LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

PEMBUATAN MEDIA KULTUR

DISUSUN OLEH :
NAMA
NIM
KELOMPOK
ASISTEN

: NANANG BUDI SANTOSO

: 115040201111134
: SENIN, JAM 13.00
: KHOIRUN ENISSA

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012
BAB I PENDAHULUAN
1.1

Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan
tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik
perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman
seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut
dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat
pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya
sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi
menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan

adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif

tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan
kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan
jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik
seharusnya menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro,
sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur
tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa,
ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan juga
menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman.
Unsur hara makro dan mikro diberikan dalam bentuk garamgaram anorganik. Pada umumnya biasa diberikan dalam komposisi
tertentu seperti komposisi media MS, WPM, B5, White, dan lain-lain
tergantung dari jenis tanaman yang akan dikulturkan. Vitamin yang
banyak digunakan adalah vitamin B12 (thiamin), Nicotinic Acid,
vitamin B6 (pyridoxine), dan vitamin E atau C yang digunakan
sebagai antioksidan. Asam amino dipakai sebagai sumber N organik,
yang biasa digunakan adalah glycine, asparagin, glutanin, alanin, dan
threonin.
Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) sangat penting dalam pembutan
media kultur jaringan. Zat pengatur tumbuh adalah suatu
persenyawaan organik yang dalam jumlah sedikit (1 mM) dapat
merangsang, menghambat atau mengubah pola pertumbuhan dan
perkembangan tanaman.Dalam kultur jaringan ZPT penting:
sitokinin (Kinetin, BA, Zeatin, 2iP, Thidiazuron), auksin (IAA,
NAA, IBA, 2.4-D, 2.4.5-T, Dicamba, Picloram). Kedua ZPT ini
mempunyai fungsi masing-masing yang berbeda, sitokinin
mempengaruhi pembelahan sel serta pembentukan organ seperti
pucuk dan pembentukan embrio somatik. Auksin dipakai untuk
menginduksi pembentukkan sel dan akar. Kombinasi antara auksin
dan sitokinin berfungsi untuk menginduksi pertumbuhan kalus.
Selain auksin dan sitokinin digunakan juga giberelin(menginduksi
pemanjangan tunas dan perkecambahan embrio, dan menghambat
pengakaran) dan retardan (untuk menghambat pertumbuhan tunas)
seperti pachlobutrazol.
Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media
sebagai sumber pembentuk asam amino dan vitamin. Senyawa

organik yang sering ditambahkan adalah air kelapa, ekstrak ragi,

ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai sumber energi
ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber
karbohidrat, seperti sukrosa (paling baik pada tanaman umumnya),
glukosa, fruktosa, dam maltosa. Penambahan arang aktif berfungsi
untuk mengarbsorbsi senyawa-senyawa fenolik dan untuk
merangsang pertumbuhan akar.
Selain ditambahkan oleh senyawa-senyawa tersebut, media
yang baik harus selalu berada dalam PH yang optimal yaitu 5,5-5,8.
selain itu, harus dibuat dalam tempat yang steril. Autoclave sering
dipakai untuk sterilisasi dalam pembuatan media kultur jaringan.
1.2

Tujuan
Tujuan dari praktikum bioteknologi bab pembuatan media
kultur, adalah :
Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang jenisjenis media pada kultur jaringan dan aplikasi
kegunaannya
Makasiswa dapat mengerti dan memahami tentang
komposisi dan fungsi unsure dalam media MS
(Murashige dan Skog)
Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang
teknik-teknik aseptik dalam pembuatan media
Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang
perhitungan larutan stok

1.3

Manfaat
Manfaat dari praktikum bioteknologi bab pembuatan media
kultur, adalah :
1. Mahasiswa dapat membuat sendiri larutan stok untuk
pembuatan media kultur jaringan sebagai pengembangan
tanaman
2. Dapat mengerti dan memahami tentang materi-materi
mengenai pembuatan media kultur dan cara aplikasinya

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Jenis-Jenis Media Pada Kultur Jaringan dan Aplikasi

