LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Preparasi Media Kultur Jaringan

OLEH

NAMA : MUH. MASYUDDIN AL-AMIN

NIM : D1B1 15 043

KELAS : AGT C

KELOMPOK : III (tiga)

JURUSAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2017
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kultur jaringan tanaman adalah suatu teknik isolasi bagian-bagian tanaman,

seperti jaringan, organ, ataupun embrio, lalu dikultur pada medium buatan yang steril

sehingga bagian-bagian tanaman tersebut mampu beregenerasi dan berdiferensisi

menjadi tanaman lengkap.

Keberhasilan budidaya jaringan tanaman sangat dipengaruhi oleh media

tanamnya. Selain sebagai tempat tumbuh, media tanam merupakan penyedia unsur

hara dan zat-zat lain yang diperlukan eksplan untuk tumbuh. Seperti halnya dengan

tanaman utuh, jaringan tanaman juga memerlukan unsur hara makro dan unsur hara

mikro. Karena yang ditanam adalah sepotong kecil jaringan atau sekelompok sel,

media tanam haruslah dapat menyediakan bahan-bahan lain yang dapat mendukung

pertumbuhan dan perkembangan jaringan tanaman sehingga tanaman dapat

melakukan regenerasi.

Hasil yang lebih baik dapat dijangkau atau diperoleh, bila ke dalam media

tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh.

Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-

komponen yang tidak jelas (komponennya) seperti juice buah-buahan dan tauge, air

kelapa, yeast exstracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa

memperoleh hasil yang lebih tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air

kelapa masih sering digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan

pisang masih merupakan komponen tambahan yang sangat popular pada media

anggrek.

Media kultur jaringan merupakan salah satu faktor yang dapat menentukan

tingkat keberhasilan perbanyakan tanaman secara invitro, dalam hal ini adalah kultur

jaringan. Berbagai formulasi atau komposisi media tanam telah banyak ditemukan

untuk mmengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan.

Berdasarkan hal tersebut di atas, maka perlu diadakan praktikum mengenai

cara pembuatan media kultur jaringan..

B. Tujuan dan kegunaan

Mahasiswa dapat mengetahui komponen penyusun dengan fungsinya masing-

masing dalam media kultur jaringan dan mahasiswa mengetahui serta dapat

mempraktekan cara membuat larutan stok yang akan dipergunakan dalam membuat

media kultur jaringan sesuai komposisi medium yang diinginkan.

Kegunaanya mahasiswa mampu mengetahui komponen penyusun dengan

fungsinya masing-masing dalam media kultur jaringan dan mahasiswa

mengetahuiserta dapat mempraktekan cara membuat larutan stok yang akan

dipergunakan dalam membuat media kultur jaringan sesuai komposisi medium yang

diinginkan.
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Teknik kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari

tanaman, seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan, dan organ, serta

menumbuhkannya dalam kondisi aseptik sehingga bagian-bagian tersebut dapat

memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap tanaman baik berupa

sel, jaringan ataupun organ dalam keadaan aseptik secara in vitro, yang ditandai

dengan kondisi kultur aseptik, penggunaan media buatan yang mengandungan nutrisi

lengkap, Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) serta kondisi ruang kultur, suhu dan

pencahayaan yang terkontrol (Gunawan, 2007).

Teknik kultur jaringan semakim popular sebagai salah satu propagansi

tanaman vegetatif. Teknik ini meliputi metode propagansi aseksual dengan tujuan

utama membuat tanaman yang mempunyai sifat yang uggul. Kesuksesan dari

beberapa seleksi in vitro dan manipulasi genetik tanaman pada tingkat tinggi

bergantung pada kesuksesan regenerasi tanaman, in vitro. merupakan salah satu cara

perbanyakan tanaman dalam waktu yang relatif singkat untuk menghasilkan jumlah

tanaman yang seragam dalam jumlah banyak. (Pramono, 2008)

Media merupakan factor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.

Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur

jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur

jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap partumbuhan dan perkembangan

eksplan serta bibit yang dihasilkannya (Tuhuteru et al, 2010).

 Sebelum membuat medium, maka terlebih dahulu harus menentukan medium

apa yang akan dibuat. Untuk menanam eksplan dari tanaman keras sering

menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan

tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Knudson C hanya cocok

untuk menanam eksplan kelapa Kopyor dan Anggrek (Budisantoso, 2015).

Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsur murni,

tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media

tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulul dilarutkan dalam

konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar

sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Yuwono, 2008).

Unsur-unsur yang dibutuhkan pada media kultur jaringan antara lain seperti

unsure mikro, unsur makro, gula, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan agar-agar. Unsu

rmakronutrien terdiri dari N, P, K, S, Ca, dan Mg sedangkan unsur mikronutrieterdiri

atas Co, Mn, Fe, Cu, Zn, B dan Mo. Media yang digunakan adalah media MS

Murashige and Skoog (Hemawan et al, 2006).

Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memudahkan pekerjaan dalam

membuat media. Larutan stok dibuat sesuai dengan komposisi media MS yang

diaduk dalam erlenmeyer dengan konsentrasi yang lebih pekat. Setelah membuat

larutan stok gram-gram, perlu dibuat stok zat pengatur tumbuh biasanya dalam 100

ml. Stok harus disimpan di dalam lemari es (Harahap et al, 2013).

 Larutan stok dibuat karena unsur hara makro, mikro, maupun zat pengatur

tumbuhan yang diperlukan jumlahnya sangat sedikit, sehingga dapat mempermudah

dalam penimbangan bahan kimia. Selain itu sisa larutan stok dapat disimpan dan

dapat digunakan lagi apabila membuat medium yang lain (Azmin, 2015).

ZPT adalah salah satu usaha dalam memacu pertumbuhan tanaman sehingga

akan diperoleh peningkatkan hasil tanaman. Telah diketahui bahwa auksin,

karbohidrat dan nitrogen yang dikandung dalam bahan tanaman merupakan bahan

baku yang memungkinkan terbentuknya akar (Djamhari, 2010).

Dalam kultur jaringan, sitokinin berperan dalam mendorong pembelahan sel

atau jaringan yang digunakan sebagai eksplan dan merangsang perkembangan pucuk-

pucuk tunas. Dalam perbanyakan in vitro, sitokinin digunakan untuk mengatasi

dormansi apikal dan mempertinggi percabangan tunas lateral dari ketiak daun. BAP

merupakan salah satu sitokinin yang sering digunakan dalam penelitian kultur

jaringan (Kartaji dan Buchory, 2008).

 III. METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 19 Oktober 2017

pukul 01.00 WITA selesai, bertempat di Laboratorium Agroteknologi Unit In Vitro
Fakultas Pertanian Universitas Halu Oleo.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu, gelas ukur, pipet,

pengaduk, hot plate, timbangan analitik, erlenmeyer 200 cc, 500 cc dan 1000 cc,

pengaduk magnetik, injector, autoclave, dan spatula.

Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu aluminium foil, kertas label

Larutan Stok Mikronutrient (MnSO4.4H2 O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI,

Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2 O, CoCl2.6H2 O), Larutan Stok Makronutrient

(NH4 NO3, KNO3, CaCl2.2H2 O, MgSO4.H2 O, KH2.PO4), Larutan stok Iron

(Na2.EDTA, FeSO4.7H2O), Vitamin (Glycine, Nicotinic acid, Pyridoxine-HCI,

Thaimine-HCI).

C. Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada praktikum ini yaitu sebagai berikut :

1. Cara membuat larutan Stok Makronutrien 200 ml (20 kali konsentrasi).

- Menimbang bahan-bahan kimia dengan timbangan analitik.

- Melarutkan bahan-bahan tersebut satu persatu ke dalam erlenmeyer 250 ml

yang telah diisi dengan 150 ml akuadest.

