LAPORAN PRAKTIK KERJA INDUSTRI DI PT EQUILAB INTERNATIONAL CILANDAK JAKARTA

oleh Nurlatifah NIS 09.55.06533

KEMENTERIAN PERINDUSTRIAN REPUBLIK INDONESIA Pusat Pendidikan dan Pelatihan Industri Sekolah Menengah Kejuruan SMAK Bogor 2013

LAPORAN PRAKTIK KERJA INDUSTRI DI PT EQUILAB INTERNATIONAL CILANDAK JAKARTA

Sebagai Syarat untuk Mengikuti Ujian Akhir SMK Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor Tahun Ajaran 2012/2013

oleh Nurlatifah NIS. 09.55.06533

KEMENTERIAN PERINDUSTRIAN REPUBLIK INDONESIA Pusat Pendidikan dan Pelatihan Industri Sekolah Menengah Kejuruan SMAK Bogor 2013

LEMBAR PERSETUJUAN DAN PENGESAHAN

Disetujui dan disahkan oleh :

Disetujui oleh :

Yan Tirta Indra Kurniawan, S.SI NIP 2009 06 00859 Pembimbing I,

Iwan Dwi Santoso S.Si NIP 2004 09 13362 Pembimbing II,

Ir. Tin Kartini M.Si NIP 19640316 199403 2 003 Pembimbing III,

Disahkan oleh,

Dra. Hadiati Agustine NIP 19570817 198103 2 002 Kepala Sekolah Menengah Kejuruan SMAK Bogor

KATA PENGANTAR
Laporan Praktik Kerja Industri (Prakerin) di PT Equilab International ini disusun sebagai laporan atau tugas akhir hasil pengalaman prakerin selama tigasetengah bulan yang dimulai pada tanggal 11 November 2012 hingga 27 Januari 2013. Laporan ini merupakan persyaratan bagi siswa/siswi kelas XIII untuk

mengikuti Ujian Akhir di Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor Tahun Ajaran 2012/2013. Laporan ini diberi judul, Validasi Metode Analisis Senyawa Pyrazinamide dalam Plasma Darah secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang secara garis besar berisi Pendahuluan , Tinjauan Umum PT Equilab International, Kegiatan di Laboratorium, Tinjauan Pustaka, Metode Analisis, Hasil dan Pembahasan, serta Simpulan dan Saran. Adapun isi materi laporan ini lebih menekankan kepada Validase Metode. Puji syukur Penyusun panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya, Penyusun dapat menyelesaikan laporan prakerin ini tepat pada waktunya. Penyusunan laporan ini juga terwujud berkat adanya Oleh karena itu,

bimbingan, dorongan, serta bantuan dari berbagai pihak. Penyusun ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1. Dra. Hadiati Agustine selaku Kepala Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor beserta seluruh Staf Pendidik dan Kependidikan yang telah memberikan bimbingan selama menjalani pendidikan di Sekolah. 2. Yan Tirta Indra Kurniawan, S.Si selaku Manajer Teknis PT Equilab International sekaligus Pembimbing I Institusi yang telah membantu dalam hal pengarahan dan memberikan kesempatan kepada Penyusun untuk meaksanakan prakerin. 3. Bapak Iwan Dwi Santoso S.Si selaku Pembimbing II Institusi yang telah membantu dalam hal pengarahan dan memberikan kesempatan kepada Penyusun untuk melaksanakan prakerin. 4. Amilia Sari Ghani, S.Si, selaku Wakil Kepala Bidang Hubungan Kerjasama Industri yang menjadi penyambung antara Penyusun dengan PT Equilab Inernational. 5. Tin Kartini selaku Pembimbing Prakerin dari sekolah yang telah membimbing Penyusun baik dalam kegiatan prakerin maupun dalam penyusunan laporan ini.

ii

6. Ganjar Bayu Aji S.Si dan Kak Irawati Luthfy selaku Analis PT Equilab International sekaligus Pembimbing yang telah membantu memberikan pengarahan pada Penyusun selama melaksanakan prakerin. 7. Lucia Rat Handayani, S.Si; Teh Siti Halimah, Teh Euis Dewi Kurnia, Kak Amalia Sabila, Kak Laras Wirahmawati, Kak Sri Wahyuni, Ka Ismi Sakinah, Kak Gilang Aria Bintang, Mas Rahmad Dian, serta seluruh staf PT Equilab International yang tidak dapat Penyusun sebutkan satu persatu, yang telah memberikan dukungan dan masukan selama prakerin. 8. Orangtua tercinta Dr. Arwan Sugiharo dan R. Dedeh Widiarsih, serta segenap keluarga tercinta yang telah memberikan dukungan baik moril maupun materiil kepada Penyusun secara tulus tiada henti. 9. Huda Yeni Rachmalia., rekan satu perjuangan Penyusun selama Prakerin di PT Equilab International. 10. Sahabat-sahabat tercinta Ahmadi Apri Fathoni, Azaria Dian Mayangsari, Gandes Fatiya Rahmah, Khisma Arum Firdaus, Zakia Maulida, Ilva Mawasri Tartiwi, Saraswati Regina Putri, Rachmanda Febriati G., dan rekan-rekan seperjuangan di Wisma Jihan yang maaf tak bisa disebutkan satu persatu atas jasanya yang senantiasa mengiringi dalam setiap langkah Penyusun di saat suka maupun duka. 11. Rekan-rekan angkatan seperjuangan tercinta Fosgena Survivor

Angkatan 55, Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor. 12. Serta semua pihak yang telah membantu pelaksanaan praktikum hingga penyusunan laporan, yang tidak dapat Penyusun sebutkan satu persatu. Tak ada satu pun gading yang tak retak, begitu pula manusia tidak ada satupun yang sempurna. Oleh karena itu, Penyusun embuka diri untuk kritik dan masukan yang dapat membantu penyempurnaan laporan ini sehingga dapat dijadikan masukkan untuk perbaikan di masa yang akan datang. Semoga laporan ini bermanfaat bagi pembaca pada umumnya dan rekan-rekan sebidang keahlian, khususnya siswa/siswi Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor. Bogor, Maret 2013

Penyusun

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ............................................................................................ i DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii DAFTAR TABEL ............................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... ix BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1 A. B. C. D. Latar Belakang ....................................................................................... 1 Tujuan .................................................................................................... 2 Lokasi dan Waktu Pelaksanaan Praktik Kerja Industri ............................ 3 Pembuatan Laporan............................................................................... 3

BAB II INSTITUSI PRAKERIN ............................................................................ 5 A. B. 1. 2. C. D. E. F. G. Latar Belakang ....................................................................................... 5 Visi dan Misi ........................................................................................... 6 Visi ......................................................................................................... 6 Misi ........................................................................................................ 6 Standar Kerja ......................................................................................... 6 Ruang Lingkup Penelitian ...................................................................... 7 Metode Penelitian dan Peralatan ........................................................... 8 Tim Peneliti ............................................................................................ 8 Organisasi.............................................................................................. 8

BAB III KEGIATAN DI LABORATORIUM ........................................................... 9 A. 1. 2. a. b. c. d. Tinjauan Pustaka ................................................................................... 9 Obat ....................................................................................................... 9 Tuberkulosis......................................................................................... 12 Klasifikasi Penyakit TBC .................................................................. 14 Penularan ........................................................................................ 14 Diagnosis Penyakit TBC................................................................... 15 Komplikasi Penyakit TBC ................................................................. 16

iii

iv

3. a. e. f. g. h. 4. 5. 6. a. b. c. d. e. f. 7. a. b. B. 1. 2. a. b. 3. a. b. c.

Pyrazinamide ....................................................................................... 17 Farmakologi ..................................................................................... 18 Indikasi............................................................................................. 18 Kontra-Indikasi ................................................................................. 18 Efek Samping................................................................................... 19 Interaksi Obat................................................................................... 19 Methyl prednisolone ............................................................................. 19 Plasma Darah ...................................................................................... 20 Validasi Metode ................................................................................... 22 Selektivitas ....................................................................................... 23 Akurasi ............................................................................................. 24 Presisi .............................................................................................. 24 Perolehan Kembali (Recovery)......................................................... 24 Kurva Kalibrasi Standar.................................................................... 25 Stabilitas .......................................................................................... 26 Teori Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .......................................... 28 Mekanisme Pemisahan .................................................................... 29 Instrumentasi KCKT ......................................................................... 33 Metode Analisis .................................................................................... 42 Dasar ................................................................................................... 42 Alat dan Bahan .................................................................................... 43 Alat .................................................................................................. 43 Bahan .............................................................................................. 44 Cara Kerja ............................................................................................ 44 Pembuatan Standar Pyrazinamide 500 g/mL .............................. 44 Pembuatan Internal Standar Methyl prednisolone 150 g/mL ....... 45 Persiapan Larutan Uji (Plasma Darah) ............................................. 45

d.

Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Pengawasan Mutu (Quality Control) ........................................................................................................ 46

e. f. g.

Pengerjaan Analisis ......................................................................... 46 Kondisi Lingkungan .......................................................................... 47 Kondisi KCKT ................................................................................... 48

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 49 A. 1. 2. a. b. B. 1. Kurva Kalibrasi Standar (Standard Calibration Curve).......................... 49 Kurva Kalibrasi (Calibration Curve) ...................................................... 49 Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control Samples) ......................... 50 Linearitas ......................................................................................... 50 Batas Terendah Kuantifikasi (Lower Limit of Quantification/LLOQ) .. 51 Presisi (Precision) ................................................................................ 52 Pengujian Presisi pada Hari yang Sama (Intra-Assay Precision WithinDay Variation) ...................................................................................... 52 2. Pengujian Presisi Pada Hari yang Berbeda (Inter-Assay Precision Dayto-Day Variation) .................................................................................. 53 C. 1. Akurasi (Accuracy) ............................................................................... 53 Pengujian Akurasi pada Hari yang Sama (Intra-Assay Accuracy WithinDay Variation) ...................................................................................... 53 2. Pengujian Akurasi pada Hari yang Berbeda (Intra-Assay Accuracy Dayto-Day Variation) .................................................................................. 54 D. 1. 2. E. F. G. 1. a. Selektifitas (Selectivity) ........................................................................ 55 Selektifitas Analit (Selectivity of Analyte) .............................................. 55 Selektifitas Internal Standar (Selectivity of Internal Standard) .............. 56 Perolehan Kembali (Recovery) ............................................................ 57 Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect) .............................................. 58 Stabilitas (Stability)............................................................................... 59 Stabilitas Larutan Standar (Stability of The Standard Solution) ............ 59 Pada Suhu Kamar ............................................................................ 59

vi

b. 2. a. b. c.

Pada Kondisi Penyimpanan ............................................................. 61 Stabilitas Sampel dalam Plasma (Stability of The Plasma Samples) .... 63 Pada Suhu Ruang ............................................................................ 63 Pada Kondisi Penyimpanan ............................................................. 65 Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan (Influences of Freeze and Thaw Cycle).............................................................................. 66

d.

Stabilitas Pasca Preparasi (Post Preparative Stability) ..................... 68

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................. 75 A. B. Simpulan .............................................................................................. 75 Saran ................................................................................................... 75

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 76 LAMPIRAN........................................................................................................ 79

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Komposisi Plasma dan Fungsi Utamanya ............................................ 20 Tabel 2 Tabel Pembuatan Kurva Kalibrasi ........................................................ 46 Tabel 3 Komposisi Gradien ............................................................................... 48 Tabel 4 Kurva Kalibrasi Standar ....................................................................... 50 Tabel 5 Batas Terendah Kuantifikasi/LLOQ ...................................................... 51 Tabel 6 Pengujian Presisi Pada Hari yang Sama .............................................. 52 Tabel 7 Pengujian Presisi Pada Hari yang Berbeda .......................................... 53 Tabel 8 Pengujian Akurasi Pada Hari yang Sama ............................................. 54 Tabel 9 Pengujian Akurasi Pada Hari yang Berbeda......................................... 54 Tabel 10 Pengujian Selektifitas Analit (Pyrazinamide) ....................................... 56 Tabel 11Pengujian Selektifitas Internal Standar (Methyl prednisolone) ............. 57 Tabel 12 Pengujian Recovery............................................................................ 58 Tabel 13 Pengujian Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect) ............................ 59 Tabel 14 Pengujian Stabilitas Pyrazinamide Pada Suhu Ruang ........................ 60 Tabel 15 Pengujian Stabilitas Methyl prednisolone Pada Suhu Ruang .............. 61 Tabel 16 Pengujian Stabilitas Pyrazinamide Pada Kondisi Penyimpanan ......... 62 Tabel 17 Pengujian Stabilitas Methyl prednisolone Pada Kondisi Penyimpanan 63 Tabel 18 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Rendah Pada Suhu Ruang 64 Tabel 19 PengujianStabilitas Sampel Konsentrasi Tinggi Pada Suhu Ruang .... 64 Tabel 20 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Rendah Pada Kondisi Penyimpanan ....................................................................................... 65 Tabel 21 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Tinggi Pada Kondisi

Penyimpanan ....................................................................................... 66 Tabel 22 Pengujian Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan Terhadap Sampel Konsentrasi Rendah ................................................................ 67 Tabel 23 Pengujian Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan Terhadap Sampel Konsentrasi Tinggi .................................................................. 67 Tabel 24 Pengujian Stabilitas Sampel Pasca Preparasi .................................... 68 Tabel 25 Rangkuman Hasil Validasi Metode Analisis Pyrazinamide .................. 70

vii

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Paru-paru Penderita TBC Melalui Sinar X........................................ 12 Gambar 2 Bakteri Mycobacterium tuberculosis ................................................ 13 Gambar 3 Penyebaran Bakteri TBC ................................................................. 15 Gambar 4 Gambar Struktur Pyrazinamide........................................................ 17 Gambar 5 Struktur Senyawa Methyl prednisolone ............................................ 19 Gambar 6 Instrumentasi KCKT ........................................................................ 33 Gambar 7 Bagan Pompa Reciprocating ........................................................... 34 Gambar 8 Bagan Pompa Sistem Pergantian .................................................... 35 Gambar 9 Bagan Pompa Tekanan Udara ........................................................ 36 Gambar 10 Linearitas Kurva Kalibrasi ............................................................... 51

viii

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Lampiran 2 Lampiran 3 Lampiran 4 Lampiran 5 Lampiran 6 Lampiran 7 Struktur Organisasi PT Equilab International ............................... 79 Instrumentasi HPLC (Waters Alliance e2695) ............................. 80 Pembuatan Reagen/Pereaksi ..................................................... 81 Prosedur Proses Analisis Data di KCKT...................................... 82 Prosedur Pemakaian pH-meter ................................................... 83 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Blanko (Interday 1) .......... 84 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Blanko+Internal Standar (Interday 1) ................................................................................. 85 Lampiran 8 Lampiran 9 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 1 (Interday 1) ...... 86 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 2 (Interday 1) ...... 87

