PEMBUATAN MEDIUM TANAM DAN STERILISASI MEDIUM

(Laporan Praktikum Kultur Jaringan)

Oleh

Wevi Yulinda Saraswati

1617021062

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
2019
 LEMBAR PENGESAHAN

Judul Percobaan : Pembuatan Medium Tanam dan Sterilisasi Medium

Tanggal Percobaan : 13 Maret 2019
Tempat Percobaan : Laboratorium Kultur Jaringan
Nama : Wevi Yulinda Saraswati
NPM : 1617021062
Jurusan : Biologi
Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Kelompok : 5 ( Lima )

Bandar Lampung, 22 Maret 2019

Mengetahui,
Asisten,

Harum Mutmainnah
NPM : 1517021059
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Formulasi media kultur jaringan pertama kali dibuat berdasarkan komposisi

larutan yang digunakan untuk hidroponik, khususnya komposisi unsur-unsur
makronya.. Komposisis media dan perkembangan formulasinya didasarkan
pada jenis jaringan, organ dan tanaman yang digunakan serta pendekatan dari
masing-masing peneliti. Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur
jaringan, sangat bergantung pada media yang digunakan. Media kultur jaringan
tanaman menyediakan tidak hanya unsur hara makro dan mikro, tetapi  sumber
karbohidrat yang pada umumnya berupa gula menggantikan karbon yang
biasanya dihasilkan dari atmosfer melalui melalui proses fotosintesis.

Media kultur jaringan merupakan salah satu faktor yang dapat menentukan
tingkat keberhasilan paebanyakan tanaman secara invitro, dalam hal ini adalah
kultur jaringan. Berbagai formulasi atau komposisi media tanam telah banyak
ditemukan untuk mmengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman
yang dikulturkan.

Peranan media kultur berhubungan dengan penyediaan unsure hara dan energi
serta zat-zat lain yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan perkembangan
bahan eksplan di dalam botol kultur sehingga sangat berpengaruh terhadap
keberhasilan kultur jaringan Melihat peranan penting dari media kultur, maka
melaui praktikum ini dilakukan pembuatan media kultur secara baik dan benar
sesuai dengan prosedur yang ada. Untuk itu dalam praktikum ini kita akan
mempelajari cara membuat medium tanam dan sterilisasinya.
B. Tujuan
Adapun tujan dari praktikum ini adalah :
1. Untuk memahami tatacara dan dapat melakukan sterilisasi peralatan gelas,
logam dan media kultur.
2. Untuk memahami tatacara dan dapat melakukan pembuatan larutan
medium tanam dengan terampil dari medium dasar MS.
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Media yang terlalu padat dapat mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar-
akar sulit untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu
lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa
tenggelamnya eksplan yang ditanam, terutama eksplan yang berat seperti eksplan
wartel, melinjo, eksplan bawang putih, eksplan kedelai, dan lain sebagainya.
Pemakaian media cair lebih ditekankan pada suspensi sel, yaitu untuk
menumbuhkan plb (protocorm like bodies atau disebut juga protokormus). Dari
protokarmus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan ke
dala media padat yang sesuai (Hendaryono, 2007).

Media invitro yang biasa digunakan biasa berupa media padat sebab memiliki
beberapa keuntungan antara lain penggunaan eksplan terkecil akan lebih muda
terlihat, eksplan berada di atas permukaan media sehingga tidak perlu
memerlukan alat Bantu untuk aerasi, tunas dan akar akn lebih muda tumbuh pada
media yang diam. Namun pada media cair juga terdapat beberapa keuntungan
yang tidak dimiliki pada media padat yaitu antara lain tidak memerlukan
tambahan bahan pemadat, tepat untuk proses kultur protoplasma maupun kultur
sel, eksudat yang dikeluarkan oleh eksplan tidak terakumulasi disekitar eksplan,
kontak ekslan dengan media lebih besar (George, 2004).

Dalam prosesnya, keberhasilan kultur jaringan selain dikarenakan oleh kondisi

lingkungan yang terkendali juga ditentikan oleh media kultur. Media kultur
merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan. Media kultur merupakan
komponen faktor lingkungan yang menyediakan unsure pertumbuhan tanaman
seperti unsure hara makro, unsure hara mikro, karbohidrat, vitamin dan zat
pengatur tumbuh, param-garam organic, persenyawaan komplek alamiah, arang
aktif dan bahan pemadat (Gunawan, 2008).

Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media
perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara
esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur
jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar pada
umumnya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama
kali dalam kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting (Nugroho,
2007).

Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5.5-5.8

(Gamborg dan Shyluk, 1981). Tanaman Ericaceae seperti Rhododendron
pengaturan pH, biasa dilakukan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-
kadang KOH) atau HCl pada waktu semua komponen sudah dicampur, beberapa
saat sebelum disterilkan dengan autoklaf. Sekalipun media sudah ditetapkan,
seringkali setelah sterilisasi pH-nya berubah. Pada umumnya terdapat penurunan
pH setelah distrerilkan dalam autoklaf. Untuk mencapai pH sekitar 5.7-5.9, Nann
dkk. (dalam George dan Sherrington, 1984) membuat pH 7.0 dalam media yang
belum disterilkan. Untuk menghindarkan perubahan pH yang cukup besar.
Murashige dan Skoog menyarankan agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan
agar-agar dan memanaskan media didalam autoklaf selama beberapa menit, baru
diadakan penetapan media disterilkan dalam autoklaf. Dalam wadah yang besar,
media disterlkan dan kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl steril sampai pH yang
diinginkan. Setelah itu media dituang ke dalam wadah kultur steril yang telah
dipersiapkan di dalam laminar air flow cabinet (Marlin, 2012).
 III. METODOLOGI KERJA

A. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilakukan pada hari Rabu, 13 Maret 2019 pada pukul 09.20 WIB
di Laboratorium Kultur Jaringan , Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah botol kultur, cawan
petri, tabung reaksi, pinset, pisau, gunting, autoklaf, erlenmeyer, gelas ukur,
pipet, hot plate dan magnetic stirrer.
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah aquades, larutan
stok unsur hara makro, mikro, witamin, sukrosa dan agar.

C. Cara Kerja
Pembuatan Medium dan Sterilisasi Medium
1. Takar bahan-bahan seperti larutan stok unsur hara makro 10 ml, mikro
5 ml, vitamin 2,5 ml dan Fe 2,5 ml.
2. Masukkan semua bahan kedalam erlenmeyer, kemudian masukkan
aquades 480 ml.
3. Masukkan sukrosa 15 gr, kemudian ukur pH hingga 5,7.
4. Tambahkan agar 3,5 gr, kemudian dimasak.
5. Setelah itu medium yang sudah masak dimasukkan kedalam erlenmeyer
untuk disterilisasi dengan menggunakan autoclave selama 15 menit.
6. Setelah steril masukkan mediuk kedalam 20 botol kultur sebanyak 25
ml medium kedalam masing-masing botol kultur.
 IV. PEMBAHASAN

Berikut ini macam-macam media tanam pada kultur jaringan :

1. Media Knop
Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus,
biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang
rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti
glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dodds and Roberts).
2. Media White
Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor
bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur
tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau.
Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama
dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian.
Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari
media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang
umum digunakan sekarang.
3. Media Knudson dan media Vacin and Went
Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang
ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang
hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan
penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk
perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+
ternyata dibutuhkanmuntuk perkembangan protocorm.
4. Media Murashige & Skoog (media MS)
Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam
anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan
tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29
 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari
N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media
tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium
juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro
lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit.
5. Media Schenk & Hildebrant (media SH)
Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman
monokotil dan dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH
sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan
kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk &
Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman
dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang
dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14%
kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh
yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini
cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.
6. Media WPM (Woody Plant Medium)
Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan
media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media
diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain,
tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM.
Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias
berperawakan perdu dan pohon-pohon.
7. Media N6
Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH₄⁺ dan NO₃⁻  yang jauh
perbandinganya. Amonium  yang diberikan dalam bentuk (NH₄)SO₄
hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO₃ 2830 mg/l.