- Mengojog erlenmeyer setiap kali penambahan bahan kimia, sampai larut.

- Setelah semua bahan kimia masuk dan terlarut, tambahkan akuadest sampai

volume larutan menjadi 200 ml.

- Membuat kiter medium MS diperlukan 10 ml larutan stok makro.

- Beri label MS MAKRO, 20 X, 10 ml/l.

2. Cara membuat larutan Stok Iron (besi) 200 ml (40 kali konsentrasi).

- Menimbang 1492 mg Na2EDTA dan 1112 mg Fe2 SO4 .7H2 O.

- Melarutkan masing-masing bahan tersebut diatas pada Erlenmeyer 200 ml yang

terpisah, yang masing-masing berisi 75 ml.

- Untuk bahan-bahan yang sukar larut, tambahkan beberapa tetes HCI, lalu

panaskan.

- Setelah larut, mencampur kedua macam larutan bahan tersebut kedalam satu

erlenmeyer.

- Biarkan dingin pada suhu kamar.

- Menambahkan akuades sampai volume menjadi 200 ml. Menutup rapat, lalu beri

label IRON, MS 40 x, 5 ml/l.

3. Cara membuat larutan Stok Mikronutrient 500 ml (100 kali konsentrasi).

- Menimbang bahan-bahan kimia dengan timbangan analitik.

- Melarutkan bahan-bahan tersebut satu persatu ke dalam erlenmeyer 250 ml

yang telah diisi dengan 150 ml akuadest.

- Mengojog erlenmeyer setiap kali penambahan bahan kimia, sampai larut.

- Setelah semua bahan kimia masuk dan terlarut, tambahkan akuadest sampai

volume larutan menjadi 200 ml.

- Membuat kiter medium MS diperlukan 10 ml larutan stok makro.

- Beri label MS MIKRO, 40 X,5 ml/l.

 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Hasil dari praktikum ini yaitu berupa gambar dibawah ini.

LARUTA

Gambar 1. Larutan Gambar 2. Larutan Gambar 3. Larutan

Stok Makronutrient Stok Iron (besi) Stok Mikronutrient

Gambar
G 4. Larutan
Gambar 5. Larutan Stok Auksin (NAA, dan
Stok Vitamin
2, 4D) serta Larutan Stok Sitokinin (BAP)
 Gambar 6. Bahan-bahan kimia (komponen komponen larutan stok)

B. Pembahasan

Teknik kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman dalam

waktu yang relatif singkat untuk menghasilkan jumlah tanaman yang seragam dalam

jumlah banyak. Metode kultur jaringan juga dapat digunakan untuk konservasi

plasma nutfah atau biji secara in vitro

Media merupakan suatu bahan yang penting untuk pertumbuhan kultur. Media

untuk pertumbuhan kultur dapat berupa media padat dan media cair. Media padat

biasanya digunakan untuk mengkulturkan kalus kemudian diinduksi menjadi tanaman

lengkap, sedangkan media cair biasanya digunakan untuk kultur sel. Komponen yang

penting dalam suatu media adalah senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat

pengatur tumbuh, dan suplemen organik

Sebelum membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stok.

Larutan stok dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-bahan

kimia khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering menimbang
karena hal ini kurang praktis. Larutan stok disimpan di dalam lemari pendingin agar

tidak mudah rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan kimia oleh mikroba

penyebab kontaminasi. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab

larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di lemari es, dan larutan

stok yang terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi

Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsur murni,

tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media

tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam konsentrasi

tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar sesuai

dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades

Untuk memenuhi faktor pertumbuhan tanaman, media kultur jaringan yang

baik mengandung Hara anorganik, hara ini terdapat 12 hara mineral yang penting

untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi

pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan. Normal dalam kultur jaringan, unsur

unsur penting ini harus dimasukkan dalam media kultur.