Lampiran 10 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 3 (Interday 1) ...... 88 Lampiran 11 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 4 (Interday 1) ...... 89 Lampiran 12 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 5 (Interday 1) ...... 90 Lampiran 13 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 6 (Interday 1) ...... 91 Lampiran 14 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control) Konsentrasi Rendah (Interday 1) ................................................ 92 Lampiran 15 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control) Konsentrasi Sedang (Interday 1) ................................................. 93 Lampiran 16 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control) Konsentrasi Tinggi (Interday 1) ................................................... 94

ix

BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Dewasa ini, pembangunan di sektor industri semakin meningkat, maka tidak dapat dipungkiri bahwa sekolah-sekolah kejuruan, khususnya Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor harus mampu menghadapi tuntutan dan tantangan yang senantiasa muncul dalam era-globalisasi seperti belakangan ini. Mengingat tuntutan dan tantangan masyarakat industri di

tahun-tahun mendatang akan semakin meningkat dan bersifat padat pengetahuan dan keterampilan, maka Pengembangan Pendidikan Menengah Kejuruan khususnya rumpun Kimia Analis harus difokuskan kepada kualitas lulusan. Hal ini sesuai dengan Pasal 15 Undang-undang Sisdiknas No. 20 Tahun 2003, yang menyebutkan bahwa Sekolah Menengah Kejuruan merupakan pendidikan menengah yang mempersiapkan peserta didik terutama untuk bekerja dalam bidang tertentu. Berkaitan dengan itu, maka pola pengembangan yang digunakan dalam pembinaan sistem pendidikan menjadi sangat penting. Seorang analis kimia yang terampil tidak cukup hanya dibekali ilmu kimia terapan dan praktikum-praktikum di sekolah. Melainkan perlu

pengalaman langsung di dunia industri. Hal ini disebabkan, banyaknya halhal baru diluar teori yang diberikan di sekolah yang hanya akan didapatkan dengan terjun langsung ke dunia industri. Sesuai dengan tujuan dari program pendidikan di Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor (SMAKBo) yaitu menyiapkan lulusan untuk menjadi tenaga kerja tingkat menengah dalam bidang teknisi pengelola laboratorium, pengatur dan pelaksana analisis kimia, serta melanjutkan ke jenjang yang kebih tinggi. Maka diperlukaan adanya kemitraan antara sekolah dengan

dunia industri yang akan membantu kekurangan sekolah melalui Praktik Kerja Industri (Prakerin). Pelaksanaan prakerin dibantu sepenuhnya oleh balai atau lembaga pemerintah dan perusahaan-perusahaan industri yang berhubungan dengan kimia dan atau mikrobiologi. Materi prakerin dititikberatkan pada latihan

analisis kimia yang merupakan analisis sehari-hari dan bukannya penelitian seperti halnya pada program diploma atau sarjana. Pelaksanaan prakerin

dititikberatkan pada pemantapan metode analisis, program pengendalian mutu, dan pengetahuan tentang komoditas yang dianalisis. Saat pelaksanaan Praktik Kerja Industri (Prakerin) siswa dapat melihat, mempelajari, dan mempraktikkan prosedur dan peralatan modern yang tidak mungkin dilakukan di sekolah. Selain praktik laboratorium, siswa juga berkesempatan untuk berkenalan dengan lingkungan kerja yang sesungguhnya, sehingga dapat beradaptasi dengan baik dengan lingkungan kerja yang akan dihadapi pada masa mendatang. Praktik kerja industri ini pun dapat menambah pengalaman kerja, menambah wawasan secara berdikari dibawah bimbingan yang terarah dan terpantau, baik oleh sekolah maupun oleh institusi tempat dilaksanakannya prakerin. Sehingga bila lulus nanti akan menjadi seorang analis kimia yang terampil, kreatif,produktif, dan bermoral. Kesempatan para siswa SMAKBo dalam Praktik Kerja Industri (Prakerin) ini tentunya telah menjadi suatu keuntungan yang sangat baik bagi para pelaku industri pemula. Lebih jauh lagi dalam bidang kimia analisis yang mendominasi perkembangan zaman, dan berdampak pada kemajuan nasional. Individu yang terampil merupakan aset yang sangat penting untuk kemajuan suatu negara. Selain itu, kegiatan Praktik Kerja Industri (Prakerin) ini juga merupakan suatu syarat kelulusan untuk semua siswa kelas XIII Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor (SMAKBo) yang dilakukan baik di Instansi Pemerintah, BUMN, BUMD, Lembaga-lembaga Penelitian, serta perusahaan yang memiliki Laboratoriun Kimia Analisis maupun Laboratorium Mikrobiologi.

B. Tujuan
Tujuan pelaksanaan Praktik Kerja Industri (Prakerin) khususnya yang berlangsung mulai 12 November 2012 hingga 1 Maret 2013 adalah sebagai berikut: 1. Meningkatkan kemampuan dan memantapkan keterampilan siswa sebagai bekal kerja yang sesuai dengan Program Studi Kimia Analisis. 2. Menumbuhkembangkan dan memantapkan sikap profesional siswa dalam rangka memasuki Lapangan Kerja.

3. Meningkatkan wawasan siswa pada aspek-aspek yang potensial dalam dunia kerja, antara lain : Struktur, Organisasi, Disiplin, Lingkungan Kerja, dan Sistem Kerja. 4. Menigkatkan pengetahuan siswa dalam hal penggunaan Instrumen Kimia Analisis yang lebih modern, dibandingkan dengan fasilitas yang ada di sekolah. 5. Memperoleh masukan dan umpan balik, guna memperbaiki serta mengembangkan pendidikan di Sekolah Menengah Analis Kimia. 6. Memperkenalkan Fungsi dan Tugas seorang Analis Kimia kepada Lembaga-lembaga Penelitian dan Perusahaan Industri di tempat pelaksanaan prakerin. 7. Melatih siswa agar dapat menerapkan pengetahuan dalam dunia kerja , baik teori maupun praktik yang telah diberikan di sekolah. 8. Menumbuhkan pengetahuan dalam analisis berbagai material di dunia industri. 9. Memberikan peluang untuk penempatan lulusan dan kerja sama.

C. Lokasi dan Waktu Pelaksanaan Praktik Kerja Industri

Prakerin dilaksanakan di unit atau bagian dalam Perusahaan Industri atau Lembaga Penelitian, terutama yang mendukung terhadap kegiatan atau pendidikan Kimia Analisis. Adapun tempat Prakerin yang dipilih oleh

Penyusun adalah PT. Equilab International yang berlokasi di Jalan RS. Fatmawati Persil 33 Cilandak-Jakarta Selatan dengan waktu pelaksanaan mulai 12 November 2012 sampai 1 Maret 2013.

D. Pembuatan Laporan
Pada akhir kegiatan Praktik Kerja Industri, siswa/siswi diwajibkan membuat laporan yang nanti akan diujikan sebagai syarat kelulusan siswa. Adapun tujuan pembuatan laporan ini yaitu : 1. Mengembangkan kemampuan siswa dalam mengumpulkan data dan meningkatkan kemampuan berfikir terutama dalam mengevaluasi data. 2. Memantapkan dalam penerapan pelajaran bagi siswa dari sekolah ke tempat prakerin.

3. Sebagai bahan ujian lisan dan pertanggungjawaban kepada sekolah atas prakerin yang telah dilakukan. 4. Menambah koleksi pustaka di perpustakaan sekolah sehingga dapat menambah ilmu bagi para pembaca.

BAB II INSTITUSI PRAKERIN

A. Latar Belakang
PT Equilab International adalah suatu perusahaan independen di Indonesia yang bergerak dalam bidang penelitian, khususnya dalam Uji Bioavailabilitas/Bioekivalensi (BA/BE) dan Uji Klinilk. Dalam rangka upaya

pemerintah Indonesia menyediakan obat yang bermutu baik dengan harga relatif murah bagi masyarakat, Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) meminta produsen obat di Indonesia untuk juga membuktikan kualitas obat salinan (copy) ekivalen dengan obat inovator melalui uji BA/BE disamping standar-standar lain yang selama ini telah berlaku. Pembuktian melalui uji BABE memiliki dampak yang sangat positif bagi masyarakat, pemerintah, dan institusi farmasi karena : 1. Dapat meningkatkan keyakinan masyarakat bahwa obat yang

diproduksi di Indonesia mempunyai mutu yang baik disamping harganya yang lebih kompetitif. 2. Memacu industri farmasi di Indonesia untuk terus memperbaiki kualitas produknya. 3. Mendukung industri farmasi di Indonesia untuk dapat memasarkan produknya di luar negeri. Selain uji BA/BE, PT Equilab International juga memberikan jasa untuk penelitian uji klinik dengan tujuan untuk menguji efektivitas dan keamanan suatu obat/pengobatan pada sekelompok manusia sehat/penderita dalam jumlah tertentu agar hasilnya dapat ditetrapkan pada penderita lain di kemudian hari secara rutin.

B. Visi dan Misi

1. Visi Menjadi perusahaan penyedia jasa penelitian terkemuka di regional dan global, khususnya di bidang Bioavailabilitas/Bioekivalensi (BA/BE) dan Uji Klinik dengan keunggulan bersaing yang memenuhi standar internasional. 2. Misi Adapun misi dari PT Equilab International diantaranya : Mengembangkan berkualitas tinggi. Mengembangkan kemitraan berkelanjutan dengan pelanggan. Menerapkan ilmu pengetahuan dan eknologi tepat guna, serta menjunjung tinggi etika penelitian dengan mengutamakan keselamatan subjek penelitian. Beradaptasi aktif dalam mewujudkan standar obat bermutu. Meningkatkan kemampuan sumber daya manusia dan sistem secara berkelanjutan. dan melaksanakan penelitian yang

C. Standar Kerja
Dalam melakukan pengujian klinis pada subjek manusia, PT Equilab International menggunakan standar Cara Uji Klinik yang Baik (CUKB) yang merupakan standar ICH-Good Practice yang telah diadopsi oleh pemerintah Indonesia pada tahun 2001 dan WHO Annex 9 : Additional Guidance for Organizations Performing In-Vitro Bioequivalence Studies. Standar Mutu dan Kompetensi Laboratorium yang digunakan oleh PT Equilab International adalah ISO/IEC 17025:2005 dan untuk operasional sistem manajemen untuk kegiatan pengujian PT Equilab International memenuhi prinsip-prinsip manajemen mutu dalam ISO 9001:2000 yaitu dalam melaksanakan peningkatan berkesinambungan dan penentuan sasaran mutu yang

ditetapkan dalam kaji ulang manajemen. Lembaga yang mengakreditasi PT Equilab International sesuai dengan sistem ISO/IEC 17025:2005 adalah

Komite Akreditasi Nasional sebagai lembaga akreditasi yang sesuai dengan ISO/IEC 17011.

D. Ruang Lingkup Penelitian

PT Equilab International memfokuskan penelitian pada studi : 1. BA/BE yang mencakup : Pengembangan dan validasi metode pengukuran kadar obat dalam cairan biologis. Penyusunan protokol penelitian. Persiapan dan pengajuan permohonan perizinan (ethical clearance) ke Komisi Etik. Pemeriksaan kesehatan dan screening sukarelawan. Pengambilan sampel sukarelawan. Analisis sampel. Pengolahan data dan analisa statistik. Penyusunan laporan. Dokumentasi. 2. Uji Klinik yang mencakup : Penyusunan protokol. Permohonan acuan etik (ethical reference) ke Komisi Etik. Seleksi peneliti dan tempat penelitian. Penelitian. Screening data awal. Pengukuran laboratorium. Pengumpulan data. Pengolahan data dan analisis statistik. Publikasi. Dokumentasi. 3. Uji Farmasetik/Pharmaceutical Test yang mencakup : Uji Disolusi Terbanding. Uji Kadar. Uji Farmasi lainnya. parameter-parameter pemeriksaan kesehatan di

E. Metode Penelitian dan Peralatan

Metode analisis yang digunakan dalam penelitian BA/BE harus divalidasi terlebih dahulu yang menyangkut Spesififitas, Sensitivitas,

Linearitas, Presese, dan Reprodusibilitas dengan cara-cara yang sesuai dengan ketentuan ISO/IEC 17025:2005 dan Validasi Metode untuk

Bioanalisis. Laboratorium Equilab dalam analisis sampel menggunakan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) dengan sistem deteksi : Ultra-Violet (UV), Detektor Photo Dioda Array (Photodiode Array Detector), dan Fluoresensi (Fluorescence) ; Kromatografi Cair Spektroskopi Massa (Liquid Chromatography Mass Spectrometer, LC MS/MS) tandem, serta Kromatografi Cair Kinerja Ultra ( Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC MS/MS) tandem.

F. Tim Peneliti
PT Equilab International didukung oleh tenaga-tenaga peneliti yang telah berpengalaman bertahun-tahun bekerja dengan HPLC-

UV/Fluorescence, LC MS/MS, UPLC MS/MS dan juga telah berpengalaman melakukan uji BA/BE dan uji klinik. Kualifikasi para peneliti ini ialah Dokter, Paramedis, Ahli Farmasi, Ahli Kimia, Ahli Statistik, dan Ahli Farmakologi.

G. Organisasi
Laboratorium PT Equilab International merupakan suatu kesatuan yang secara legal dapat dipertanggungjawabkan. Laboratorium PT Equilab International bertanggungjawab untuk melakukan pengujian sesuai

persyaratan standar ISO/IEC 17025:2005 dan untuk memuaskan kebutuhan pelanggan, pihak yang berwenang atau organisasi yang memberikan pengkuan, sesuai dengan yang tercantum pada Prosedur Tata Laksana Organisasi. Sistem manajemen PT Equilab International mencakup pekerjaan yang dilakukan dalam Fasilitas Laboratorium yang permanen. Untuk Bagan Struktur Organisasi PT Equilab International terdaat di Lampiran 1.

BAB III KEGIATAN DI LABORATORIUM

A. Tinjauan Pustaka
1. Obat Obat dapat didefinisikan sebagai suatu zat yang dimaksudkan untuk dipakai dalam diagnosis, mengurangi rasa sakit, mengobati atau mencegah penyakit pada manusia atau hewan. Obat dapat berasal dari alam, diperoleh dari sumber mineral, tumbuh-tumbuhan, dan hewan, atau dapat dihasilkan dari sintesis kimia organik atau biosintesis. Bahan obat dicampurkan dengan unsur-unsur farmasetik yang tidak aktif secara fisiologi dalam pembuatan bermacam-macam bentuk sediaan yang dipakai sekarang (Anonimus, 2012). Berdasarkan sumbernya, obat digolongkan menjadi tiga, yaitu : Obat alamiah, yaitu obat yang terdapat di alam seperti pada tanaman, hewan, dan mineral. Obat semisintetik, yaitu obat hasil sintesis yang bahan dasarnya berasal dari bahan obat yang terdapat di alam. Obat sintetik murni, yaitu obat yang bahan dasarnya tidak berkhasiat, setelah disintesis akan didapatkan senyawa dengan khasiat farmakologis tertentu. Berdasarkan Permenkes, obat yang dipasarkan digolongkan berdasarkan khasiatnya, yaitu : Obat Narkotika. Obat Keras. Obat Bebas Terbatas. Obat Bebas.