Kegunaannya

Jenis-jenis media pada kulur jaringan ada bebebrapa macam,

antara lain :
1. Media Knop
Media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan
kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media

dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur

akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine,
thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dalam Dodds and Roberts, 1983).
2. Media White
Media white dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan
kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur
makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang
dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media
untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan
normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO 3- dan K+
yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi
masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum
digunakan sekarang.
3. Media Knudson dan media Vacin and Went,
Media Knudson dan media Vacin and Went, media ini
dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam
di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya
mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan
penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik
untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan
NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.
Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan
kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman
artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1
mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka
mengambil kesimpulan, bahwa NH4+ sangat menunjang pertumbuhan
kalus tembakau (Miller et al, 1956 dalam Gunawan 1988).
4. Media Murashige & Skoog (media MS)
Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan
perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam
anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur
jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk
NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali
lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali

lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi
dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM,
sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya
dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS
dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah
umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media
MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada
tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan
media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media:

Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari

komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM
ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2PO4
yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan
senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan
oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan
wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam
Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan
1998) dalam penelitian kultur anther.
Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973
dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce
dengan cara mengurangi konsentrasi K + dan NO3-, dan
menambah konsentrasi Ca2+ nya.
Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan
menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO42- untuk
keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi

pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair.
Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan
besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn
dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung
unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan,
maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO 4+, mengendap (Dalton
et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak
penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan
tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk

mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan

supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang
tetap.
5. Media Gamborg B5 (media B5)
Media Gamborg B5 (media B5) pertama kali dikembangkan
untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium
lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5
dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik
sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman..
Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain.
Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini
menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi
yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai.
Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca 2+ antara 1-4 mM, sedangkan
Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968).
6. Media Schenk & Hildebrant (media SH)
Media Schenk & Hildebrant (media SH) merupakan media
yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan
dikotil (Trigiano & Gray, 2000). Konsentrasi ion-ion dalam
komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media
Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca 2+, Mg2+, dan PO4-3
yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan
jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan
bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat
baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk
pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap
jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas
penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.
7. Media WPM (Woody Plant Medium)
Media WPM (Woody Plant Medium) yang dikembangkan
oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan
konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media
diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli
lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media
WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman

hias berperawakan perdu dan pohon-pohon. Pada umumnya media

kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan.
Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung
hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam
teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar.
Penamaan resep media dasar pada umumnya diambil dari nama
penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam
kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya.
(Suryowinoto, M. 1991)
2.2

Komposisi dan Fungsi Unsur Dalam Media MS (Murashige

dan Skogg)

Dalam media MS (Murashige dan Skogg), terddiri dari

beberapa macam unsur yang terkandung di dalamnya, antara lain,
makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan zat besi.
Jenis-jenis yang termasuk unsur makro adalah nitrogen (N),
fosfor (P), kalium (K), sulfur (S), kalsium (Ca), dan magnesium
(Mg). Unsur NPK tersedia. Sedangkan unsur S, Ca, dan Mg boleh
ada dan boleh tidak, tetapi baik apabila unsur-unsur tersebut juga
tersedia. Unsur-unsur yang termasuk di dalam unsur mikro adalah
klor (Cl), mangan (Mn), besi (Fe), tembaga (Cu), seng (Zn), bor (B),
dan molibdenum (Mo).
Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk
NH4NO3, KNO3, CaCl2, 2H2O, MGSO4.7H2O, dan KH2PO4.
Sedangkan unsur-unsur mikro biasa diberikan dalam bentuk
MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI, NaMoO4.2H2O,
CuSO4.5H2O, dan CaCl2.6H2O.
Kegunaan tiap-tiap unsur tersebut adalah sebagai berikut:
a.

Unsur Nitrogen (N)

Kegunaan Nitrogen bagi tanaman adalah untuk
menyuburkan tanaman, pembentukan hijau daun, dan

pertumbuhan vegetatif tanaman sebab unsur N dapat

membentuk protein, lemak, dan berbagai persenyawaan
organik yang lain.
b.

Unsur Fosfor (P)

Unsur P terutama dibutuhkan tanaman untuk
pembentukan karbohidrat. Maka, unsur P dibutuhkan secara
besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih, pembungaan,
pemasakan buah dan biji.

c.

Unsur Kalium (K)

d.

Unsur K berfungsi untuk memperkuat tubuh

tanaman, karena dapat menguatkan serabut-serabut akar
sehingga daun, bunga, dan buah tidak mudah gugur. Di
samping itu, unsur K juga berfungsi memperlancar
metabolisme dan mempengaruhi penyerapan makanan.
Unsur Sulfur (S)
Unsur S merupakan unsur yang penting untuk
pembentukan beberapa jenis protein, seperti asam amino dan
vitamin B1. Unsur S juga berperan dalam pembentukan
bintil-bintil akar, membantu pembentukan anakan sehingga
pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.

e.