Pengertian unsur hara bagi tanaman  adalah suatu senyawa/zat anorganik yang ada
didalam tanah yang sangat dibutuhkan oleh tanaman untuk pertumbuhan dan
perkembangan tanaman. Oleh sebab itu, unsur hara sangat penting dan perlu bagi
tanaman agar tidak tumbuh abnormalitas atau pertumbuhan terhambat tidak
dengan semestianya. Berdasarkan tingkat kebutuhan tanaman, unsur hara dapat
digolongkan menjadi dua macam yaitu unsur hara makro dan unsur hara mikro.
1. Pengertian unsur hara makro adalah unsur hara yang sangat dibutuhkan
dan diperlukan oleh tanaman dalam jumlah yang relatif banyak. Ada dua
macam yang dibutuhkan unsur makro dalam relatif banyak yaitu unsur
hara makro primer seperti Kalium (K), Phospor (P) dan Nitrogen (N),
sedangkan unsur hara makro sekunder seperti kalium (Ca), Magnesium
(Mg) dan Sulfur (S).
2. Pengertian unsur hara mikro  adalah unsur hata yang dibutuhkan dan
diperlukan oleh tanaman dalam jumlah relatif kecil. Biasanya senyawa
yang dibutuhkan oleh unsur hara mikro adalah Besi (Fe), Borium (B),
Mangan (Mn), Tembaga (Cu), Seng (Zn) dan Molibdenum (Mo).

Vitamin adalah sekelompok senyawa organik berbobot molekul kecil yang

memiliki fungsi vital dalam metabolisme setiap organisme, yang tidak dapat
dihasilkan oleh tubuh. Nama ini berasal dari gabungan kata bahasa Latin vita yang
artinya "hidup" dan amina (amine) yang mengacu pada suatu gugus fungsi yang
memiliki atom nitrogen (N), karena pada awalnya vitamin dianggap demikian.
Kelak diketahui bahwa banyak vitamin yang sama sekali tidak memiliki atom N.
Dipandang dari sisi enzimologi (ilmu tentang enzim), vitamin adalah kofaktor
dalam reaksi kimia yang dikatalisasi oleh enzim. Pada dasarnya, senyawa vitamin
ini digunakan tubuh untuk dapat bertumbuh dan berkembang secara normal.

Besi (Fe) merupakan salah satu unsur hara mikro tanaman. Tanaman menyerap
besi dalam bentuk ion Fe3+, tetapi lebih banyak diserap dalam bentuk ion Fe2+.
Besi juga dapat diserap dalam bentuk garam-garam kompleks organik (chelate)
dan dapat juga diserap oleh daun dalam bentuk Fe sulfat. Fe adalah salah satu
unsur immobile. Zat besi penting dalam pembentukan hijau daun (klorofil),
pembentukan karbohidrat, lemak, protein, dan enzim. Jika dalam tanaman terjadi
kekurangan mangan (Mn) dan kalium (K) atau kelebihan sulfat (S), akan
mengakibatkan pergerakan Fero terhambat dan Fero tidak sampai ke daun
meskipun pengisapan Fe dalam tanah berlangsung terus.
Sterilisasi adalah proses atau kerja untuk membebaskan suatu bahan seperti
medium pertumbuhan mikroba atau peralatan laboratorium dari semua bentuk
kehidupan. Proses sterilisasi dapat dibedakan menurut teknik pengerjaannya, yaitu
sterilisasi dengan penyaringan, khususnya untuk bahan cair yang bersifat
termolabil, seperti ekstrak enzim, serum, toksin bakteri, dan medium
pertumbuhan, sterilisasi dengan pemanasan melalui teknik pemijaran, udara
panas, uap air panas maupun uap air panas bertekanan, sterilisasi dengan senyawa
kimia, seperti etilen oksida, maupun beta propiolacton dan sterilisasi melalui
medium UV.

Untuk sterilisasi dengan menggunakan pemanasan, biasanya yang digunakan

adalah pemanasan kering yaitu menggunakan oven sebagai alat sterilisasinya,
dimana dengan menggunakansuatu siklus oven modern yang dilengkapi udara
yang dipanaskan dan disaring. Rentang suhu khas yang dapat diterima di dalam
bejana sterilisasi kosong adalah lebih kurang 15oC , jika alat sterilisasi beroperasi
pada suhu tidak kurang dari 25oC. selain menggunakan oven, pemanasan kering
juga bisa menggunakan alat yang disebut bunsen dan spiritus, dimana alat ini
biasanya untuk mensterilisasi jarum ose yang akan digunakan pada proses
inokulasi mikroba. Sedangkan pada pemanasan basah yaitu menggunakan alat
yang disebut autoclave, dimana alat ataupun bahan yang akan disterilisasi akan
dipanaskan dengan suhu 121oC, dengan tekanan 1-2 atm, selama 45 menit.