10

Berdasarkan penamaannya, obat dibedakan menjadi dua, yaitu : Obat Generik, merupakan nama resmi obat yang dikeluarkan oleh WHO. Obat Paten, merupakan obat produksi suatu perusahaan dengan nama khas yang dilindungi hukum, yang disebut merek dagang (trade mark) Obat memiliki peranan penting dalam bidang kesehatan, tetapi di Indonesia beberapa harga obat terutama obat paten relatif mahal untuk masyarakat menengah ke bawah. Sehingga, saat ini banyak produsen obat yang telah membuat obat generik yang mengandung zat aktif, bentuk, sediaan, kekuatan, indikasi, efektivitas, cara dan dosis yang sama dengan obat patennya. Untuk membuktikan kualitas obat tersebut, Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) selaku regulator di Indonesia mewajibkan kepada produsen obat tersebut untuk melakukan studi Bioavailabilitas/Bioekivalensi (BA/BE). Bioavailabilitas adalah persentase dan kecepatan zat aktif dalam suatu produk obat yang tersedia dalam sirkulasi sistemik yang berbentuk utuh/aktif setelah pemberian produk obat tersebut diukur kadarnya dalam darah terhadap waktu atau ekskresinya dalam urin. Sedangkan studi

Bioekivalensi adalah studi perbandingan Bioavailabilitas antara dua formulasi obat (Obat Generik dan Obat Paten) yang memiliki zat aktif sama. Sampel darah diperoleh dari subjek sehat (subjek yang telah

diperiksa kondisi kesehatannya terlebih dahulu) pada studi BA/BE, kemudan dipisahkan plasmanya untuk dianalisis kadarnya dengan menggunakan metode analisis yang sudah tervalidasi (Anonimus, 2004). Pada tahun 1960-an diketahui bahwa produk obat yang kandungan zat berkhasiatnya sama atau setara, memberikan efek terapetik yang berbeda. Terbukti dua produk obat yang secara kimia

setara (pada penilaian in vitro) dapat memberikan perbedaan jumlah kadar obat yang dicapai dalam plasma darah (penilaian in vivo). Hal ini disebabkan perbedaan jumlah zat yang tersedia untuk memberikan efek terapetik. Syarat terpenting suatu produk obat adalah zat aktifnya dapat mencapai bagian tubuh tempat obat itu diharapkan bekerja, serta dalam jumlah yang cukup untuk memberikan respon farmakologis. Syarat ini

11

disebut ketersediaan obat secara biologis atau bioavailabilitas (Biological Availability). Ketersediaan biologis (Biological Availability) adalah jumlah relatif obat atau zat aktif suatu produk obat yang diabsorpsi, serta kecepatan obat itu masuk ke dalam peredaran darah sistemik. Obat

dinyatakan tersedia (available) jika setelah diabsorpsi obat tersebut tersedia untuk bekerja pada jaringan yang dituju dan memberikan efek farmakologis setelah berikatan dengan reseptor di jaringan tersebut. Ketersediaan farmasetik (Pharmaceutical Availaibity) adalah ukuran untuk bagian obat yang in vitro dilepaskan dari bentuk sediaannya dan siap diabsorpsi. Dengan kata lain, kecepatan larut obat yang tersedia in vitro. Dari penelitian pharmaceutical availability sediaan tablet

diketahui bahwa setelah ditelan tablet akan pecah (terdisintegrasi) di dalam lambung menjadi granul-granul kecil. Stelah granul pecah, zat aktif terlepas dan melarut (terdisolusi) di dalam cairan lambung atau usus. Setelah melarut, obat tersedia untuk diabsorpsi. Peristiwa ini disebut fase ketersediaan farmasetik. Berdasarkan uraian tersebut jelas bahwa obat yang diberikan dalam bentuk larutan mencapai ketersediaan farmasetik lebih cepat dibandingkan sediaan tablet, karena tidak mengalami tahap disintegrasi. Pharmaceutical availability ditentukan secara in vitro di

laboratoium dengan mengukur kecepatan melarut zat aktif dalam waktu tertentu (dissolution rate). Pengukuran ini menggunakan metode dan alat yang ditetapkan oleh United States Pharmacopeia/USP untuk meniru seakurat mungkin keadaan alami di dalam saluran cerna. Akan tetapi, cara penelitian yang praktis ini jarang memberikan hasil yang berkorelasi dengan kadar obat dalam plasma in vivo, sehingga perlu dilanjutkan dengan pengukuran bioavailabilitas obat. Bioavailabilitas diukur secara in vivo dengan menentukan kadar obat dalam plasma setelah tercapai keadaan tunak (steady state). Pada keadaan ini, terjadi kesetimbangan antara kadar obat di semua jaringan tubuh dan kadar obat di plasma relatif konstan karena jumlah obat yang diabsorpsi dan dieliminasi adalah sama. Umumnya terdapat korelasi

yang baik antara kadar obat dalam plasma dan efek terpetik obat.

Bioavailabilitas obat sangat tergantung pada dua faktor, yaitu faktor obat dan faktor pengguna obat. Terdapat kemungkinan obat yang sama diberikan pada orang yang sama, dalam keadaan berbeda, memberikan kurva dosis-respon yang berbeda. Faktor-faktor yang mempengaruhi diantaranya : 1) Faktor Obat : Kelarutan obat. Ukuran partikel. Bentuk fisik obat. Dosage form Teknik formulasi 2) Faktor Pengguna : Umur, berat badan, luas permukaan tubuh. Waktu dan cara obat diberikan. Kecepatan pengosongan lambung. Gangguan hepar dan ginjal. Interaksi obat lain. Di dalam tubuh manusia, Pyrazinamide terserap ke dalam aliran darah. Kemudian plasma darah yang merupakan bagian cairan dalam darah yang mengandung Pyrazinamide dianalisis sesuai metode yang digunakan yaitu menggunakan instrumen HPLC-UV. harus divalidasi terlebih dahulu. inovator. 2. Tuberkulosis Metode tersebut

Hal ini penting untuk menentukan

kualitas obat generik yang akan dibandingkan terhadap obat paten atau

Gambar 1 Paru-paru Penderita TBC Melalui Sinar X

12

13

Gambar 2 Bakteri Mycobacterium tuberculosis Penyakit tuberkulosis ini paling sering menyerang paru-paru walaupun pada sepertiga kasus menyerang organ tubuh lain dan ditularkan orang ke orang. Penyakit ini juga salah satu penyakit tertua yang diketahui menyerang manusia. Jika diterapi dengan benar,

tuberkulosis yang disebabkan oleh kompleks Mycobacterium tuberculosis, yang peka terhadap obat, praktis dapat disembuhkan. Tanpa terapi

tuberkulosis akan mengakibatkan kematian dalam lima tahun pertama pada lebih dari setengah kasus (Anonimus, 2013). Pada tahun 1992 WHO telah mencanangkan tuberkulosis sebagai Global Emergency. Laporan WHO tahun 2004 menyatakan Pada tahun 2002,

bahwa terdapat 8,8 juta kasus baru tuberkulosis.

sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi kuman tuberkulosis dan menurut regional WHO jumlah terbesar kasus ini terjadi di Asia Tenggara yaitu 33% dari seluruh kasus di dunia. Indonesia berada dalam peringkat ketiga terburuk di dunia untuk jumlah penderita TB. Setiap tahun muncul 500 ribu kasus baru dan lebih dari 140 ribu lainnya meninggal. Seratus tahun yang lalu, satu dari lima kematian di Amerika Serikat disebabkan oleh tuberkulosis. Pengobatan tuberkulosis berlangsung cukup lama yaitu

setidaknya 6 bulan pengobatan dan selanjutnya dievaluasi oleh dokter apakah perlu dilanjutkan atau berhenti, karena pengobatan yang cukup lama seringkali membuat pasien putus berobat atau menjalankan pengobatan secara tidak teratur, kedua hal ini ini fatal akibatnya yaitu pengobatan tidak berhasil dan kuman menjadi kebal disebut MDR (Multi Drugs Resistance), kasus ini memerlukan biaya berlipat dan lebih sulit dalam pengobatannya sehingga diharapkan pasien disiplin dalam berobat setiap waktu demi pengentasan tuberkulosis di Indonesia

a. Klasifikasi Penyakit TBC Penyakit TBC diklasifikasikan atas 5 jenis, yaitu : Tuberkulosis paru terkonfirmasi secara bakteriologis dan histologis Tuberkulosis paru tidak terkonfirmasi secara bakteriologis dan histologis Tuberkulosis pada sistem saraf Tuberkulosis pada organ-organ lainnya Tuberkulosis millier b. Penularan Penularan penyakit ini karena kontak dengan dahak atau menghirup titik-titik air dari bersin atau batuk dari orang yang terinfeksi kuman tuberkulosis, anak anak sering mendapatkan penularan dari orang dewasa di sekitar rumah maupun saat berada di fasilitas umum seperti kendaraan umum, rumah sakit dan dari lingkungan sekitar rumah. Bakteri ini dapat menyebar melalui

pembuluh darah atau kelenjar getah bening. Oleh sebab itu, infeksi TBC dapat menginfeksi hampir seluruh organ tubuh seperti: paruparu, otak, ginjal, saluran pencernaan, tulang, kelenjar getah bening, dan lain-lain, meskipun demikian organ tubuh yang paling sering terkena yaitu paru-paru. Saat Mikobakterium tuberkulosa berhasil menginfeksi paruparu, maka dengan segera akan tumbuh koloni bakteri yang berbentuk globular (bulat). Biasanya melalui serangkaian reaksi

imunologis bakteri TBC ini akan berusaha dihambat melalui pembentukan dinding di sekeliling bakteri itu oleh sel-sel paru. Mekanisme pembentukan dinding itu membuat jaringan di

sekitarnya menjadi jaringan parut dan bakteri TBC akan menjadi dormant (istirahat). Bentuk-bentuk dormant inilah yang sebenarnya terlihat sebagai tuberkel pada pemeriksaan foto rontgen. Pada sebagian orang dengan sistem imun yang baik, bentuk ini akan tetap dormant sepanjang hidupnya. Sedangkan

pada orang-orang dengan sistem kekebalan tubuh yang kurang,

14

bakteri ini akan mengalami perkembangbiakan sehingga tuberkel bertambah banyak. Tuberkel yang banyak ini membentuk sebuah ruang di dalam paru-paru. Ruang inilah yang nantinya menjadi sumber produksi sputum (dahak). Seseorang yang telah

memproduksi sputum dapat diperkirakan sedang mengalami pertumbuhan tuberkel berlebih dan positif terinfeksi TBC. Dalam memerangi penyebaran Tuberkulosis terutama pada anak anak yang masih rentan daya tahan tubuhnya maka, pemerintah Indonesia telah memasukkan Imunisasi Tuberkulosis pada anak anak yang disebut sebagai Imunisasi BCG sebagai salah satu program prioritas imunisasi wajib nasional beserta dengan 4 jenis imunisasi wajib lainnya yaitu hepatitis B, Polio, DPT dan campak.

Gambar 3 Penyebaran Bakteri TBC c. Diagnosis Penyakit TBC Diagnosa tuberkulosis dapat ditegakkan berdasarkan gejala klinis, pemeriksaan jasmani, pemeriksaan bakteriologi , radiologi dan pemeriksaan penunjang lainnya.

15

Gejala klinis tuberkulosis dapat dibagi menjadi 2 golongan, yaitu : Gejala lokal Apabila organ yang terkena adalah paru-paru, maka gejala lokal ialah gejala respiratori atau gejala gejala yang erat hubungannya dengan organ pernapasan (sedang gejala lokal lain akan sesuai dengan organ yang terlibat). Gejala respiratori ialah batuk lebih dari 2 minggu, batuk bercampur darah. Dapat pula nyeri dada dan sesak napas. Gejala respiratori sangat bervariasi, dari mulai tidak ada gejala sampai gejala yang cukup berat tergantung dari luas lesi. Sehingga terkadang pasien baru mengetahui dirinya terdiagnosis Tuberkulosis saat medical check up. Gejala sistemik Gejala sistemik merupakan akibat atau lanjutan dari gejala respiratori. Contoh gejala sistemik antara lain demam, badan lemah yang disebut sebagai malaise, keringat malam, anoreksia dan berat badan menurun menjadi semakin kurus (Anonimus, 2011). d. Komplikasi Penyakit TBC Beberapa komplikasi yang sering ditemukan pada pasien TBC atau TB antara lain sebagai berikut : Kerusakan Tulang dan Sendi Nyeri tulang punggung dan kerusakan sendi bisa terjadi ketika infeksi kuman TB menyebar dari paru-paru ke jaringan tulang. Dalam banyak kasus, tulang iga juga bisa terinfeksi dan memicu nyeri di bagian tersebut. Kerusakan Otak Kuman TB yang menyebar hingga ke otak bisa menyebabkan meningitis atau peradangan pada selaput otak. Radang tersebut memicu pembengkakan pada membran

16

yang menyelimuti otak dan seringkali berakibat fatal atau mematikan. Kerusakan Hati dan Ginjal Hati dan ginjal membantu menyaring pengotor yang ada adi aliran darah. Fungsi ini akan mengalami kegagalan apabila kedua organ tersebut terinfeksi oleh kuman TB. Kerusakan Jantung Jaringan di sekitar jantung juga bisa terinfeksi oleh kuman TB. Akibatnya bisa terjadi cardiac tamponade, atau peradangan dan penumpukan cairan yang membuat jantung jadi tidak efektif dalam memompa darah dan akibatnya bisa sangat fatal. Gangguan Mata Ciri-ciri mata yang sudah terinfeksi TB adalah berwarna kemerahan, mengalami iritasi dan membengkak di retina atau bagian lain. Resistensi Kuman Pengobatan dalam jangka panjang seringkali

membuat pasien tidak disiplin, bahkan ada yang putus obat karena merasa bosan. Pengobatan yang tidak tuntas atau tidak disiplin membuat kuman menjadi resisten atau kebal, sehingga harus diganti dengan obat lain yang lebih kuat dengan efek samping yang tentunya lebih berat (Pramudiarja, 2012). 3. Pyrazinamide

Gambar 4 Gambar Struktur Pyrazinamide Memiliki nama lain yaitu Pyrazinecarboxamide; Pyrazinoic acid amide; Pyrazine carboxylamide dan nama IUPAC : Pyrazine-2carboxamide dengan rumus molekul C5H5N3O. Memiliki bobot molekul

17

123,11 dengan kadar C sebesar 48,78%, H sebesar 4,09%, N sebesar 34,13%, dan O sebesar 13,00 %. Merupakan senyawa yang mulai menyublim pada suhu 600C dan mempunyai titik didih pada 1890-1910C. Memiliki kelarutan dalam air (15 mg/mL), metanol (13,8 mg/mL), etanol (5,7 mg/mL), 2-propanol (3,8 mg/mL), dietil eter (1,0 mg/mL), kloroform (7,4 mg/mL), dan iso-oktana (0,01 mg/mL). a. Farmakologi Pyrazinamide merupakan obat antituberkulosis yang

digunakan sebagai terapi kombinasi dengan antituberkulosis (TBC) lainnya. Pyrazinamide aktif dalam suasana asam terhadap Pyrazinamide bersifat bakterisid terutama pada

mikobakterium.

basil tuberkulosis intraselular (Radhi, 2012). Pada pemberian oral Pyrazinamide mudah diserap dan tersebar luas ke seluruh jaringan tubuh. antara 10 16 jam. Kadar puncak dalam

serum tercapai dalam waktu kurang lebih 2 jam dan waktu paruh Pyrazinamide mengalami hidrolisis dan

hidroksilasi menjadi asam hidroksi pirazinoat yang merupakan metabolit utamanya dan diekskresi melalui filtrasi glomerulus. e. Indikasi Indikasi kombinasi). f. Kontra-Indikasi Penderita yang hipersensitif atau alergi terhadap Pyrazinamide adalah untuk pengobatan

tuberkulosis yang diberikan bersama antituberkulosis lainnya (terapi

Pyrazinamide. Penderita dengan gangguan fungsi hati atau gangguan fungsi ginjal. Hiperurisemia dan atau gout / asam urat. Hipoglikemia (kadar gula darah rendah). Penderita Diabetes.