Unsur Kalsium (Ca)

Unsur Ca terdapat pada batang dan daun tanaman
yang berfungsi merangsang pembentukan bulu-bulu akar,
mengeraskan batang dan merasang pembentukan biji karena
unsur Ca bersama Mg akan memproduksi cadangan
makanan.

f.

Unsur Magnesium (Mg)

Dengan menambahkan unsur Mg maka kandungan

fosfat dalam tanaman meningkat. Kegunaan fosfat sebagai
bahan mentah untuk pembentukan sejumlah protein, maka
pertumbuhan daun menjadi hijau sempurna dan terbentuk
karbohidart, lemak serta minyak.
g.

Unsur Besi (Fe)

Pemberian unsur Fe juga berfungsi sebagai
penyangga yang sangat penting untuk menyangga kestabilan
pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan
tanaman, pernafasan dan pembentukan hijau daun.

h.

Unsur Sukrosa
Sukrosa sering ditambahkan pada medium kultur
jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk
induksi kalus. Sukrosa dengan konsentrasi 2%-5%
merupakan sumber karbon. Penggunaaan sukrosa di atas
kadar 3% menyebabkan terjadinya penebalan dinding sel.
Pengaruh rangsangan dari gula terhadap pertumbuhan
ditentukan juga oleh cara sterilisasinya. Penggunaan autoklaf
untuk sterilisasi dapat memberikan pengaruh baik atau buruk
terhadap pertumbuhan, tergantung dari gula yang digunakan
dalam medium tersebut.

i.

Unsur Glukosa dan Fruktosa

Glukosa dan Fruktosa dapat digunakan untuk
mengganti sukrosa karena dapat merangsang pertumbuhan
beberapa jaringan. Peemilihan gula dan konsentrasi yang
akan digunakan tergantung dari jaringan tumbuhan yang
akan di kulturkan dan tujuan yang ingin dicapai.

j.

Unsur Mio-inositol

Penambahan mio-inositol pada medium bertujuan

untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah
jaringan. Bila mio-inositol diberikan bersama dengan auksin,
kinetin dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan
jaringan kalus.
k.

Unsur Vitamin
Vitamin yang sering digunakan dalam media kultur
jaringan antara lain Tiamin, Piridoksin, dan asam nikotonat.
Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel
pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim daalam
reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat dan
memindahkan energi. Asam nikotinat penting dalam reaksireaksi enzimatik, sebagai prekursor dari beberapa alkaloid.
Pemberian vitamin C bertujuan untuk mencegah terjadinya
pencoklatan pada permukaan irisan jaringan. Vitamin yang
sering ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah
niasin, glisin, piridoksin HCl, tiamin HCl, mio-inositol, asam
folat, sianokobalamin, riboflavin, iotin, kolin klorida,
kalsium pentetonat, piridoksin fosfat, nikotinamida.

l.

Unsur Asam-asam Amino

Asam amino berperan penting untuk pertumbuhan
dan diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap
tanaman berbeda-beda. Asparagin dan glutamin berperan
dalam metabolisme asam amino, karena dapat menjadi
pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam-asam
amino baru dalam jaringan.

m.

Unsur Zat Pengtur Tumbuh (ZPT)

Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa
organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat
mendukung, menghambat dan dapat merubah proses
fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman
terdiri dari lima kelompok, yaitu auksin, giberelin, sitokinin,

etilen dan inhibitor dengan ciri khas serta pengaruh yang

berlebihan terhadap proses fisiologis.
Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai
komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi.
Tanpa penambahan ZPT dalam medium, pertumbuahn sangat
terhambat bahkan tidak tumbuh sama sekali. Pembentukan
kalus dan organ-organ ditentukan oleh penggunaan yang
tepat dari ZPT tersebut.
n.

Sitokinin
sitokinin berperan dalam pembelahan sel tanaman
terutama mempengaruhi metabolisme asam nukleat dan
sintesis protein. Protein berpengaruh terhadap pembelahan
sel tanaman.

o.

