senyawa aktif, seperti saponin dan flavonoid, yang bertindak sebagai
imunostimulan pada CD4 + (sel T helper) dan CD4 + (sel T sitotoksik), serta
B220 +. Dosis rendah (0, 1 mg / ml) efektif untuk meningkatkan jumlah sel CD4
+ dan CD8 +, sedangkan dosis tinggi (10 mg / ml) efektif untuk meningkatkan
jumlah sel B220 +.