Wanita hamil.

18

g. Efek Samping Efek samping berupa artralgia, anoreksia, nausea, disuria, malaise, demam, porfiria, hepatomegali splenomegali, jaundice, kerusakan sel hati, fatal hemolysis, sideroblastik anemia, tukak lambung, trombositopenia, rash, hepatotoksisitas, gout, intoleransi saluran pencernaan, ulkus peptikum yang bertambah parah, dysuria, urtikaria, pruritus, akne, fotosensitivitas, dan interstitial nefritis. h. Interaksi Obat Probenesid dapat menghambat pengeluaran Pyrazinamide melalui ginjal (Anonimus, 2011). 4. Methyl prednisolone

Gambar 5 Struktur Senyawa Methyl prednisolone Merupakan padatan kristal yang berbobot molekul sebesar 374,47. Memiliki rumus molekul C22H30O5 dengan kadar C sebesar

70,56%, H sebesar 8,07%, dan O sebesar 21,36%. Kristal ini tidak larut dalam air, larut dalam metanol, sedikit larut dalam aseton dan kloroform, serta sangat sedikit larut dalam eter. Pada metode analisis pyrazinamide dalam plasma darah manusia menggunakan HPLC-UV, methyl prednisolone digunakan sebagai standar internal. Standar internal yaitu penambahan zat lain yang tidak sama dengan sampel atau standar akan tetapi mempunyai sifat fisikokimia yang mirip dengan sampel dan bertujuan untuk mengurangi variasi konsentrasi standar dan sampel akibat faktor-faktor yang mempengaruhi kepekaan dan respon detektor seperti fluktuasi listrik,

19

temperatur kolom dan detektor, variasi injeksi dan sebagainya (Gritter,

1991).
5. Plasma Darah Plasma darah merupakan bagian cair darah. Sekitar 90% plasma terdiri dari air, 7-8% protein dan disamping itu plasma mengandung karbohidrat, lipid, asam amino, dan garam anorganik terutama NaCl (Mutschler, 1991). Komposisi plasma dan fungsi utamanya dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Komposisi Plasma dan Fungsi Utamanya Kandungan Air Garam (Natrium, Fungsi Utama Pelarut bagi zat-zat lain Kalium, Penyeimbang tekanan osmosis,

Kalsium, Magnesium, Klorida, mempertahankan pH, meregulasi Bikarbonat) Protein (Albumin, permeabilitas membran Fibrinogen, Pembekuan darah, pertahanan

Imunoglobulin)

tubuh (antibodi)

Plasma berguna dalam pengaturan tekanan osmosis darah sehingga dengan sendirinya jumlahnya dalam tubuh akan diatur, misalnya dengan proses ekskresi. Plasma juga bertugas membawa sari-sari makanan, sisa metabolisme, hasil sekresi dan beberapa gas (Mutschler, 1991). Plasma darah dapat dipisahkan di dalam sebuah tabung berisi darah segar yang telah dibubuhi zat anti-koagulan, yang kemudian diputar sentrifugal sampai sel darah merah jatuh ke dasar tabung, sel darah putih akan berada di atasnya dan membentuk lapisan buffy coat, plasma darah berada di atas lapisan tersebut dengan kepadatan sekitar 1025 kg/m3 atau 1.025 kg/l. Serum darah adalah plasma tanpa

fibrinogen, sel dan faktor koagulasi lainnya. Fibrinogen menempati 4% alokasi protein dalam plasma dan merupakan faktor penting dalam proses pembekuan darah.

20

21

Di dalam plasma, obat berinteraksi dengan protein plasma, jaringan atau makromolekul lain seperti melanin dan DNA membentuk suatu kompleks obat-makromolekul, kompleks ini sering disebut ikatan obat protein. irreversibel. Ikatan obat protein dapat berupa proses reversibel dan Namun, sebagian besar obat berikatan atau membentuk

kompleks dengan protein dengan proses reversibel (Leon & Andrew, 1988). Ikatan obat protein yang reversibel ini menunjukan bahwa obat mengikat protein dengan ikatan kimia yang lebih lemah dibandingkan pada proses irreversibel, seperti ikatan hidrogen atau gaya Van der Waals. Komponen utama protein plasma yang bertanggung jawab terhadap ikatan obat adalah albumin. Obat-obat asam lemah seperti

salisilat, fenilbutazon, dan penisilina terikat kuat dengan albumin. Namun, kekuatan ikatan obat dengan albumin berbeda untuk masing-masing obat. Protein lain seperti globulin yang dapat berikatan dengan obat-obat hanya merupakan bagian terkecil dari keseluruhan ikatan protein plasma. Dalam proses analisis, obat tersebut harus dipisahkan dari ikatan proteinnya. Hal ini dikarenakan protein dapat mengganggu proses

analisis dan merusak kolom HPLC, sehingga usia kolom menjadi pendek. Pemisahan protein dapat dilakukan dengan cara pengendapan protein. Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, dan penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum Protein

digunakan adalah dengan penambahan precipitating agent.

dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein

memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga potein dapat mengendap (Farida, 2012).

Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifat lain yang

berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen. Penggunaan pelarut organik seperti methanol dan asetonitril sebagai zat pengendap protein sangat umum digunakan terutama yang melibatkan metode analisis HPLC. Pengendapan ini berkaitan dengan pI protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan organik seperti metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan

menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga

menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. Penggunaan methanol dan asetonitril mempunyai suatu keuntungan karena kompabilitasnya dengan berbagai eluen yang digunakan dalam metode HPLC. 6. Validasi Metode Validasi metode adalah konfirmasi bahwa suatu metode dapat memenuhi persyaratan tujuan penggunaannya, yaitu melakukan uji untuk metode kerja yang bersangkutan dan mengumpulkan bukti atau hasilnya. Validasi metode merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan penggunaannya. Validasi

metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai peruntukannya. Metode analisis yang sensitif dan selektif untuk evaluasi kuantitatif obat-obatan dan merupakan suatu hal yang penting untuk keberhasilan pelaksanaan studi

22

praklinis, biofarmasetik, dan farmakologi klinis.

Validasi metode

bioanalisis mencakup semua prosedur yang membuktikan bahwa suatu metode khusus yang digunakan untuk pengukuran kuantitatif pada analit dalam suatu matriks biologis seperti darah, plasma, serum, atau urin, dapat dipercaya dan memiliki ketertiruan (reproducible) untuk tujuan penggunaannya (Anonimus, 2001). Analisis obat-obatan dan metabolitnya dalam suatu matriks biologis dilakukan dengan menggunakan suatu standar (reference standard) dan menggunakan sampel kontrol (Quality Control). Kemurnian dari standar pembanding yang digunakan untuk menyiapkan sampel yang akan diberikan sejumlah standar (spiked sample) dapat mempengaruhi data studi. Karena alasan inilah, standar pembanding analisis otentik

yang diketahui identitas dan kemurniannya harus digunakan untuk menyiapkan larutan dengan konsentrasi tertentu. Menurut pedoman USFDA (United States Food and Drug Administration), Validasi Metode merupakan suatu prosedur yang menunjukkan fakta yang digunakan untuk pengukuran analit secara kuantitatif dalam matriks cairan biologis seperti : darah, plasma, serum, atau urin yang dapat dipercaya dan reprodusibel. Parameter dasar untuk Validasi Metode Bioanalisis meliputi Akurasi, Presisi, Selektivitas, Sensitivitas, Reproduktivitas, dan Stabilitas. Pengukuran untuk masingmasing analit dalam matriks biologi harus divalidasi. Selain itu, stabilitas analit dalam sampel yang diberikan sejumlah standar juga harus ditentukan. bioanalisis Metode yang disusun dan dikembangkan untuk metode meliputi penentuan Selektivitas (Selectivity), Akurasi

(Accuracy), Presisi (Precision), Perolehan Kembali (Recovery), Kurva Kalibrasi (Calibration Curve), Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect), Limit Kuantitasi (Limit of Quantification), dan Stabilitas (Stability) Standar, Internal Standar, dan Analit dalam sampel (plasma blanko) yang telah diberi sejumlah standar (Spiked Sample) (Anonimus, 2001). a. Selektivitas Selektivitas adalah kemampuan dari suatu metode analisis untuk membedakan dan menghitung jumlah analit terhadap keberadaan komponen lain di dalam sampel. Untuk uji selektivitas,

23

analisis sampel blanko pada matriks biologis yang sesuai (plasma, urin, atau matriks lainnya) harus diperoleh dari minimal enam sumber. Setiap sampel blanko harus diuji gangguannya, dan

selektivitas harus dipastikan pada batas terendah dari kuantifikasi (Lower Limit Of Quantification/LLOQ). b. Akurasi Ketepatan (akurasi) metode analisis menggambarkan kedekatan hasil uji yang diperoleh dari metode yang digunakan, dengan nilai sebenarnya. Akurasi ditentukan dengan mengulang analisis sampel yang mengandung analit yang telah diketahui jumlahnya. Akurasi harus diukur dengan menggunakan minimal

lima penetapan per konsentrasi. Penggunaan minimum tiga variasi konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang ditentukan juga dianjurkan. Nilai yang terukur harus berada dalam rentang 15,00 % dari nilai sebenarnya kecuali untuk LLOQ, yang seharusnya tidak menyimpang dari rentang 20 %. c. Presisi Presisi suatu metode analisis menggambarkan kedekatan pengukuran individu dari suatu analit ketika prosedur diterapkan berulang kali ke beberapa alikuot dari satu volume matriks biologis yang homogen. Presisi harus diukur menggunakan minimal lima penentuan setiap konsentrasi. Penggunaan minimum tiga variasi konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang ditentukan juga dianjurkan. Presisi ditentukan pada setiap tingkat konsentrasi, yaitu tidak boleh melebihi 15,00 % dari koefisien variasi (CV). d. Perolehan Kembali (Recovery) Menurut USFDA, Perolehan kembali (Recovery) suatu analit dalam suatu pengujian adalah respon detektor yang diperoleh dari sejumlah analit yang ditambahkan dan diekstrak dari matriks biologis, dibandingkan dengan respon detektor yang diperoleh untuk konsentrasi sebenarnya dari suatu standar yang murni.

24

Perolehan kembali berkenaan dengan efisiensi ekstraksi metode analisis dalam batas-batas variabilitas. Perolehan kembali analit

tidak harus 100%, tetapi jangkauan perolehan kembali dari analit dan standar harus konsisten, tepat, dan terulang. perolehan kembali (recovery) harus dilakukan Pengujian dengan

membandingkan hasil analisis untuk sampel terekstraksi pada tiga konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) dengan standar yang tidak diekstrak yang mewakili 100 % perolehan kembali. e. Kurva Kalibrasi Standar Suatu Kurva Kalibrasi (Standar) adalah hubungan antara respon instrumen dan konsentrasi analit yang telah diketahui. Suatu Kurva Kalibrasi harus dibuat untuk setiap analit dalam sampel. Sejumlah standar yang cukup harus digunakan untuk Kurva

menentukan hubungan antara konsentrasi dan respon.

alibrasi harus disiapkan dalam matriks biologis yang sama seperti sampel dalam studi yang dilakukan dengan melakukan sejumlah standar (spike) pada matriks dengan konsentrasi analit yang diketahui. Jumlah standar yang digunakan dalam membuat Kurva Kalibrasi akan menjadi fungsi dari hubungan antara rentang niali analisis yang diantisipasi dan sifat dari analit. Konsentrasi standar harus dipilih berdasarkan rentang konsentrasi yang diharapkan pada studi tertentu. Kurva kalibrasi harus terdiri dari sampel blanko (matriks sampel yang diproses tanpa Internal Standar) dan enam sampai delapan sampel bukan nol yang mencakup rentang yang diharapkan, termasuk batas bawah kuantifikasi. 1) Linearitas Linearitas adalah kemampuan metode memperoleh hasil uji yang berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam suatu rentang yang ditetapkan. Linearitas suatu

metode dapat diperoleh dengan menggambarkan secara grafik hasil uji sebagai fungsi dari konsentrasi analit.