Auksin
auksin berperan dalam proses merubah sifat osmotik
dari vakuola dan berpengalaman terhadap perpanjangan sel
tanaman sedangkan sitokinin berpengaruh pada pembelahan
sel dan diferensiasi sel. Pemanjangan sel ke arah vertikal
yang diikuti dengan pembesaran sel akan meningkatkan
bobot basah tanaman. Peningkatan bobot basah tanaman
terutama disebabkan meningkatnya pengambilan air oleh sel
tanaman. Air serta zat pengatur jumbuh dan nutrisi yang
terkandung dalam air kelapa masuk ke dalam sel dan dinding
sel mengembang, dengan makin besarnya sel yang terbentuk
akan berpengaruh terhadap berat basah tunas tanaman.
(Sriyanti, 1994)

2.3

Teknik-teknik Aseptik Dalam Pembuatan Media

Teknik aseptik adalah teknik pemindahan mikroba dengan

menggunakan alat-alat yang steril serta aturan laboratorium tertentu
agar tidak terjadi kontaminasi di dalam kultur tersebut.
Teknik aseptik adalah langkah-langkah yang diambil agar
dalam percobaan di laboratorium sehingga diperoleh hasil yang
akurat. Contoh dengan menghindarkan percobaan dari
mikroorganisme yang dapat mengkontaminasi produk sehingga
terjadi perubahan yang tidak diingainkan. Teknik aseptik juga
berfungsi untuk melindungi diri dari infeksi dan pencemaran
lingkungan.
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua
organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi
basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat
tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang
berkisar antara 110-1210C. Sterilisasi yang umum dilakukan dapat
berupa:
Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar
gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa
kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai
akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas,
dipergunakan alat bejana/ruang panas (oven dengan
temperatur 170o 180oC dan waktu yang digunakan adalah 2
jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan

disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan

yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan
mengalami
perubahan,
misalnya
adalah
dengan
saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain
adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang
lewat (dalam hal ini adalah mikroba).
(Anonymous a, 2012)

Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode

sterilisasi dengan uap air dibawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa,

perlatan laboratorium, plastik penutup, peralatan gelas, penyaring,

air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan autoklaf. Hampir
semua mikroba mati bial terkena uap yang sangat panas dari autoklaf
selama 10-15 menit/ semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu
121C dan tekanan 15 Psi selama 15-20 menit (Torres, 1989).
Etil alcohol (70-90%) sangat berguna untuk mengusap
permukaan tempat pelaksanaan, membilas tangan, dan mencelupkan
peralatan dengan atau tanpa pembakaran. Alcohol mudah terbakar,
sehingga harus sangat hati-hati saat menggunakannya diatas api.
Kalsium atau Natrium hipoklorit digunakan sebagai sterilisasi
peralatan dan sebagai desinfektan bagi jaringan tanaman tanpa
melukainya (Afriastini, 2004).
Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan
untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan
adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi
ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital
(terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap
dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan
air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf
sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas
dari api.
Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan
pengaturan panas secara manual, selama masa sterilisasi dilakukan.
Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif
murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan
problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih
cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.
Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi
dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila
pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat
dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah
bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan
media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan
total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang
ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.
Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan
kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah.

Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi, serta
waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai,
temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan
dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable, panas
ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal
ini harus diatur secara manual.
Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas
dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121 o C,
tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square
inci) atau 1 atm.Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan
jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara
20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan.
Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :
1. Penguraian gula.
2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
( Lydiane Kyte & John Kleyn. 1996 : 169)
Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya
mempergunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan
ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada laboratorium
komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.
Bagian-bagian autoklaf :
1. Panci luar.
2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat
saluran uap.
3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
4. Katup pengeluaran uap.
5. Pengunci atau klem.
Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan
wadah yang mempunyai volume antara 300 500 ml. Isi wadah
tersebut sampai 80% volume, dan tutup dengan kertas, serta
kencangkan dengan karet gelang.
Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya
dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan
isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi

sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada

tekanan 15 psi. atau 1 atm.
Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan
yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada
temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu
antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume
media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil
berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi
dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan
waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter
memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan
52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest
dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai,
autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila
tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan
meluap (bubbled up).
Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan,
sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang
mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang
bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin
disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang
dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain :
GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin.
Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan
sebagai wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang
sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan
selama 4 jam pada temperatur 160o C. Setelah disterilkan dapat
langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama,
maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan
alumunium foil.
(Anonymous B, 2012)
2.4
Rumus Perhitungan Larutan Stok
Larutan stok adalah larutan berisi satu ataul e b i h
komponen media yang konsentrasinya lebih besar
d a r i k o n s e n t r a s i k o m p o n e n tersebut dalam formulasi media
akan dibuat.

