LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
’’P reparasi Media Kultur Jaringan’’

Disusun Oleh:

Nama : Nurjaya
Nim : D1B1 17 186
Kelas : AGT-B
Kelompok : 5 (V Sheet 2)

LABORATORIUM AGROTEKNOLOGI

UNIT IN VITRO

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HALUOLEO

2019
 I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kultur jaringan tanaman merupakan bagian suatu teknik perbanyakan

vegetatif nonkonvensional. Perbedaan teknik ini dibandingkan dengan teknik

perbanyakan vegetatif konvensional biasanya terletak dalam situasi dan lokasi

yang berbeda. Penerapan teknik kultur jaringan tanaman mensyaratkan kondisi di

dalam ruangan (laboratorium) dan sifatnya aseptik (steril dari patogen). Bermuara

dalam kondisi yang aseptik, maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitas yang

berkaitan dengan jaringan harus dalam kondisi aseptik.

Medium adalah faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan

dan berpengaruh sangat besar terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan

serta bibit yang dihasilkannya. Media ½ MS adalah media MS yang konsentrasi

unsur hara makro dikurangi menjadi ½ dari konsentrasi yang umum dipakai.

Media ini memiliki konsentrasi garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam

bentuk NO3- dan NH4+. Media New Phalaenopsis (NP) yang diciptakan

oleh Ichihashi adalah media yang diformulasikan khusus untuk kultur in vitro.

Potassium nitrat, ammonium nitrat, kalsium nitrat dan magnesium nitrat berfungsi

sebagai sumber nitrat. Zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan adalah BAP

(6-benzyl amino purine). BAP termasuk ZPT golongan sitokinin yang berfungsi

meningkatkan pembelahan sel, proliferasi pucuk dan morfogenesis pucuk.

Hasil yang lebih baik dapat dijangkau atau diperoleh, bila ke dalam media

tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh.

Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-

komponen yang tidak jelas (komponennya) seperti jus buah-buahan dan tauge, air

kelapa, Yeast Exstracts dan Casein Hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa

memperoleh hasil yang lebih tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh,

air kelapa masih sering digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian,

sedangkan pisang masih merupakan komponen tambahan yang sangat popular

pada media anggrek.

Medium kultur jaringan merupakan salah satu faktor yang dapat

menentukan tingkat keberhasilan perbanyakan tanaman secara in vitro, dalam hal

ini adalah kultur jaringan. Berbagai formulasi atau komposisi media tanam telah

banyak ditemukan untuk mmengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan

tanaman yang dikulturkan.

Berdasarkan hal tersebut di atas, maka perlu diadakan praktikum mengenai

cara pembuatan media kultur jaringan.

1.2. Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum ini yaitu mahasiswa dapat mengetahui komponen

penyusun dengan fungsi masing-masing dalam media kultur jaringan dan

mahasiswa mengetahui serta dapat mempraktekkan cara membuat larutan stok

yang akan dipergunakan dalam membuat media kultur jaringan sesuai kompotisi

medium yang diiginkan.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

Teknik kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari

tanaman, seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta

menumbuhkannya dalam kondisi aseptik sehingga bagian-bagian tersebut dapat

memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap tanaman baik

berupa sel, jaringan ataupun organ dalam keadaan aseptik secara in vitro, yang

ditandai dengan kondisi kultur aseptik, penggunaan medium buatan yang

mengandungan nutrisi lengkap, Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) serta kondisi ruang

kultur, suhu dan pencahayaan yang terkontrol (Gunawan, 2017).

Teknik kultur jaringan semakim popular sebagai salah satu propagansi

tanaman vegetatif. Teknik ini meliputi metode propagansi aseksual dengan tujuan

utama membuat tanaman yang mempunyai sifat yang unggul. Kesuksesan dari

beberapa seleksi in vitro dan manipulasi genetik tanaman pada tingkat tinggi

bergantung pada kesuksesan regenerasi tanaman in vitro merupakan salah satu

cara perbanyakan tanaman dalam waktu yang relatif singkat untuk menghasilkan

jumlah tanaman yang seragam dalam jumlah banyak (Pramono, 2012).

Medium merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur

jaringan. Komposisi medium yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman

yang akan diperbanyak. Medium yang digunakan biasanya terdiri dari garam

mineral, vitamin dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti

agar, gula (sebagai sumber energi) dan lain-lain. ZPT (hormon) yang ditambahkan

juga bervariasi, baik jenis maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari

kultur jaringan yang dilakukan. Medium yang sudah jadi ditempatkan pada tabung
reaksi atau botol-botol kaca. Medium yang digunakan juga harus disterilkan

dengan cara memanaskannya menggunakan autoklaf (Yuniastuti, 2012).