25

Linearitas biasanya ditetapkan dengan menghitung garis regresi dari hasil uji terhadap konsentrasi analit. 2) Batas Terendah Kuantifikasi/Lower Limit of Quantification (LLOQ) Menurut pedoman validasi metode bioanalisis dari USFDA untuk industri, LLOQ yaitu konsentrasi terkecil dari suatu analit dalam suatu kurva kalibrasi yang dapat dikuantitasi dengan tingkat kepercayaan yang tinggi dan dapat diterima sebagai batas kuantitasi jika memenuhi kondisi sebagai berikut : Respon analit pada LLOQ harus paling sedikit 5 kali respon blanko. Area analit (respon) harus dapat diidentifikasi, diskrit, dan terulang dengan presisi 20 % dan akurasi 80-120%. Model yang digunakan untuk menggambarkan

hubungan antara respon dan konsentrasi haruslah model yang paling sederhana. Pemilihan bobot dan penggunaan

persamaan regresi yang kompleks harus dapat ditepatkan. Kondisi berikut harus dipenuhi dalam mengembangkan sebuah Kurva Kalibrasi : 20% deviasi dari nominal konsentrasi LLOQ. 15% standar deviasi selain dari nominal konsentrasi LLOQ. Setidaknya empat dari enam standar bukan nol harus memenuhi kriteria di atas, termasuk LLOQ dan Kurva Kalibrasi Standar pada konsentrasi tertinggi. f. Stabilitas Stabilitas obat dalam suatu cairan biologis adalah fungsi dari kondisi penyimpanan, sifat-sifat kimia obat, dan matriks. Prosedur stabilitas harus mengevaluasi stabilitas analit selama pengumpulan dan penanganan sampel, setelah penyimpanan jangka panjang (beku pada suhu penyimpanan yang digunakan) dan jangka pendek (suhu kamar, 20-28 C), dan setelah melalui

26

siklus pembekuan dan pencairan, kemudian proses stabilitas harus mengevaluasi stabilitas analit selama pengumpulan dan

penanganan sampel. Ketentuan yang digunakan dalam pengujian stabilitas harus mencerminkan situasi yang harus dihadapi selama penanganan sampel sebenarnya dan pada analisis sampel. Prosedur juga harus mencakup pengujian stabilitas analit dalam larutan stok. Semua penentuan stabilitas harus

menggunakan seperangkat sampel yang disiapkan dari larutan stok yang baru dibuat dalam matriks biologi yang bebas dari analit dan pengotor. Larutan stok analit untuk pengujian stabilitas harus

disiapkan dalam suatu pelarut yang sesuai pada konsentrasi yang telah diketahui. Stabilitas juga dibagi menjadi 5 bagian, yaitu : 1) Stabilitas Pencairan dan Pembekuan (Freeze and Thaw Stability) Stabilitas analit harus ditentukan setelah tiga siklus pembekuan dan pencairan. Setidaknya tiga alikuot pada tiap konsentrasi (Rendah dan Tinggi) harus disimpan pada suhu penyimpanan yang digunakan slama 24 jam dan dicairkan tanpa bantuan pada suhu kamar. Ketika benar-benar cair,

sampel harus dibekukan kembali selama 12 sampai 24 jam pada kondisi yang sama. Siklus pencairan dan pembekuan harus diulang dua kali lagi, lalu dianalisis pada siklus ketiga. Jika analit tidak stabil pada suhu penyimpanan yang digunakan, sampel stabilitas harus dibekukan pada -200C selama tiga siklus pembekuan dan pencairan atau

disesuaikan dengan kestabilan zat tersebut. 2) Stabilitas Suhu Jangka Pendek Tiga alikuot dari tiap konsentrasi (Rendah dan Tinggi) harus dicairkan pada suhu kamar dan disimpan pada suhu tersebut selama 4-24 jam (berdasarkan durasi yang

diharapkan dimana sampel akan dipertahankan pada suhu kamar dalam studi yang dituju) dan dianalisa.

27

3) Stabilitas Jangka Panjang Waktu penyimpanan jangka panjang harus dalam pengujian stabilitas antara tanggal

melebihi

waktu

pengambilan sampel pertama dan tanggal analisis sampel berakhir. Stabilitas jangka panjang harus ditentukan dengan menyimpan setidaknya tiga alikuot dari masing-masing konsentrasi rendah dan tinggi pada kondisi yang sama dengan sampel studi. Volume sampel harus cukup untuk Konsentrasi dari semua

analisis pada tiga waktu berbeda.

saampel stabilitas harus dibandingkan dengan rata-rata nilai penghitungan kembali untuk standar pada konsentrasi yang sesuai dari hari pertama pengujian Stabiitas Jangka Panjang. 4) Stabilitas Larutan Stok Stabilitas larutan stok obat dan internal standar harus diuji pada suhu ruang setidaknya 6 jam. Jika larutan stok

didinginkan atau dibekukan untuk periode yang berpautan, stabilitas harus didokumentasikan. Setelah menyelesaikan

waktu penyimpanan yang dikehendaki, stabilitas harus diuji dengan membandingkan respon instrumen dengan larutan yang baru dibuat tersebut. 5) Stabilitas Pasca Preparasi Stabilitas Pasca Preparasi diukur untuk

mengantisipasi stabilitas sampel selama proses injeksi di auto sampler. Stabilitas pasca preparasi ditentukan dengan

melakukan pengujian kontrol sampel rendah, sedang, dan tinggi selama periode waktu tertentu yang dibutuhkan oleh satu batch analisis. 7. Teori Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi secara bahasa berasal dari kata chroma dan graphein yang berarti menulis warna. Menurut IUPAC nomenclature,

chromatography is physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase) move in definite direction.

28

Metode analisis kimia secara umum haruslah memiliki sifat selektifitas yang baik dan spesifik. Penghilangan gangguan terhadap

analat merupakan hal yang penting dalam analisis. Sampai pertengahan abad XX, pemisahan dalam analisis dilakukan secara pengendapan, distilasi, dan ekstraksi. Saat ini pemisahan dalam kegiatan analisis

umumnya dilakukan secara kromatografi. Penerapan analisis secara kromatografi telah berkembang pesat dalam kurun waktu lima puluh tahun terakhir untuk dapat menentukan sifat-sifat senyawa dalam campuran kompleks. Peranan yang sangat

berarti dari kromatografi ditunjukkan misalnya dengan hadiah Nobel pada tahun 1952 kepada A.J.P Martin dan R.L.M. Synge, dan sekitar 12 Nobel antara tahun 1937 hingga 1972 yang seluruhnya diberikan atas jasa pengembangan bidang kromatografi. Kromatografi menerapkan prinsip tingkat lanjut dari proses ekstraksi. Ekstraksi adalah suatu metode untuk memisahkan suatu

komponen dalam suatu cairan atau padatan dengan cairan lain yang tidak saling bercampur, sehingga komponen tersebut berpindah ke dalam cairan kedua. Pemisahan dapat terjadi karena adanya perbedaan

kecepatan gerak suatu komponen senyawa dengan senyawa lainnya akibat perbedaan sifat yang dimiliki masing-masing senyawa terhadap fasa diam maupun fasa gerak yang ada dalam sistem kromatografi (Day dan Underwood, 1988). Prinsip KCKT yaitu, dengan bantuan pompa fase gerak dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam fase gerak melalui penyuntikan atau injeksi. Di daam kolom terjadi pemisahan

komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara molekul yang terlarut dalam fase gerak terhadap fase diam maka terjadilah pemisahan. Komponen yang lemah interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu dari kolom. Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor, kemudian akan direkam dalam bentuk kromatogram. a. Mekanisme Pemisahan Mekanisme pemisahan dominan yang terjadi dalam sistem KCKT ditentukan oleh jenis kolom yang digunakan. Terdapat

29

kemungkinan terjadi lebih dari satu proses pemisahan dalam satu kolom. Dibandingkan dengan kromatografi gas, KCKT memiliki

mekanisme pemisahan lebih banyak, terdapat kemudahan untuk mengubah secara radikal sifat kimia dan kekuatan elusi dari fase gerak, fase penunjang dengan ukuran partikel 3, 5 atau 10 m memiliki ukuran pori 50 -150 , dapat diikatkan dengan lapisan sangat tipis bersifat polar atau nonpolar. Mekanisme pemisahan yang mungkin adalah adsorpsi, partisi, penukar ion dan

kromatografi ekslusi. 1) Adsorpsi Kromatografi adsorpsi, sering juga dinyatakan

sebagai kromatografi padat-cair atau kromatografi fase normal. Istilah fase normal menunjukkan digunakannya fase diam polar dengan fase gerak nonpolar. Sebagai fase diam digunakan adsorben berpori yang pada sisi-sisinya memiliki gugusan hidroksil baik yang bebas atau berikatan. Gugusan tersebut akan menjadi sisi aktif yang menyebabkan interaksi di permukaan terhadap molekul terlarut dalam fase gerak. Fase gerak yang digunakan berupa pelarut nonpolar, misalnya heksan yang dimodifikasi polaritasnya dengan mencampurkan sejumlah kecil pelarut polar seperti 2propanol, diklorometana atau metil tersierbutil eter. Saat

sampel dimasukan ke dalam kolom, molekul dengan gugus fungsi yang bersifat polar akan tertarik oleh sisi aktif fase diam, kemudian digantikan oleh molekul polar dari fase gerak, selanjutnya diadsorp kembali oleh sisi aktif selanjutnya hingga keluar dari kolom. Molekul yang lebih polar akan diadsorp lebih kuat dibandingkan molekul yang kurang polar sehingga terelusi lebih lama. 2) Fase Terikat Kromatografi fase terikat dapat digunakan untuk sistem kromatografi fase normal atau fase terbalik. Pada

sistem fase terbalik, fase diam yang digunakan bersifat

30

nonpolar sedangkan fase gerak polar digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom. Sistem fase terbalik pada awalnya berupa fase penunjang yang disalut dengan lapisan tipis fase diam, terikat secara fisika. Hal ini akan menyebabkan fase diam akan

mudah terbawa oleh aliran fase gerak dan sangat rentan oleh proses hidrolisis. Sistem ini kemudian dikembangkan dengan mengikatkan secara kimia gugus tertentu pada permukaan fase penunjang. Senyawa yang paling umum digunakan

sebagai fase diam adalah oktadekilsilan (octadecylsilane, ODS), merupakan senyawa hidrokarbon, berupa cairan. Fase diam ini biasanya diikatkan pada fase penunjang silika dengan membentuk ikatan silileter atau ikatan siloksan. Sistem fase normal diperoleh dengan mengikatkan gugus nitril, nitro atau amino pada ujung fase penunjang. Keuntungan dari fase terikat dibandingkan sistem adsorpsi adalah kemungkinan dilakukannya elusi gradien. biasanya dilakukan menggunakan pelarut yang Elusi relatif

nonpolar seperti tetrahidrofuran (THF), dietileter, kloroform dan heksana. 3) Penukar Ion Kromatografi penukan ion memanfaatkan perbedaan tingkat afinitas ion-ion dalam larutan terhadap kumpulan ion bermuatan yang terdapat pada kolom. Gugus fungsi alami yang menjadi sisi aktif penukar ion adalah amonium kuartener (-N+R3) untuk anion dan asam sulfonat (-SO3H) untuk kation. Sebagai penunjang sisi aktif digunakan penukar ion yang berasal senyawa berikatan silang dari polistiren, polidekstran, dan silika. Selanjutnya dikembangkan sistem penukar ion

menggunakan partikel yang lebih kecil. Lapisan tipis lateks dijadikan sebagai penukar ion. Media penukar ion seperti ini kemudian disebut sebagai resin penukar ion. Hasil dari

pengembangan ini adalah peningkatan terhadap kemampuan

31

pemisahan, kecepatan, efisiensi dan selektifitas.

Sifat dari

resin dapat diatur dengan melakukan modifikasi terhadap derajat ikatan silang, ukuran dan gugus fungsi penukar ionnya. 4) Ekslusi Kromatografi ekslusi dikenal juga dengan sebutan kromatografi gel, filtrasi gel atau permeasi gel. Mekanisme pemisahan terjadi berdasarkan pemilihan ukuran partikel molekul. Molekul akan terdifusi dalam pori dengan ukuran

tertentu. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori akan masuk dan mengalami pemisahan berdasarkan ukurannya. Material yang digunakan dalam kromatografi ekslusi pada awalnya adalah dekstran, kopolimer dari

stirenadivinilbenzena.

Keterbatasan terjadi karena mudah

mengembang dan tidak tahan terhadap tekanan tinggi (hanya sampai 300 psi). Dekstran hanya dapat digunakan untuk

larutan yang tidak mengandung air, disebabkan adanya molekul air akan menyebabkan molekul yang akan dipisahkan tidak dapat memasuki sistem kromatografi ekslusi. Untuk

sampel yang mengandung air dapat digunakan kopolimer 2dihidroksietilmetaakrilat, karena bersifat hidrofil. Material yang lebih baik dibuat berbahan dasar silika berpori dengan ukuran pori yang dapat diatur dengan kisaran 4 250 m. Dapat digunakan pada tekanan 3000 hingga 8000 psi, tahan hingga pH 10, kecepatan alir bisa ditinggikan, dan yang paling menguntungkan adalah dapat digunakan untuk memisahkan molekul yang larut dalam air atau dalam pelarut organik.

32

b. Instrumentasi KCKT

Gambar 6 Instrumentasi KCKT

Kecepatan alir yang cukup diperlukan dalam setiap sistem kromatografi kolom. m, penggunaan Untuk merealisasikan keadaan ini dalam pompa tekanan tinggi mutlak diperlukan. sistem KCKT yang menggunakan ukuran diameter partikel 2 10

Keadaan inilah yang menyebabkan instrumen KCKT, menjadi lebih kompleks dan tentunya lebih mahal dari sistem kromatografi yang lainnya. Berikut digambarkan skema dari sebuah instrumen KCKT. 1) Tampungan Fasa Gerak Peralatan KCKT mutakhir dilengkapi dengan satu atau beberapa tampungan berbahan gelas atau stainless steel dengan ukuran mulai 200 sampai 1000 mL. Peralatan

degasser disertakan untuk menghilangkan gas terlarut berupa oksigen atau nitrogen yang akan mempengaruhi dengan membentuk gelembung pada kolom dan detektor. Degasser dapat berupa pompa vakum, sistem destilasi, peralatan pemanas dan pengaduk atau sistem pengusiran

menggunakan gas mulia. Pemisahan yang menggunakan satu jenis pelarut dalam keadaan konstan dinamakan elusi isokratik. Seringkali efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan elusi gradien. Berbeda dengan sistem isokratik, pada elusi gradien terdapat

33

2 atau 3 sistem pelarut yang berbeda, yang akan mengalami perubahan komposisi dalam urutan deret berdasarkan waktu. 2) Sistem Pemompaan Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan : Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi Keluaran yang bebas denyut Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 10 mL/menit Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan relatif yang baik (kesalahan < 0,5%) Tahan terhadap korosi Terdapat tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT, yaitu : a) Pompa Reciprocating Pompa reciprocating adalah jenis pompa yang paling banyak digunakan. Sekitar 90% peralatan

komersial menggunakan pompa jenis ini. Pada pompa jenis ini, larutan dipompakan dengan gerakan maju mundur piston yang digerakkan oleh motor penggerak. Terdapat dua buah bola yang berperan sebagai katup pembuka dan penutup, yang mengontrol keluar

masuknya solven dalam tabung pompa.

Gambar 7 Bagan Pompa Reciprocating

34

Kelemahan pompa adalah masih dihasilkannya denyut yang harus diredam dengan pengaturan baseline pada kromatogram. Kelebihan pompa jenis ini adalah volum internalnya kecil (35 400 L), tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan solven. b) Pompa Sistem penggantian (displacement pump) Sistem penggantian menggunakan sebuah

wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang

bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa terbatas hanya 250 mL dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.