Rumus perhitungan larutan stok yang dibutuhkan, dapat

menggunakan rumus :
V1 x M1 = V2 x M2
Dimana:
V1 = volume yang akan dibuat
M1 = banyaknya kebutuhan senyawa dalam media MS
V2 = volume larutan stok yang akan diambil
M2 = banyaknya senyawa dalam larutan stok
(Hemawan dan Naem, 2006)

BAB III METODOLOGI

3.1

Alat, Bahan dan Fungsi

 Alat :
1. 14 botol kultur : berfungsi sebagai tempat media kultur
2. 2 pak karet gelang : berfungsi untuk penutup atau tali
penutup plastik dan alumunium
3. Plastik tahan tanas (untuk 8 botol, dengan ukuran pxl; 12 x
13 cm) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan a)
4. Gelas ukur : untuk mengukur cairan yang di butuhkan
5. Mikro pipet : untuk mengambil larutan stok dengan ukuran
terkecil mikro meter
6. Beaker glass : untuk tempat pembuatan larutan stok
7. pH universal (indikator pH) : untuk mengukur pH larutan
8. sitter : megaduk larutan
9. microwave : untuk memasak larutan hingga larutan
mengental
10. alumanium foil (unutk 6 botol, dengan ukuran pxl; 24 x 15,
kertas di lipat/rangkap) : sebagai penutup botol kultur
(perlakuan b)
11. autoclave : sterilisasi botol kultur sebelum di masukkan ke
ruangan pengamatan
12. Timbangan analitik : untuk menimbang berat bahan yang
diperlukan
13. Oven : sterilisasi kering botol kultur

bahan :
Aquades

Makro
Mikro A
Mikro B
FeEDTA
Vitamin
CaCl2
Fungsi

Sukrosa

: 50 ml (bahan tambahan pada

larutan stok)
: 30 ml
: 3 ml
: 0,3 ml
: 3 ml
: 0,3 ml
: 3 ml
: Sebagai bahan pembuatan
larutan stok
: untuk 300 ml. Larutan media
digunakan 9 gram gula. (untuk

3.2

membuat larutan menjadi

tercampur rata)
: unutk 300 ml. Larutan media
digunakan 2,1 gram agar-agar
(untuk mengentalkan larutan)

Agar-agar

Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir)

Bilas gelas dengan menggunakan aquades

Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml

Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok :

Makro
: 30 ml
Mikro A
: 3 ml
Mikro B
: 0,3 ml
Fe EDTA
: 3 ml
Vitamin
: 0,3 ml
CaCl2

: 3 ml

Tambahkan aquades hingga volume

mencapai 300 ml

Stirer (aduk) dan ukur pH (pH indikator)

Masukkan sukrosa (gula) dan agar-agar

Sukrosa
: 9 gram
Agar-agar
: 2,1 gram

Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan

berwarna bening

Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi

Mikrowave selama 7 menit

Masukkan ke dalam botol kultur @20 ml :

8 botol dengan tutup plastik
6 botol dengan tutup alumunium

Autoclave

3.3

Analisa Perlakuan

Pertama, breaker glas di bilas dahulu dengan menggunakan

aquades, bertujuan untuk menghilangkan dan membersihkan gelas
breaker. Isi breaker glas dengan larutan aquades kurang lebih 50 ml.
Setelah itu, tambahkan unsur-unsur larutan yang sudah di stok,
yaitu : makro (30 ml), mikro A (3 ml), mikro B (0,3 ml), Fe EDTA (3
ml), Vitamin (0,3 ml) dan CaCl2 (3 ml). Setelah semua larutan selesai
ditambahkan, tambahkan lagi aquades hingga volume mencapai 300
ml. Stirer (aduk) larutan dan ukut pH larutan menggunakan indikator
pH hingga mencapai pH sekitar 5 6. Masukkan sukrosa (9 gram)
dan agar-agar (2,1 gram) yang bertujuan untuk melarutkan larutan
dan mengentalkan larutan. Stirer kembali sampai larutan berwarna
putih bening. Setelah selesai, tutup breaker glas dengan plastik wrap
dan masukkan ke dalam microwave selama 7 menit setelah selesai,
masukkan larutan ke dalam botol kultur dengan 8 botol di tutup
plastik, dan 6 botol ditutup alumunium. Masukkan ke autoclave
untuk sterilisasi akhir, dan amati selama 2 minggu, apakah terjadi
kontaminasi atau tidak.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Hasil (tabel perbandingan perlakuan)

a. Tabel media kultur dengan penutup plastik

No

Hari
Pengamatan KeHari ke-2 (17
Oktober 2012)