Sebelum membuat medium, maka terlebih dahulu harus menentukan

medium apa yang akan dibuat. Untuk menanam eksplan dari tanaman keras sering

menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan

tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Knudson C hanya

cocok untuk menanam eksplan kelapa Kopyor dan Anggrek (Budisantoso, 2015).

Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsur

murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam

media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulul dilarutkan dalam

konsentrasi tertentu, sehingga dalam medium tumbuh nantinya jumlah tiap gram

benar sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Yuwono, 2015).

Unsur-unsur yang dibutuhkan pada media kultur jaringan antara lain

seperti unsure mikro, unsur makro, gula, vitamin, zat pengatur tumbuh dan agar-

agar. Unsur makro nutrien terdiri dari N, P, K, S, Ca dan Mg sedangkan unsur

mikro nutrien terdiri atas Co, Mn, Fe, Cu, Zn, B dan Mo. Medium yang digunakan

adalah medium MS Murashige and Skoog (Hemawan et al, 2016).

Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memudahkan pekerjaan dalam

membuat media. Larutan stok dibuat sesuai dengan komposisi media MS yang

diaduk dalam erlenmeyer dengan konsentrasi yang lebih pekat. Setelah membuat

larutan stok gram-gram, perlu dibuat stok zat pengatur tumbuh biasanya dalam

100 ml. Stok harus disimpan di dalam lemari es (Harahap et al, 2013).
 Larutan stok dibuat karena unsur hara makro, mikro, maupun zat pengatur

tumbuhan yang diperlukan jumlahnya sangat sedikit, sehingga dapat

mempermudah dalam penimbangan bahan kimia. Selain itu sisa larutan stok dapat

disimpan dan dapat digunakan lagi apabila membuat medium yang lain (Azmin,

2015).

ZPT adalah salah satu usaha dalam memacu pertumbuhan tanaman

sehingga akan diperoleh peningkatkan hasil tanaman. Telah diketahui bahwa

auksin, karbohidrat dan nitrogen yang dikandung dalam bahan tanaman

merupakan bahan baku yang memungkinkan terbentuknya akar (Djamhari, 2010).

Dalam kultur jaringan, sitokinin berperan dalam mendorong pembelahan

sel atau jaringan yang digunakan sebagai eksplan dan merangsang perkembangan

pucuk-pucuk tunas. Dalam perbanyakan in vitro, sitokinin digunakan untuk

mengatasi dormansi apikal dan mempertinggi percabangan tunas lateral dari

ketiak daun. BAP merupakan salah satu sitokinin yang sering digunakan dalam

penelitian kultur jaringan (Kartaji dan Buchory, 2011).

Unsur-unsur kultur jaringan diberikan tidak dalam bentuk unsur murni,

tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media

tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam

konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram

benar sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai aquades (Herawan, 2017).
 III. MOTODOLOGI PRAKTIKUM

3.1. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, 16 September pada pukul

13.00 sampai 14.40 WITA. Kegiatan praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium

Agroteknologi Unit In Vitro Fakukultas Pertanian Universitas Halu Oleo.

3.1. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu timangan analitik, pipet

ukur, gelas ukur, labu takar, beaker glass, erlenmeyer, pengaduk magnetik, pipet

tetes, injektor, pH meter, hot plate, autoclave, botol kultur, plastik, karet dan

kamera.

Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu aluminium foil, kertas

label, Larutan Stok Mikronutrient (MnSO4.4H2 O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI,

Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2 O, CoCl2.6H2 O), Larutan Stok Makronutrient

(NH4 NO3, KNO3, CaCl2.2H2 O, MgSO4.H2 O, KH2.PO4), Larutan stok Iron

(Na2.EDTA, FeSO4.7H2O), Vitamin (Glycine, Nicotinic acid, Pyridoxine-HCI,

Thaimine-HCI).

3.2. Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada praktikum ini yaitu sebagai berikut :

1. Cara membuat larutan Stok Makronutrien 200 ml (20 kali konsentrasi).

a. Menimbang bahan-bahan kimia dengan timbangan analitik.

NH4NO3 33 gram
 KNO3 38 gram

CaCl2.2H2O 8,8 gram

MgSO4. H2O 7,4 gram

KH2.PO4 3,4 gram

b. Melarutkan bahan-bahan tersebut satu persatu ke dalam erlenmeyer 250 ml

yang telah diisi dengan 150 ml akuadest.

c. Mengojog erlenmeyer setiap kali penambahan bahan kimia, sampai larut.

d. Setelah semua bahan kimia masuk dan terlarut, tambahkan akuadest sampai

volume larutan menjadi 200 ml.

e. Membuat kiter medium MS diperlukan 10 ml larutan stok makro.

f. Beri label MS MAKRO, 20 X, 10 ml/l

g. Disimpan dalam lemari es.