Gambar 8 Bagan Pompa Sistem Pergantian c) Pompa Tekanan Udara (Pneumatic Pump) Bentuk paling sederhana sebuah pompa tekanan udara merupakan wadah yang ditekan oleh gas

bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini. Kekurangannya

terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 5000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi gradien.

35

Gambar 9 Bagan Pompa Tekanan Udara

3) Injeksi Sampel Sistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari sistem kromatografi cair. Masalah ini dapat menyebabkan

pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan kapasitas. Sebagai akibatnya, volum injeksi harus dibatasi hingga kisaran maksimum 500 L. Terdapat beberapa metode yang digunakan untuk menginjeksikan sampel ke dalam kolom yang dapat dibagi menjadi, injeksi menggunakan syringe (syiringe injection), injeksi aliran terhenti (stopped flow injection) dan injeksi menggunakan katup (valve injection). a) Injeksi menggunakan katup Merupakan metode injeksi yang paling diterima dan umum digunakan pada saat ini. Pemasukan sampel ke dalam aliran fase gerak berlangsung dengan cepat, aliran fase gerak tidak perlu dihentikan, mudah

digunakan, dapat disesuaikan untuk injeksi otomatis, dapat digunakan pada tekanan hingga 6000 psi. Katup enam jalur digunakan berpasangan dengan loop sampel. Pada saat posisi pengambilan (charge), katup terpisah dari jalur aliran fase gerak, tidak terjadi tekanan

36

sehingga loop dapat diisi dengan sampel.

Dengan

memutar rotor pada posisi injeksi (inject), loop yang telah diisi dengan sampel akan berhubungan dengan aliran fase gerak dari kolom, sehingga sampel akan terbawa ke dalam kolom. Katup injeksi yang dipasarkan oleh Valco dan Rheodine, memiliki loop untuk sampel diluar rotor sehingga dapat dengan mudah diganti sesuai dengan volum injeksi yang diinginkan. b) Injeksi menggunakan syringe Merupakan metode awal yang digunakan untuk memasukan sampel ke dalam kolom. Diadaptasi dari

proses injeksi sampel dalam kromatografi gas. Sampel diinjeksikan melalui sebuah penyegel septum. c) Injeksi pada kolom (on column injection) Metode injeksi ini disebut juga metode injeksi aliran terhenti (stopped flow injection). Menggunakan

metode ini, pompa dimatikan, kemudian katup injeksi dibuka, sampel diinjeksikan pada injector yang tidak memiliki septum, pompa dinyalakan lagi, aliran fase gerak kembali seperti pada pengaturan awal. Sistem ini tidak menyebabkan kerugian dalam hal akurasi. Hanya saja, keterulangan waktu retensi akan sulit untuk memberikan hasil yang memuaskan. 4) Kolom KCKT Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain.

37

Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran partikel 5 10 m. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000 plat/meternya. Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan dan kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran partikel 3 5 m. Beberapa jenis kolom

memiliki jumlah plat hingga 100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi

(chromatography grade). Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 m. Lapisan tipis berpori silika, alumina, atau resin sintetis divinil benzen polystirena dengan melapiskan penukar ion pada permukaannya. Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 10 m terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap permukaannya. 5) Detektor Detektor ideal pada sistem KCKT memenuhi

persyaratan berikut: Memiliki sensitivitas yang memadai. Kisaran umum sensitivitas berkisar dari 10-8 hingga 10-15 gram zat terlarut per pembacaan. Stabil dan memiliki keterulangan yang baik. Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi.

38

 Waktu respon yang singkat. Kemudahan pada penggunaan. Memiliki volum internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak. Berikut merupakan beberapa jenis detektor dapat digunakan pada sistem KCKT : a) Detektor Absorban Detektor Absorban Untuk meminimalkan

pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volum yang sekecil mungkin. Ukuran volum dibatasi 1 10 L dengan panjang sel 2 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan diperlukan sebelum aliran memasuki detektor. Transducer fotolistrik yang sesuai dipasangkan untuk mengukur intensitas serapan. Detektor phototube, photo multiplier tube (PMT) atau dioda peka cahaya dapat digunakan untuk mengukur nilai absorban. Cahaya

transmisi yang sampai pada detektor akan diubah menjadi sinyal listrik yang selanjutnya diproses menjadi data yang dapat diinterpretasikan. Detektor absorban yang lebih maju adalah Photo Diode Array (PDA). Secara fisik, PDA terdiri dari susunan 128, 1024 hingga 4096 deretan dioda peka cahaya. Detektor ini sangat sesuai digunakan untuk membaca seluruh spektrum cahaya UV-Visibel secara simultan. Penggunaan detektor PDA akan meningkatkan kemampuan deteksi instrumen sampai pada tahapan pendeteksian secara simultan pada berbagai panjang gelombang. b) Detektor Fluorescens Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluorofotometer.

39

Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu xenon

digunakan pada instrumen yang lebih baik dengan grating sebagai monokromatornya. Sensitifitas detektor fluorescens lebih baik

dibandingkan dengan detektor absorban. Keterbatasan yang dimiliki adalah tidak semua senyawa memberikan gejala fluoresensi saat dieksitasi oleh cahaya.

Pembacaan respon didasarkan pada intensitas sinar emisi yang disebabkan oleh gejala fluoresensi. Hal inilah yang menyebabkan detektor diletakan dengan sudut 90 terhadap sinar transmisi dari sel pembacaan. c) Detektor Indeks Bias Detektor jenis ini bersifat universal dan tidak merusak komponen sampel. Pada praktiknya, detektor ini tidak banyak digunakan dalam analisis secara KCKT dikarenakan sensitifitas yang rendah, rentan terhadap perubahan suhu dan tidak dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien. Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel detektor dibagi menjadi dua bagian, sel pembanding dan sel sampel. Dalam keadaan kedua sel hanya berisi fase

gerak yang sama, kromatogram hanya menunjukkan baseline yang datar. Ketika sampel masuk ke sel sampel akan terjadi perbedaan indeks bias antara sel

pembanding dan sel sampel.

Keadaan ini akan

diterjemahkan oleh detektor sebagai kenaikan atau penurunan indeks bias. Kromatogram detektor indeks bias dapat berupa puncak negatif atau pun puncak positif tergantung nilai indeks bias sampel.

40

d) Detektor Elektrokimia Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk

kromatogram. Contoh penggunaan detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida. e) Detektor Spektra Massa Penggabungan sistem KCKT dengan detektor spektra massa menghasilkan sebuah instrumen baru yang dinamakan Liquid Chromatography-Mass Spectra (LC-MS). Sistem ini memerlukan modifikasi sedemikian rupa, sehingga hasil pemisahan komponen dari kolom dapat masuk dan dipisahkan berdasarkan kerja

spektrometri massa. Sejumlah dimasukkan ke fraksi dalam kecil cairan dari massa kolom pada

spektrometer

kecepatan alir 10 50 L per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan, dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa. Diagram spektrum massa secara kualitatif, terdiri dari absis yang menyatakan massa fragmen bermuatan dan ordinat yang menyatakan fluktuasi sinyal alat pengukur. Dalam spektrometer massa masing-masing

kation atau kation radikal yang terbentuk dipisah dan dicatat menurut fragmen. Massa dinyatakan dalam satu satuan massa (dalton) sesuai 1/12 massa atom karbon
12

C. Detektor Spektra Massa banyak digunakan

dalam penentuan rumus struktur suatu senyawa dengan disertai data pembacaan dari spektrofotometer Infra Red, H dan C NMR, dan spektrum UV-Visibel dari senyawa.

41

6) Recorder Recorder/Data Prosesor/Pencatat adalah alat

pencatat hasil pemisahan komponen-komponen zat yang dianalisis. Alat pencatat data harus dapat mencatat puncakpuncak yang tajam yang dipisahkan dengan cepat, tidak dipengaruhi oleh gangguan (noise) dan aliran listrik (Ismail, E. Krisnandi, 2010; 15-27)

B. Metode Analisis
1. Dasar Semua metode analisis harus divalidasi untuk memastikan bahwa metode yang digunakan valid dan akan selalu memberikan hasil sesuai yang diharapkan secara konsisten. Validasi metode bioanalisis mencakup semua prosedur yang membuktikan bahwa metode khusus untuk pengukuran kuantitatif analit pada matriks biologis seperti plasma, darah, serum, atau urin dapat dipercaya dan memiliki ketertiruan untuk penggunaan yang dimaksud. Parameter dasar yang dilakukan pada

validasi ini mencakup Akurasi (Accuracy), Presisi (Precision), Selektivitas (Selectivity), Limit Kuantisasi (Limit of Quantification), Stabilitas (Stability), Efek Pengenceran (Dilution Effect), dan Perolehan Kembali (Recovery). Pyrazinamide merupakan suatu senyawa organik yang bersifat polar, sehingga dapat dipisahkan menggunakan HPLC-UV berdasarkan sifat kepolarannya. Pyrazinamide dalam plasma darah akan terdapat berikatan dengan protein plasma membentuk ikatan obat protein. Untuk

memperoleh sampel yang dapat dibaca secara HPLC, maka perlu dilakukan pemisahan protein dengan cara presipitasi protein

menggunakan asetonitril.

Selanjutnya dilakukan preparasi terhadap

sampel dengan menguapkan pengendap protein dan pelarutan kembali residu dengan menggunakan metanol:air (1:1). Dalam preparasi sampel tersebut ditambahkan internal standar Methyl prednilosone 150 ppm sebagai faktor koreksi selama proses preparasi yang ditambahkan

42

sebelum

dilakukan

pengendapan

protein.

Kisaran

kerja

linier

Pyrazinamide yang digunakan pada analisis ini adalah 0-30.000 ppm. Sampel yang telah selesai dipreparasi dapat diinjeksikan ke alat KCKT. Mekanisme pemisahan yang terjadi adalah pompa dapa alat

KCKT membantu fase gerak cair membawa cuplikan dari gerbang injeksi ke dalam kolom dan kemudian ke detektor. Di dalam kolom terjadi

pemisahan komponen-komponen campuran berdasarkan perbedaan kekuatan interaksi antara cuplikan dengan fase diam dan fase gerak. Komponen yang berinteraksi lemah dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu dari kolom. Komponen yang keluar dari kolom kemudian dideteksi oleh detektor, dan ditampilkan dalam bentuk kromatogram. 2. Alat dan Bahan a. Alat Neraca Analitik Centrifuge Turbovap Vortex Ultrasonic Degaseer HPLC Water Alliance 2695 Detektor UV 2489 Guard Column C-18 Column C-8 Stopwatch Labu ukur 10 mL Erlenmeyer Piala gelas Gelas ukur Tabung ulir kaca 10 mL Microtube Vial Vial insert Labu Semprot Plastik 500 mL Sudip

43

 Rak Tabung Plastik 50 lubang Micro syringe 10 L Micro syringe 100 L Blue tip Yellow tip Pipet pasteur Delivery pipette Kertas Saring Millipore 0,45 m Pompa vacuum b. Bahan Standar pyrazinamide Standar methyl prednisolone Blanko plasma Air Milli-Q Asetonitril 100% Metanol 10% Natrium Hidroksida Kalium Dihidrogen Posphat 3. Cara Kerja a. Pembuatan Standar Pyrazinamide 500 g/mL 1) Perhatikan kadar zat yang akan diuji dalam CoA standar tersebut untuk penentuan bobot penimbangan. 2) Tentukan faktor kimia sesuai standar zat yang akan diuji untuk perhitungan bobot penimbangan. 3) Timbang standar pyrazinamide dalam weighing boot untuk memperoleh kadar 500 g/ml. Perhitungkan faktor kimia dan faktor kadarnya sesuai dengan CoA. 4) Masukkan standar dalam weighing boot tersebut ke dalam labu volumetrik 5) Semprot weighing boot dengan menggunakan air hingga bersih, lalu ditambahkan air hingga tanda tera.

44

b. Pembuatan Internal Standar Methyl prednisolone 150 g/mL 1) Perhatikan kadar zat yang akan diuji sebagai ISTD dalam CoA standar tersebut untuk penentuan bobot penimbangan. 2) Tentukan faktor kimia sesuai standar zat yang akan diuji untuk perhitungan bobot penimbangan. 3) Timbang standar methyl prednisolone dalam weighing boot untuk memperoleh kadar 150 g/ml. Perhitungkan faktor kimia dan faktor kadarnya sesuai dengan CoA. 4) Masukkan standar dalam weighing boot tersebut ke dalam labu volumetrik. 5) Semprot weighing boot dengan menggunakan methanol hingga bersih, lalu ditambahkan methanol hingga tanda tera. c. Persiapan Larutan Uji (Plasma Darah) 1) Sukarelawan yang telah meminum obat, kemudian diambil darahnya pada waktu yang telah ditentukan sebanyak 10 mL ke dalam tabung alat suntik yang telah berisi 0,5 mL larutan EDTA 8%. 2) Campuran darah dan EDTA kemudian dihomogenkan secara perlahan. 3) Campuran darah dan EDTA yang telah homogen kemudian disentrifugal dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. 4) Plasma darah dipisahkan dari endapan serum dan sel darah merah dengan pipet tetes. 5) Plasma yang telah dipipet dimasukkan ke dalam tabung ulir. 6) Plasma yang telah diperoleh, dimasukkan ke dalam lemari pendingin dengan suhu dibawah -200C.

45

d. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Pengawasan Mutu (Quality Control) 1) Disiapkan Larutan Standar Pyrazinamide 500 g/mL dan Larutan Internal Standar 150 g/mL. 2) Dicairkan Plasma Blanko. 3) Dipipet plasma blanko dalam tabung ulir 10 mL dan dibuat deret standar dan pengawasan mutu (Quality Control) seperti pada tebel berikut : Tabel 2 Tabel Pembuatan Kurva Kalibrasi Konsentrasi Nama pyrazinamide (ng/ml)
Blanko Standar 1 Standar 2 Standar 3 Standar 4 Standar 5 Standar 6 QC Low QC Medium QC High 0 500 2000 4000 10000 20000 30000 1500 6000 25000

Spike standar pyrazinamide 500 g/ml (l)

0,0 0,5 2,0 4,0 10,0 20,0 30,0 1,5 6,0 25,0

Blanko plasma (l)

500,0 499,5 498,0 496,0 490,0 480,0 470,0 498,5 494,0 475,0

e. Pengerjaan Analisis 1) Siapkan 500,0 L plasma standar, plasma QC, dan plasma sampel dalam tabung reaksi ulir. 2) Tambahkan 40,0 L ISTD Methyl prednisolone 150,0 g/mL. 3) Tambahkan 1,0 mL asetonitril 4) Vortex selama 1 menit. 5) Centrifuge pada 4500 rpm selama 10 menit. 6) Pipet supernatan ke dalam tabung reaksi baru. 7) Uapkan dengan turbovap (N2) pada suhu 50 oC hingga kering. 8) Larutkan residu dengan 150,0 L methanol : air (1 : 1).