Botol
Ke1
2
3
4
5
6
7
8

Jenis
Kontaminan
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada

Hari ke 4 (19
Oktober 2012)

1
2
3
4
5
6
7
8

Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada

Hari ke 6 (22
Oktober 2012)

1
2
3
4
5
6
7
8

Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada

Hari ke 8 (24

Tidak ada

Keteranga
n
Tidak
terjadi
kontamina
n dengan
warna
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
Tidak
terjadi
kontamina
n dengan
warna
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
Tidak
terjadi
kontamina
n dengan
warna
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
Tidak

Oktober 2012)

2
3
4
5
6
7
8

Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada

terjadi
kontamina
n dengan
warna
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
5
Hari ke 10 *(25
1
Tidak ada
Tidak
Oktober 2012)
2
Tidak ada
terjadi
3
Tidak ada
kontamina
4
Tidak ada
n dengan
5
Tidak ada
warna
6
Tidak ada
yang
7
Tidak ada
masih
8
Tidak ada
putih dan
sudah
mengental
6
Hari ke 12 (29
1
Tidak ada
Tidak
Oktober 2012)
2
Tidak ada
terjadi
3
Tidak ada
kontamina
4
Tidak ada
n dengan
5
Tidak ada
warna
6
Tidak ada
yang
7
Tidak ada
masih
8
Tidak ada
putih dan
sudah
mengental
*Seharusnya tanggal 26 Oktober 2012, karena libur, jadi pengamatan
dimajukan 1 hari pada tanggal 25 Oktober 2012
b. Tabel media kultur dengan penutup Aluminium Foil
N
o
1

Hari Pengamatan
KeHari ke-2 (17

Botol
Ke1

Jenis
Kontaminan
Tidak ada

Keteranga
n
Tidak

Oktober 2012)

2
3
4
5
6

Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada

Hari ke 4 (19
Oktober 2012)

1
2
3
4
5
6

Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada

Hari ke 6 (22
Oktober 2012)

1
2
3
4
5
6

Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada

Hari ke 8 (24
Oktober 2012)

1
2
3
4
5
6

Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada
Tidak ada

terjadi
kontamina
n dengan
warna
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
Tidak
terjadi
kontamina
n dengan
warna
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
Tidak
terjadi
kontamina
n dengan
warna
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
Tidak
terjadi
kontamina
n dengan
warna
yang
masih
putih dan

sudah
mengental
5
Hari ke 10 *(25
1
Tidak ada
Tidak
Oktober 2012)
2
Tidak ada
terjadi
3
Tidak ada
kontamina
4
Tidak ada
n dengan
5
Tidak ada
warna
6
Tidak ada
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
6
Hari ke 12 (29
1
Tidak ada
Tidak
Oktober 2012)
2
Tidak ada
terjadi
3
Tidak ada
kontamina
4
Tidak ada
n dengan
5
Tidak ada
warna
6
Tidak ada
yang
masih
putih dan
sudah
mengental
*Seharusnya tanggal 26 Oktober 2012, karena libur, jadi pengamatan
dimajukan 1 hari pada tanggal 25 Oktober 2012
4.2

Pembahsan

Dari data hasil praktikum yang telah didapatkan, diketahui

bahwa pembuatan media kultur yang telah dilakukan dapat dikatakan
berhasil. Hal ini diketahui dari pengamatan yang telah dilaksanakan
selama 2 minggu pengamatan (dengan selang waktu 2 hari sekali),
yaitu warna dari larutan yang berada di dalam botol kultur tutup
plastik maupun tutup alumunium berwarna putih dan sudah
mengental.
Pada botol kultur dengan tutup plastik, dilakukan percobaan
sebanyak 8 botol. Pada pengamatan pertama, 8 botol tersebut tidak

menunjukkan gejala-gejala terkontaminasi. Hal ini berlanjut ke

pengamatan-pengamatan selanjutnya, dengan selang waktu 2
minggu, 8 botol kultur masih menunjukkan hasil yang baik dan tidak
terkontaminasi.
Pada botol dengan tutup alumunium pun, menunjukkan hasil
yang sama dengan botol yang di tutup dengan plastik. Pada
praktikum, di lakukan percobaan dengan 6 botol yang di tutup
dengan menggunakan alumunium. Selang jangka waktu 2 minggu
setelah praktikum, botol kultur tersebut tidak terkontaminasi, dengan
ciri-ciri larutan tetap berwarna putih dan sudah mengental.