2. Cara membuat larutan Stok Iron (besi) 200 ml (40 kali konsentrasi).

a. Menimbang 1492 mg Na2EDTA dan 1112 mg Fe2 SO4 .7H2 O.

b. Melarutkan masing-masing bahan tersebut diatas pada Erlenmeyer 200 ml

yang terpisah, yang masing-masing berisi 75 ml.

c. Untuk bahan-bahan yang sukar larut, tambahkan beberapa tetes HCI, lalu

panaskan.

d. Setelah larut, mencampur kedua macam larutan bahan tersebut kedalam satu

erlenmeyer.

e. Biarkan dingin pada suhu kamar.

f. Menambahkan akuades sampai volume menjadi 200 ml. Menutup rapat, lalu

beri label IRON, MS 40 x, 5 ml/l.

3. Cara membuat larutan Stok Mikronutrient 500 ml (100 kali konsentrasi).

a. Menimbang bahan-bahan kimia dengan timbangan analitik.

MnSO4. 4H2O 223

ZnSO4. 4H2O 86

H3BO3 62

KI 8,3

Na2MoO4. 2H2O 2,5

CuCl2. 5H2O 0,25

CoCl2. 6H2O 0,25

b. Melarutkan bahan-bahan tersebut satu persatu ke dalam erlenmeyer 250 ml

yang telah diisi dengan 150 ml akuadest.

c. Mengojog erlenmeyer setiap kali penambahan bahan kimia, sampai larut.

d. Setelah semua bahan kimia masuk dan terlarut, tambahkan akuadest sampai

volume larutan menjadi 200 ml.

e. Membuat kiter medium MS diperlukan 10 ml larutan stok makro.

f. Beri label MS MIKRO, 40 X,5 ml/l.

4. Cara membuat larutan stok vitamin 200 ml (50 kali konsentrasi)

a. Menimbang bahan-bahan kimia dengan timbangan analitik

Glycine 5 gram

Nicotinic acid 12,5 gram

Pyridoxine-HCl 12,5 gram

Thanim-HCl 2,500 gram

b. Memasukkan bahan-bahan 2.a. satu per satu ke dalam erlenmeyer 200 ml,

yang telah berisi aquades steril 150 ml. Setiap kali memasukkan bahan,

dilarutkn dengan menggunakan pengaduk, baru kemudian memasukkan

bahan berikutnya.

c. Setelah semua bahan dimasukan, kemudian menambahkan aquades sampai

volume seluruhnya 200 ml.

d. Menutup rapat erlenmeyer yang berisi larutan stok.

e. Memberi label VITAMIN, MS 50 X, 4 ml

f. Disimpan dalam lemari es.

 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Hasil dari praktikum ini yaitu dapat dilihat dari tabel berikut: Hasil

pengamatan pada praktikum preparasi media kultur jaringan adalah dapat dilihat

pada table berikut:

Tabel 1.Hasil Pembuatan Stok Makro, EDTA, Mikro, Vitamin dan 2,4D

No Gambar Larutan Stok Nama Larutan dan Label

1. Stok Mikro
IRON, MS 40 X, 5 ml/l.

2. Stok Makro
MS MAKRO, 20 X, 10 ml/lt.

3. Stok Vitamin
VITAMIN, MS 50 X, 4 ml/l
 4. Stok EDTA
IRON, MS 40 X, 5 ml/l.

4.2. Pembahasan

Teknik kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman

dalam waktu yang relatif singkat untuk menghasilkan jumlah tanaman yang

seragam dalam jumlah banyak. Metode kultur jaringan juga dapat digunakan

untuk konservasi plasma nutfah atau biji secara in vitro.

Medium merupakan suatu bahan yang penting untuk pertumbuhan kultur.

Medium untuk pertumbuhan kultur dapat berupa media padat dan media cair.

Media padat biasanya digunakan untuk mengkulturkan kalus kemudian diinduksi

menjadi tanaman lengkap, sedangkan media cair biasanya digunakan untuk kultur

sel. Komponen yang penting dalam suatu media adalah senyawa anorganik,

sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan suplemen organik

Sebelum membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan

stok. Larutan stok dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-

bahan kimia khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering

menimbang karena hal ini kurang praktis. Larutan stok disimpan di dalam lemari

pendingin agar tidak mudah rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan

kimia oleh mikroba penyebab kontaminasi. Pembuatan larutan stok harus

dilakukan dengan cermat, sebab larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami
pengendapan di lemari es dan larutan stok yang terkontaminasi tidak boleh

digunakan lagi

Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsur

murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam

media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam

konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram

benar sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai aquades

Untuk memenuhi faktor pertumbuhan tanaman, media kultur jaringan yang

baik mengandung hara anorganik, hara ini terdapat 12 hara mineral yang penting

untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi

pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan. Normal dalam kultur jaringan, unsur –

unsur penting ini harus dimasukkan dalam media kultur.