46

9) Vortex selama 30 detik. 10) Pipet larutan ke dalam microtube. 11) Centrifuge pada 14000 rpm selama 5 menit. 12) Pipet larutan ke dalam vial insert. 13) Injeksi ke dalam sistem HPLC-UV. f. Kondisi Lingkungan 1) Kondisi lingkungan pada saat analisis dilakukan pada suhu kamar (20 28 oC) dan pada kelembaban 35 65 %. 2) Kondisi penyimpanan sampel yang akan diuji yaitu dalam freezer pada suhu 3) -20 oC. 4) Kondisi penyimpanan bahan acuan pyrazinamide dan methyl prednisolone dalam lemari pendingin pada suhu 2 8 oC dan terlindung dari cahaya. 5) Kondisi penyimpanan larutan standar pyrazinamide dan methyl prednisolone dalam lemari pendingin pada suhu 2 8 oC dan terlindung dari cahaya

47

g. Kondisi KCKT 1) 2) 3) 4) 5) Volume Injeksi Laju Alir Run Time Deteksi Fasa Gerak : : : : : 20 L 1,0 mL/menit 13 menit UV 261 nm Asetonitril : KH2PO4 10 mM pH 6,0 6) Kolom : Symmetry C8 5m 4,6x150 mm column 7) Guard Column : Symmetry C18 5m 3,9x20 mm guard column 8) 9) Suhu Kolom Seal Wash Solvent : : : 30,0 C Metanol 10 % dalam air

10) Komposisi Gradien

Tabel 3 Komposisi Gradien

No. 1 2 3 4 5 6 Time (min) 4 4,5 10 10,5 12 Flow (ml/min) 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 % Asetonitril 3 3 37,5 37,5 3 3 % KH2PO4 10 mM pH 6.0 97 97 62,5 62,5 97 97 Curve 6 6 6 6 6

48

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Metode analisis pyrazinamide dalam plasma darah manusia ini ttidak dapat langsung digunakan untuk analisis rutin, akan tetapi perlu dibuktikan keabsahan dari metode uji tersebut dengan melakukan validasi metode analisis. Hasil dan Pembahasan tentang Validasi Metode Bioanalisis ini mengacu pada United State Food and Drugs Administration (USFDA) dan European Medicines Agency (EMA). sebagai berikut : Hasil keseluruhan Validasi Metode Analisis

Pyrazinamide dalam Plasma Darah menggunakan HPLC-UV akan dijelaskan

A. Kurva Kalibrasi Standar (Standard Calibration Curve)

1. Kurva Kalibrasi (Calibration Curve) Larutan standar yang ditimbang dengan ukuran tertentu kemudian dilarutkan ke dalam air bertujuan untuk membuatn larutan standar 506,86 g/mL. Larutan tersebut kemudian digunakan untuk

membuat kurva kalibrasi dengan konsentrasi sebagai berikut : 0 ng/mL; 506,86 ng/mL; 2027,44 ng/mL; 4054,88 ng/mL; 10137,20 ng/mL; 20274,39 ng/mL; dan 30411,59 ng/mL, yang kemudian dipreparasi seperti metode kerja yang telah disebutkan pada bab sebelumnya. Kurva kalibrasi stadar diuji dengan melakukan pengukuran terhadap kurva kalibrasi (deret standar) dan sampel pengawasan mutu (quality control/QC) dengan beberapa kali pengulangan. Kurva kalibrasi dibuat dengan persamaan regresi linear y = Ax + B (dengan x adalah konsentrasi pyrazinamide dan y adalah rasio perbandingan luas area dari pyrazinamide terhadap internal standar, methyl prednisolone).

Perbedaan konsentrasi sebenarnya dibandingkan dengan konsentrasi hasil analisis harus sebesar 15%.

49

2. Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control Samples) Larutan standar pyrazinamide 508,37 g/mL yang telah dibuat dimasukkan dengan ukuran tertentu yang sebelumnya telah ditambahkan sejumlah plasma blanko dengan konsentrasi sebagai berikut : 1525,12 ng/mL (rendah); 6100,49 ng/mL (sedang); dan 25418,72 ng/mL (tinggi). Larutan tersebut kemudian dipreparasi bersamaan dengan larutan deret kurva kalibrasi. Perbedaan konsentrasi sebenarnya dibandingkan

dengan konsentrasi hasil analisis harus sebesar 15%. Kurva kalibrasi standar memiliki persamaan regresi sebagai berikut : y = 0,0001x 0,0098 sebagai hasil perhitungan kemiringan (slope) dan perpotongan (intercept). Tabel 4 Kurva Kalibrasi Standar
Hari 0,00 506,86 2027,44 4054,88 Konsentrasi (ng/mL) 10137,20 20274,39 30411,59 1525,12 6100,49 25418,72

Perbandingan Luas Area Pyrazinamide Terhadap Methyl prednisolone 1 2 3 4 5 Rata-rata SD 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0510 0.0628 0,0709 0,0626 0,0533 0,0601 0,0081 0,2393 0,2483 0,2979 0,3044 0,2503 0,2680 0,0306 0,5918 0,4566 0,5206 0,4594 0,4741 0,5005 0,0571 1,2336 1,2078 1,3520 1,3786 1,2271 1,2798 0,0791 2,6058 2,3616 2,6895 2,8504 2,5569 2,6128 0,1793 4,0513 3,6135 4,1277 4,1085 3,6614 3,9125 0,2532 0,1948 0,1973 0,2140 0,2138 0,1962 0,2032 0,0098 0,7956 0,7141 0,8118 0,8264 0,7392 0,7774 0,0484 3,1988 2.9989 3,3937 3,5689 3,0763 3,2473 0,2335

a. Linearitas Linearitas kurva kalibrasi standar diuji dengan menghitung kelinearan koefisien korelasi dari kurva. Regresi yang digunakan untuk menghitung fungsi kalibrasi harus memiliki koefisien korelasi (r) 0,990. Jika selain itu maka kurva kalibrasi tidak diterima. Linearitas kurva kalibrasi standar ditunjukan oleh koefisien korelasi linear (r) sebesar 0,9999 (Gambar 10).

50

Calibration Curve of Pyrazinamide

4,5

Ratio of pyrazinamide to Methylprednisolone

3,5 3

f(x) = 0,0001x - 0,0098 R = 0,9999

2,5 2

1,5 1

0,5 0 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

Concentration of Pyrazinamide (ng/ml)

Gambar 10 Linearitas Kurva Kalibrasi b. Batas Terendah Kuantifikasi (Lower Limit of

Quantification/LLOQ) Batas konsentrasi terendah dari suatu zat uji dimana hasil uji reliabilitas dapat dipastikan atau ditentukan. Standar terendah diukur masing-masing sebanyak lima kali pengulangan pada penetapan yang sama. Batas kuantifikasi adalah konsentrasi

terendah dimana nilai-nilai yang diperoleh harus berada pada rentang 20,00% dari nilai sebenarnya dan ketertiruan

(reproducibility) berada pada rentang 20,00% dari nilai koefisien variasi (CV). Tabel 5 Batas Terendah Kuantifikasi/LLOQ
Konsentrasi Perlakuan Sebenarnya (ng/mL) Konsentrasi yang Terukur (ng/mL) 572,03 567,57 Standar 1 506,04 565,50 574,00 574,60 570,74 4,02 0,70 565,5 - 574,60 11,75% - 13,55% % diff 20,00% CV 20,00% Konsentrasi Rata-rata SD CV (%) Rentang (% diff) Standar

51

Nilai koefisien variasi dari standar terendah (standar 1) yang diukur dengan 5 pengulangan sebesar 0,70% dan rentang % diff sebesar 11,75% sampai 13,55%. 506,04 ng/mL. Maka, dapat disimpulkan

batas kuantifikasi untuk prosedur ini terletak pada konsentrasi

B. Presisi (Precision)
Presisi diuji dengan menghitung variasi dari nilai yang diukur. Batas penerimaan untuk koefisien variasi (CV) ialah 15% untuk konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi. 1. Pengujian Presisi pada Hari yang Sama (Intra-Assay Precision Within-Day Variation) Tiga konsentrasi dari sampel yang diuji (rendah, sedang, dan tinggi), masing-masing diukur sebanyak lima kali pengulangan dalam penetapan yang sama. Kemudian nilai koefisien variasi (CV) dihitung. Metode analisis dianggap presisi jika hasil pengulangan tiap konsentrasi memiliki koefisien variasi 15,00%. Pengujian presisi pada hari yang sama dapat dilihat di Tabel 6. Tabel 6 Pengujian Presisi Pada Hari yang Sama
Nilai Sebenarnya (ng/mL) Rendah 1525,12 Nilai yang Terukur (ng/mL) 1709,59 1703,97 1748,72 1725,80 1656,26 5423,83 5356,20 6197,12 6642,09 6507,13 21936,98 21853,62 23184,29 23590,79 24362,01 Nilai Ratarata SD CV (%) Rentang (% diff) Standar

1708,87

34,16

2,00

1656,26 - 1748,72 8,60% - 14,66%

Sedang 6100,49

6025,28

602,41

10,00

5356,20 - 6642,09 -12,20% - 8,88%

CV 15,00%

Tinggi 25418,72

22985,54

1081,81

4,71

21853,62 24362,01 -14,03% - (-4,16%)

Nilai koefisien variasi (CV) dari nilai yang terukur untuk ketiga konsentrasi adalah 2,00% untuk konsentrasi rendah, 10,00% untuk konsentrasi sedang, dan 4,71% untuk konsentrasi tinggi. Hasil tersebut memenuhi standar USFDA.

52

2. Pengujian Presisi Pada Hari yang Berbeda (Inter-Assay Precision Day-to-Day Variation) Tiga konsentrasi dari sampel yang diuji (rendah, sedang, dan tinggi), masing-masing diukur sebanyak lima kali pengulangan dalam lima hari yang berbeda. Kemudian nilai koefisien variasi (CV) dihitung.

Metode analisis dianggap presisi jika hasil pengulangan tiap konsentrasi memiliki koefisien variasi 15,00%. Pengujian presisi pada hari yang berbeda dapat dilihat di Tabel 7. Tabel 7 Pengujian Presisi Pada Hari yang Berbeda
Nilai Hari Sebenarnya (ng/mL) 1 2 Rendah 3 1525.12 4 5 1 2 Sedang 3 6100.49 4 5 1 2 Tinggi 3 25418,72 4 5 Nilai yang Terukur 1 2 3 4 5 1709,59 1703,97 1748,72 1725,80 1656,26 1461,37 1606,65 1619,95 1589,86 1704,11 1712.35 1653.86 1719.15 1632.59 1679.33 1747.82 1733.90 1737.74 1675.39 1655.44 1655.75 1732.55 1614.10 1746.40 1712.21 5423.83 5356.20 6197.12 6642.09 6507.13 5772.10 5953.88 6226.07 6071.90 5898.14 5638.27 5613.77 5835.83 5420.33 6063.02 6499.88 6123.26 6270.54 6614.75 6425.74 6063.38 6341.02 6620.85 6471.37 6496.06 21936.98 21853.62 23184.29 23590.79 24362.01 26635.21 26226.92 24048.39 25380.92 24138.68 28962.88 25160.97 24363.78 25153.48 25196.97 26886.49 26125.40 26295.09 26434.79 26298.94 25210.23 24648.87 28427.00 26431.49 27147.71 Hari ke Hari Rata-rata SD CV(%) (% diff) 1461.37 - 1748.72 -4.18% - 14.66% Standar

1677.39

65.91

3.93

6101.86

399.71

6.55

5356.20 - 6642.09 %diff -12.20% - 8.88% -15,00% hingga 15,00%

25364.08 1739.84

6.86

21853.62 - 28962.88 -14.03% - 13.94%

Nilai koefisien variasi (CV) dari nilai yang terukur untuk ketiga konsentrasi adalah 3,93% untuk konsentrasi rendah, 6,55% untuk konsentrasi sedang, dan 6,86% untuk konsentrasi tinggi. Hasil tersebut memenuhi standar USFDA.

C. Akurasi (Accuracy)
Akurasi diuji dengan menghitung nilai beda antara nilai yang diukur dengan nilai yang sebenarnya. Metode analisis dianggap akurat jika sesui dengan kriteria USFDA yaitu persen different antara kadar terukur dengan kadar sebenarnya -15,00 % s.d 15,00%. 1. Pengujian Akurasi pada Hari yang Sama (Intra-Assay Accuracy Within-Day Variation) Tiga konsentrasi dari sampel yang diuji (rendah, sedang, dan tinggi), masing-masing diukur sebanyak lima kali pengulangan dalam

53

penetapan yang sama. Kemudian nilai beda antra nilai yang diukur dengan nilai sebenarnya (% diff) dihitung. Tabel 8 Pengujian Akurasi Pada Hari yang Sama
Nilai Sebenarnya (ng/mL) Rendah 1525,12 Nilai yang Terukur (ng/mL) 1709,59 1703,97 1748,72 1725,80 1656,26 5423,83 5356,20 6197,12 6642,09 6507,13 21936,98 21853,62 23184,29 23590,79 24362,01 Nilai Ratarata SD CV (%) Rentang (% diff) Standar

1708,87

34,16

2,00

1656,26 - 1748,72 8,60% - 14,66%

Sedang 6100,49

6025,28

602,41

10,00

5356,20 - 6642,09 -12,20% - 8,88%

% diff 15,00%

Tinggi 25418,72

22985,54

1081,81

4,71

21853,62 24362,01 -14,03% - (-4,16%)

Nilai pengujian akurasi ditunjukkan oleh beda nilai antara nilai yang diukur dengan nilai sebenarnya (% diff) untuk tiga konsentrasi sampel yang diuji (rendah, sedang, dan tinggi) memiliki rentang 8,60% hingga 14,66% untuk konsentrasi rendah, -12,20% hingga 8,88% untuk konsentrasi sedang, dan -14,03% hingga -4,16% untuk konsentrasi tinggi. Ketiga hasil tersebut memenuhi standar USFDA. 2. Pengujian Akurasi pada Hari yang Berbeda (Intra-Assay Accuracy Day-to-Day Variation) Tiga konsentrasi dari sampel yang diuji (rendah, sedang, dan tinggi), masing-masing diukur sebanyak lima kali pengulangan dalam lima hari yang berbeda. Kemudian nilai beda antra nilai yang diukur dengan nilai sebenarnya (% diff) dihitung. Tabel 9 Pengujian Akurasi Pada Hari yang Berbeda
Nilai Hari Sebenarnya (ng/mL) 1 2 Rendah 3 1525.12 4 5 1 2 Sedang 3 6100.49 4 5 1 2 Tinggi 3 25418,72 4 5 Nilai yang Terukur 1 2 3 4 5 1709,59 1703,97 1748,72 1725,80 1656,26 1461,37 1606,65 1619,95 1589,86 1704,11 1712.35 1653.86 1719.15 1632.59 1679.33 1747.82 1733.90 1737.74 1675.39 1655.44 1655.75 1732.55 1614.10 1746.40 1712.21 5423.83 5356.20 6197.12 6642.09 6507.13 5772.10 5953.88 6226.07 6071.90 5898.14 5638.27 5613.77 5835.83 5420.33 6063.02 6499.88 6123.26 6270.54 6614.75 6425.74 6063.38 6341.02 6620.85 6471.37 6496.06 21936.98 21853.62 23184.29 23590.79 24362.01 26635.21 26226.92 24048.39 25380.92 24138.68 28962.88 25160.97 24363.78 25153.48 25196.97 26886.49 26125.40 26295.09 26434.79 26298.94 25210.23 24648.87 28427.00 26431.49 27147.71 Hari ke Hari Rata-rata SD CV(%) (% diff) 1461.37 - 1748.72 -4.18% - 14.66% Standar

1677.39

65.91

3.93

6101.86

399.71

6.55

5356.20 - 6642.09 %diff -12.20% - 8.88% -15,00% hingga 15,00%

25364.08 1739.84

6.86

21853.62 - 28962.88 -14.03% - 13.94%

54

Nilai pengujian akurasi ditunjukkan oleh beda nilai antara nilai yang diukur dengan nilai sebenarnya (% diff) untuk tiga konsentrasi sampel yang diuji (rendah, sedang, dan tinggi) memiliki rentang -4,18% hingga 14,66% untuk konsentrasi rendah, -12,20% hingga 8,88% untuk konsentrasi sedang, dan -14,03% hingga 13,94% untuk konsentrasi tinggi. Ketiga hasil tersebut memenuhi standar USFDA.