Ketika ingin menggunakan autoclave, harus diisi dengan air sampai batas rang
atau dasar yang berlubang-lubang tempat meletakkan alat. Alat-alat yang ingin
disterilkan harus terlebih dahulu dibungkus dengan alumunium foil dan bagian
mulutnya ditutup dengan kapas. Hal ini dilakukn untuk menghindari terbentuknya
uap air didinding dan didalam alat-alat yang dipanaskan. Alat-alat yang ingin
dipanaskan kemudian dimasukkan kedalam autoclave, selanjutnya tutup dipasang
hingga pas. Kran pengatur tempat keluar air dibiarkan terbuka sampai uap air saja
dan semu udara terdesak keluar dengan demikian didalam bejana hanya terdapat
tekann uap air saja. Besarnya tekanan yang digunakan tergantung pada jenis
bahan atau alat yang disterilisasi.

Berdasarkan literatur suhu yang digunakan pada oven pada saat sterilisasi sesuai
dengan literatur yang menyatakan “ Pemanasan kering sering dilakukan dalam
sterilisasi alat-alat gelas di laboratorium, dimana menggunakan oven dengan suhu
160-180oC selama 1,5-2 jam dengan sistem udara statis. Suhu yang digunakan
pada autoklaf 121oC hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan “Pemanasan
basah adalah sterilisasi panas yang digunakan bersama-sama dengan uap air.
Pemanasan basah biasanya dilakukan didalam autoklaf atau aterilisator uap yang
mudah diangkat dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121 oC
selama 15 menit.

Pembuatan media tanam dalam 1 liter dibuat dengan mencampurkan larutan stok
yang dibutuhkan dengan konsentrasi tertentu. Langkah pertama masukkan larutan
stok unsur hara makro 20 ml, mikro 10 ml, vitamin 5 ml dan Fe 5 ml kedalam
beaker glass. Setelah itu masukkan aquades 960 ml, sehingga volume larutan stok
dan aquades menjadi 1 liter. Kemudian masukkan sukrosa 30 gr. Larutan tersebut
diaduk dengan menggunakan batang pengaduk kemudian diukur pH sampai 5,7.
Selanjutnya tambahkan agar 7 gr sambil dimasak diatas kompor. Setelah larutan
media terlihat agak bening angkat media, kemudian masukkan kedalam
erlenmeyer untuk disterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit.
Setelah di sterilisasi media tadi langsung dimasukkan ke dalam botol kultur.
Dalam pembuatan 1 liter media dapat mengisi 40 botol kultur dengan masing-
masing botol terisi oleh 25 ml media.
 V. KESIMPULAN

Adapun kesimpulan dari praktikum ini adalah :

1. Sterilisasi alat dengan menggunakan autoklaf dibutuhkan waktu 30 menit,

sedangkan untuk media hanya 15 menit.
2. Pembuatan medium tanam 500 ml dapat digunakan untuk 20 botol kultur,
sedangkan medium tanam 1 liter dapat digunakan untuk 40 botol kultur.
3. Media yang paling sering digunakan adalah MS (Murashige dan Skoog)
karena dapat digunakan untuk kebanyakan jenis tanaman.
 DAFTAR PUSTAKA

George, E.F. & P.D. Sherrington. 2004. Plant propagation by tissue culture.
Handbook and Directory of Commercial Laboratories Exegetics Ltd.
Basingstoke. England.

Gunawan, L.W.2008. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Institut Pertanian

Bogor. Bogor.

Hendaryono. 2007. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.

Marlin, dkk. 2012. Penuntun Praktikum Kultur Jaringan. Fakultas Pertanian

Universitas Bengkulu. Bengkulu.

Nugroho.2007. Pedoman Pelaksanaan Tehnik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya.

Jakarta.