Hara organik Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat

autotrof dan dapat mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun

tanaman in vitro dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak

menghasilkan vitamin dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat

dan satu atau lebih vitamin mesti ditambahkan ke media. Thiamin merupakan

vitamin yang penting, selain itu asam nikotin, piridoksin dan inositol biasanya

ditambahkan. Selain bahan organik tersebut, bahan kompleks seringkali

ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein hydrolysate, air kelapa, jus jeruk,

jaringan pisang, dan lain-lain. Penambahan bahan kompleks ini menghasilkan

media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian yang cukup, semestinya bahan
kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu, mungkin tambahan suatu vitamin

atau asam amino.

Medium adalah faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan

dan berpengaruh sangat besar terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan

serta bibit yang dihasilkannya. Media ½ MS adalah media MS yang konsentrasi

unsur hara makro dikurangi menjadi ½ dari konsentrasi yang umum dipakai.

Media ini memiliki konsentrasi garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam

bentuk NO3- dan NH4+. Media New Phalaenopsis (NP) yang diciptakan

oleh Ichihashi adalah media yang diformulasikan khusus untuk kultur in vitro.

Potassium nitrat, ammonium nitrat, kalsium nitrat dan magnesium nitrat berfungsi

sebagai sumber nitrat. Zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan adalah BAP

(6-benzyl amino purine). BAP termasuk ZPT golongan sitokinin yang berfungsi

meningkatkan pembelahan sel, proliferasi pucuk dan morfogenesis pucuk.

Sumber karbon tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof

dan karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa

harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energi bagi

pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi

molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh. Biasanya sukrosa pada

konsentrasi 1–5% digunakan sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain

seperti glukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga digunakan. Ketika sukrosa

diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat

digunakan lebih efisien oleh tanaman dalam kultur. Mahal harganya tapi lebih

murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan.

 Air Distilatnya biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab

menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan

ekonomi, menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol

kandungan bahan organik dan non-organik pada media.

Pemilihan media Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan

media MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi

garam dan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses

digunakan pada berbagai tanaman dikotil. Untuk inisiasi kalus, 2.4-D

ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1–5 mgL-1. Untuk multiplikasi tunas,

sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin, seperti NAA pada

konsentrasi yang rendah. Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi 1–2 mgL-1

ditambahkan.

Komponen media kultur yang lengkap adalah sebagai berikut yaitu air

destilasi (aquades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solvent, hara-hara

makro dan ikro, gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi, vitamin, asam

amino dan bahan organik lain, zat pengatur tumbuh, suplemen berupa bahan-

bahan alami dan agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media.

 DAFTAR PUSTAKA

Azmin, N. 2015. Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur Dan Sterilisasi Alat
Kultur Jaringan Tumbuhan. Jurnal Pendidikan Biologi, 4(1):38-44.
Budisantoso, I. 2015. Pembuatan Medium Kultur Jaringan. Purwokerto.
Universitas Jendral Soedirman.
Djamhari, S. 2010. Memecah Dormansi Rimpang Temulawak (Curcuma
xanthorrhiza Roxb) Menggunakan Larutan Atonik dan Stimulasi
Perakaran dengan Aplikasi Auksin. Jurnal Sains dan Teknologi Indonesia,
12(1):66-70.
Gunawan, L.W. 2017. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. IPB. Bogor. Pusat
Antar Universitas.
Harahap, E. R., Siregar, L. A. M., dan Bayu, E. S. 2013. Pertumbuhan Akar Pada
Perkecambahan Beberapa Varietas Tomat Dengan Pemberian
Polyethylene Glikol (PEG) Secara In Vitro. Jurnal Online
Agroekoteknologi, 1(3): 418-428.
Hermawan, T dan Na’iem 2017. Pengaruh Jenis Media dan Konsentrasi Zat
Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur Jaringan Cendana
(Santalum album Linn.). Jurnal Agrosain, 19 (2) :103-109.
Karjadi, A.K. dan Buchory A. 2011. Pengaruh Auksin dan Sitokinin terhadap
Pertumbuhan dan Perkembangan Jaringan Meristem Kentang Kultivar
Granola. Jurnal. Hortikultura. 18(4) : 380-384.
Pramono. 2012. Pesona Sansevieria. Jakarta. Agromedia Pustaka.
Tuhuteru, S., Hehanussa, M. L. dan Raharjo, S. H. T. 2010. Pertumbuhan dan
Perkembangan Anggrek Dendrobium anosmum pada Media Kultur In-
Vitro dengan Beberapa Konsentrasi Air Kelapa. Jurnal Agrologia, 1(1):1-
12.
Yuwono, T. 2015. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta. UGM Press. Yogyakarta