Hara organik Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof

dan dapat mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman in

vitro dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak menghasilkan vitamin

dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat dan satu atau lebih vitamin

mesti ditambahkan ke media. Thiamin merupakan vitamin yang penting, selain itu

asam nikotin, piridoksin dan inositol biasanya ditambahkan. Selain bahan organik
tersebut, bahan kompleks seringkali ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein

hydrolysate, air kelapa, jus jeruk, jaringan pisang, dan lain lain. Penambahan bahan

kompleks ini menghasilkan media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian yang

cukup, semestinya bahan kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu, mungkin

tambahan suatu vitamin atau asam amino.

Sumber karbon tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan

karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus

ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energi bagi

pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi

molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh. Biasanya sukrosa pada

konsentrasi 1 5% digunakan sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain seperti

glukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga digunakan. Ketika sukrosa diautoklaf,

terjadi hidrolisis untuk menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan

lebih efisien oleh tanaman dalam kultur. Mahal harganya tapi lebih murni, tidak

mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan.

Air Distilatnya biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab

menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi,

menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan bahan

organik dan non-organik pada media.

Pemilihan media Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media

MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan
nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada

berbagai tanaman dikotil. Untuk inisiasi kalus, 2.4-D ditambahkan ke media dengan

konsentrasi 1 5 mgL-1. Untuk multiplikasi tunas, sitokinin seperti BAP

ditambahkan dan juga diberi auksin, seperti NAA pada konsentrasi yang

rendah.Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi 1 2 mgL-1 ditambahkan.

Komponen media kultur yang lengkap adalah sebagai berikut :

1. Air destilasi (aquades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solvent

2. Hara-hara makro dan ikro

3. Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi

4. Vitamin, asam amino dan bahan organic lain

5. Zat pengatur tumbuh

6. Suplemen berupa bahan-bahan alami

7. Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media

 DAFTAR PUSTAKA

Azmin, N. 2015. Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur Dan Sterilisasi Alat Kultur
Jaringan Tumbuhan. Jurnal Pendidikan Biologi, Vol. 4(1):38-44.
Budisantoso, I. 2015. Pembuatan Medium Kultur Jaringan. Universitas Jendral
Soedirman. Purwokerto.
Djamhari, S. 2010. Memecah Dormansi Rimpang Temulawak (Curcuma
xanthorrhiza Roxb) Menggunakan Larutan Atonik dan Stimulasi Perakaran
dengan Aplikasi Auksin. Jurnal Sains dan Teknologi Indonesia, Vol.12(1):66-
70.
Gunawan, L.W. 2007. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Pusat Antar Universitas
(PAU), Bioteknologi, IPB. Bogor.
Harahap, E. R., Siregar, L. A. M., dan Bayu, E. S. 2013. Pertumbuhan Akar Pada
Perkecambahan Beberapa Varietas Tomat Dengan Pemberian Polyethylene
Glikol (PEG) Secara In Vitro. Jurnal Online Agroekoteknologi, Vol.1(3):418-
428.
Hermawan, T dan Naiem 2006. Pengaruh Jenis Media dan Konsentrasi Zat Pengatur
Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album
Linn.). Jurnal Agrosain,. Vol. 19(2):103-109.
Karjadi, A.K. dan Buchory A. 2008. Pengaruh Auksin dan Sitokinin terhadap
Pertumbuhan dan Perkembangan Jaringan Meristem Kentang Kultivar
Granola. J. Hort. Vol.18(4):380-384.
Pramono. 2008. Pesona Sansevieria. Agromedia Pustaka. Jakarta
Tuhuteru, S., Hehanussa, M. L. dan Raharjo, S. H. T. 2010. Pertumbuhan dan
Perkembangan Anggrek Dendrobium anosmum pada Media Kultur In-Vitro
dengan Beberapa Konsentrasi Air Kelapa. Jurnal Agrologia, vol 1(1):1-12.
Yuwono, T. 2008. Bioteknologi Pertanian. UGM Press. Yogyakarta.