BAB V PENUTUP

5.1

Kesimpulan

Jenis-jenis media pada kulur jaringan ada bebebrapa macam,

antara lain : Media Knop (wortel), Media Knudson dan
media Vacin and Went (anggrek), Media White (bunga
matahari), Media Murashige & Skoog (media MS), Media
Gamborg B5, Media Schenk & Hildebrant (media SH),
Media WPM (Woody Plant Medium)
Dalam media MS (Murashige dan Skogg), terddiri dari
beberapa macam unsur yang terkandung di dalamnya, antara
lain, makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan zat besi.
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua
organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda.
Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan
apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila
dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-121 0C.
Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:
Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar
gelombang pendek yang dapat dilakukan selama
senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah
atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi).
Dengan udara panas, dipergunakan alat bejana/ruang
panas (oven dengan temperatur 170o 180oC dan waktu
yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk
peralatan gelas).

Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan

disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).
Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa
bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi
akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan
saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan
lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel
yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba).

Rumus perhitungan larutan stok yang dibutuhkan, dapat

menggunakan rumus : V1 x M1 = V2 x M2

5.2

Dari data hasil praktikum yang telah didapatkan, diketahui

bahwa pembuatan media kultur yang telah dilakukan dapat
dikatakan berhasil. Hal ini diketahui dari pengamatan yang
telah dilaksanakan selama 2 minggu pengamatan (dengan
selang waktu 2 hari sekali), yaitu warna dari larutan yang
berada di dalam botol kultur tutup plastik maupun tutup
alumunium berwarna putih dan sudah mengental.
Saran
Asisten
Praktikum

: tolong kalau menerangkan materi, lebih

pelan saja, selain itu, no koment
: bahan laporan tolong lebih di persingkat.

DAFTAR PUSTAKA

Suryowinoto, M. 1991. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya.

Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta

Sriyanti, Daisy P. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius.

Yogyakarta.

Anonymous

a,

2012.

Teknik

Sterilisasi

http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV
%20STERILISASI/IV2%20Sterilisasi
%20Alat.html.
Diakses Tanggal 16 Oktober 2012

Torres, K.C. 1989. Tissue Culture techniques for

Horticultural Crops. Von Hostrand Reinheld. New York.

Afriastini, F. 2004. Perbanyakan Vegetatif : Kultur Jaringan.

http://www.wikipedia.id.org/ teknik/veg. Diakses 15

Desember 2007

Kyte, Lydiane & John Kleyn. 1996. Plants from Test Tubes.
USA: Timber Press

Anonymous
b,
2012.
Teknik
http://www.iptek.net.id/ind/?ch=isti&id=211.
Tanggal 16 Oktober 2012

Herawan, T dan M. Naiem. 2006. Pengaruh Jenis Media

dan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran
pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album Linn.).
Jurnal Agrosains 19(2) : 103-109.

LAMPIRAN

Sterilisasi.
Diakses

Dokumentasi hari ke-2 (17 Oktober 2012)

Plastik
Alumunium

Tidak terjadi kontaminasi

Tidak terjadi kontaminasi

Dokumentasi hari ke-4 (19 Oktober 2012)

Plastik

Alumunium

Tidak terjadi kontaminasi

Tidak terjadi kontaminasi

Dokumentasi hari ke-6 (22 Oktober 2012)

Plastik

Alumunium

Tidak terjadi kontaminasi

Tidak terjadi kontaminasi

Dokumentasi hari ke-8 (24 Oktober 2012)

Plastik

Alumunium

Dokumentasi hari ke-10 (25 Oktober 2012)

Plastik

Alumunium

Dokumentasi hari ke-12 (29 Oktober 2012)

Plastik

Alumunium

Tidak terjadi kontaminasi

Tidak terjadi kontaminasi