D. Selektifitas (Selectivity)
Selektifitas dilakukan dengan menetapkan konsentrasi terendah dari sampel yang diuji dalam enam plasma blanko berbeda. Kemudian dihitung nilai persen different. Batas penerimaan persen different untuk analit ialah 20,00% s/d 20,00% dan untuk internal standar ialah -5,00% dan 5,00%. Blanko dari enam jenis plasma darah tersebut juga diukur dan dapat diterima jika tidak ada respon yang bermakna. Uji ini dibagi menjadi 2 bagian, yaitu selektifitas analit dan selektifitas internal standar. Berikut merupakan hasil uji selektifitas : 1. Selektifitas Analit (Selectivity of Analyte) Uji ini dilakukan dengan menetapkan konsentrasi terendah pada batas LLOQ, dengan pyrazinamide bertindak sebagai analit (yang dianalisis) dan methyl prednisolone bertindak sebagai internal standar.

55

Tabel 10 Pengujian Selektifitas Analit (Pyrazinamide)

Rata-rata Konsentrasi Selektifitas Pyrazinamide (ng/mL) Rasio Pyrazinamide terhadap Methyl prednisolone Blanko + A ISTD Standar 1 Blanko + B ISTD Standar 1 Blanko + C ISTD Standar 1 Blanko + D ISTD Standar 1 Blanko + E ISTD Standar 1 Blanko + F ISTD Standar 1 % Diff Rata-rata Rasio (Blank + ISTD terhadap Standar 1) Standar

0,00 506,04 0,00 506,04 0,00 506,04 0,00 506,04 0,00 506,04 0,00 506,04

0,0033 0,0697 0,0045 0,0665 0,0030 0,0827 0,0028 0,0711 0,0039 0,0748 0,0041 0,0773

4,79

6,74

3,65 % diff 20,00% 3,94

5,27

5,31

Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa besarnya perbedaan nilai rata-rata rasio blank + ISTD terhadap Standar 1 memiliki rentang antara 3,65% hingga 6,74%. Metode ini menunjukkan bahwa tidak adanya

pengganggu pada kromatogram. 2. Selektifitas Internal Standar (Selectivity of Internal Standard) Uji ini dilakukan dengan menetapkan konsentrasi terendah pada batas LOQ, dengan methyl prednisolone bertindak sebagai analit (yang dianalisis) dan pyrazinamide bertindak sebagai internal standar.

56

Tabel 11 Pengujian Selektifitas Internal Standar (Methyl prednisolone)

% Diff Rata-rata Konsentrasi Selektifitas Methyl prednisolone (g/mL) Rasio Methyl prednisolone terhadap Pyrazinamide Rata-rata Rasio (Blank + Analit terhadap Internal Standar) Blanko + A Analit ISTD Blanko + B Analit ISTD Blanko + C Analit ISTD Blanko + D Analit ISTD Blanko + E Analit ISTD Blanko + F Analit ISTD 0,00 12,11 0,00 12,11 0,00 12,11 0,00 12,11 0,00 12,11 0,00 12,11 0,0049 0,3028 0,0058 0,2873 0,0076 0,2831 0,0080 0,3034 0,0060 0,2939 0,0029 0,3271 Standar

1,62

2,01

2,70 % diff 5,00% 2,64

2,06

0,89

Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa besarnya perbedaan nilai rata-rata rasio blank + analit terhadap ISTD memiliki rentang antara 0,89% hingga 2,70%. Metode ini menunjukkan bahwa tidak adanya pengganggu pada kromatogram.

E. Perolehan Kembali (Recovery)

Pengujian perolehan kembali (recovery) dilakukan dengan

membandingkan hasil analisis setelah zat uji diekstrak dari plasma blanko

57

dengan nilai sebenarnya (dalam air) pada tiga konsentrasi sampel uji (rendah, sedang, dan tinggi). Batas penerimaan perolehan kembali (recovery) ialah 80%-120%. Berikut adalah hasil uji perolehan kembali/Recovery : Tabel 12 Pengujian Recovery
Konsentrasi (ng/mL) Standar dalam Air (ng/mL) 1632,79 Rendah 1515,92 1515,42 1516,92 1504,68 1509,30 5930,32 Sedang 6063,66 5910,40 5843,89 6181,62 6242,74 25566,08 Tinggi 25265,26 25728,22 26197,70 25631,22 25236,21 Standar dalam Plasma Blanko (ng/mL) 1340,44 1315,48 1315,55 1297,19 1304,98 6269,10 5897,24 6267,83 6361,87 6612,07 26577,92 25373,29 24944,51 25586,52 26034,05 82,10 86,81 86,73 86,21 86,46 105,71 99,78 107,25 102,92 105,92 103,96 98,62 95,22 99,83 103,16 % Recovery 80% - 120% % Recovery Standar

Konsentrasi rata-rata dari standar dalam plasma blanko tidak berbeda signifikan dari nilai yang sebenarnya, dengan range dari 82,10% hingga 86,81% untuk konsentrasi rendah, 99,78% hingga 107,25% untuk konsentrasi sedang, dan 95,22% hingga 103,96% untuk konsentrasi tinggi.

F. Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect)

Konsentrasi tertinggi dari standar kalibrasi diencerkan dengan plasma blanko menjadi dan masing-masing lima kali pengulangan, dan nilai-nilai yang diperoleh dengan mengalikan nilai-nilai yang diuji dari konsentrasi yang

58

diencerkan, lalu dibandingkan dengan nilai yang sebenarnya. penerimaan untuk % diff adalah 15,00%. Tabel 13 Pengujian Pengaruh Pengenceran (Dilution Effect) Nilai yang Perlakuan Terukur (ng/mL) 8489,14 8377,66 Standar 6 8386,52 8065,91 8354,01 14212,96 16940,71 Standar 6 13086,89 16606,06 16814,99 Faktor Pengenceran (x) 33956,57 33510,63 33546,09 32263,65 33416,02 28425,91 33881,41 26173,78 33212,11 33629,97 30362,58 30362,58 Nilai yang Sebenarnya (ng/mL) 11,84 10,37 10,49 6,26 10,06 -6,38 11,59 -13,80 9,39 10,76 %diff

Batas

Standar

% diff 15,00%

Nilai akurasi pengenceran dan dari konsentrasi tertinggi kalibrasi standar memiliki rentang beda nilai secara berurutan yaitu, 6,26% hingga 11,84% dan -13,80% hingga 11,59%. Hal ini menunjukkan bahwa

pengenceran sampel atau dapat dilakukan apabila dibutuhkan.

G. Stabilitas (Stability)
1. Stabilitas Larutan Standar (Stability of The Standard Solution) a. Pada Suhu Kamar Pengujian stabilitas dilakukan dengan menempatkan

larutan stok pada suhu kamar selama 0, 2, 4, dan 6 jam. Kemudian, dengan menggunakan konsentrasi larutan standar dalam pelarut yang sesuai, Pyrazinamide dan konsentrasinya dapat ditetapkan setelah kondisi tersebut.

59

60

Hasil Pengujian dapat dilihat pada Tabel 14 untuk Stabilitas Pyrazinamide dan Tabel 15 untuk Stabilitas Methyl prednisolone (Internal Standar). Tabel 14 Pengujian Stabilitas Pyrazinamide Pada Suhu Ruang Konsentrasi Pyrazinamide 508,61 g/mL Sebelum ditempatkan pada suhu ruang Setelah 2 jam pada suhu ruang Area yang Terukur
12617727 12650853 12639763 12584579 12594652 12575640 12625542 12643164 12646225

% diff

Standar

-0,15 0,12 0,03 -0,41 -0,33

-0,48 -0,08 0,06 0,08 -0,06 0,13 -0,13

% diff 15,00%

Setelah 4 jam Pada suhu ruang

Setelah 6 jam Pada suhu ruang

12628107
12652434 12619953

Tabel 15 Pengujian Stabilitas Methyl prednisolone Pada Suhu Ruang Konsentrasi Methyl prednisolone 150,22 g/mL Sebelum ditempatkan pada suhu ruang Setelah 2 jam pada suhu ruang
2344512 2353206 2350558 2317215 2324719 2326695 2353636 2360581 2351919 -0,21 0,16 0,05 -1,37 -1,05

Area yang Terukur

% diff

Standar

-0,97 0,18 0,47 0,11 0,18 0,52 0,07

% diff 15,00%

Setelah 4 jam Pada suhu ruang

Setelah 6 jam Pada suhu ruang

2353740 2361732 2351099

Hasil penentuan larutan stok setelah menempatkan pada suhu kamar sampai 6 jam berkisar antara -0,48% hingga 0,13% untuk larutan standar (Pyrazinamide) dan -1,37% hingga 0,52% untuk larutan internal standar (Methyl prednisolone) dari kadar sebenarnya. Hal ini menunjukkan baik standar maupun internal standar stabil selama 6 jam pada suhu ruang. b. Pada Kondisi Penyimpanan Pengujian stabilitas dilakukan dengan menyimpan larutan stok pada kondisi penyimpanan (2-80C) selama 0, 7, dan 17 hari untuk standar pyrazinamide dan 0 dan 7 hari untuk internal standar methyl prednisolone. Kemudian konsentrasi pyrazinamide dan

methyl prednisolone ditetapkan secepatnya setelah jangka waktu penyimpanan dicapai. Jika hari yang telah ditentukan dimana sampel uji harus ditentukan jatuh pada hari minggu atau hari libur nasional, maka

61

62

penetapan ditunda hingga hari berikutnya.

Dalam setiap kasus,

pengujian stabilitas dilakukan setelah penyerahan laporan akhir, uji sampel ditentukan pada hari yang dijadwalkan dan laporan akhir diubah sesuai dengan amandemen stabdar operasional prosedur yang tertera. Hasil uji stabilitas pada kondisi penyimpanan dapat dilihat pada Tabel 16 untuk Stabilitas Larutan Standar (Pyrazinamide) dan Tabel 17 untuk Stabilitas Larutan Internal Standar (Methyl prednisolone). Tabel 16 Pengujian Stabilitas Pyrazinamide Pada Kondisi Penyimpanan Konsentrasi Pyrazinamide 508,61 g/mL Sebelum penyimpanan (hari ke-0) Setelah penyimpanan selama 7 hari Setelah penyimpanan selama 17 hari Area yang Terukur
12617727 12650853 12639763 12589347 12645052 12655398 12529114 12537043 12505608

% diff

Standar

-0,15 0,12 0,03 -0,37 0,07 0,15 -0,85 -0,78 -1,03

% diff 15,00%

Tabel 17 Pengujian Stabilitas Methyl prednisolone Pada Kondisi Penyimpanan Konsentrasi Methyl prednisolone 150,22 g/mL Sebelum penyimpanan (hari ke-0) Setelah penyimpanan selama 7 hari
2344512 2353206 2350558 2323792 2358515 2355402

Area yang Terukur

% diff

Standar

-0,21 0,16 0,05

% diff 15,00%

-1,09 0,39 0,25

Hasil penentuan larutan stok untuk standar kerja setelah penyimpana selama 0, 7, dan 17 hari untuk standar pyrazinamide dan 0 dan 7 hari untuk internal standar methyl prednisolone pada suhu 2-80C memiliki % diff dari nilai sebenarnya berturut-turut berkisar antara -1,03% hingga 0,15% dan -1,09% hingga 0,39%. Hal ini mengindikasikan bahwa larutan standar pyrazinamide stabil selama 17 hari dan larutan internal standar methyl prednisolone stabil selama 7 hari. 2. Stabilitas Sampel dalam Plasma (Stability of The Plasma Samples) a. Pada Suhu Ruang Pengujian stabilitas dilakukan dengan menempatkan QC konsentrasi rendah dan tinggi dari sampel uji pada suhu kamar selama 0, 2, 4, dan 6 jam. Kemudian, konsentrasi Pyrazinamide dalam sampel plasma dapat ditentukan setelah kondisi dicapai. Hasil Pengujian dapat dilihat pada Tabel 18 untuk Konsentrasi Rendah dan Tabel 19 untuk Konsentrasi Tinggi.

63

64

Tabel 18 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Rendah Pada Suhu Ruang Konsentrasi Rendah 1515,92 ng/mL Sebelum penyimpanan pada suhu ruang Setelah 2 jam Pada suhu ruang Rasio yang Terukur 0,1988
0,1936 0,2009 0,2095 0,1840 0,1886 0,2122 0,1923 0,1958 0,2039 0,2031 0,2011

% diff

Standar

6,97 4,09 8,17 12,91 -1,22 1,35

% diff 15,00%

Setelah 4 jam Pada suhu ruang

14,39 3,36 5,32 9,82 9,35 8,27

Setelah 6 jam Pada suhu ruang

Tabel 19 PengujianStabilitas Sampel Konsentrasi Tinggi Pada Suhu Ruang Konsentrasi Tinggi 25265,26 ng/mL Sebelum penyimpanan pada suhu ruang Setelah 2 jam Pada suhu ruang Rasio yang Terukur
3,0957 2,9831 2,8470 2,7809 2,8637 3,2398 3,2640 3,2612 3,2277 3,1820 3,0318 3,0929

% diff 2,76 -0,99 -5,51 -7,71 -4,96 7,55

Standar

% diff 15,00%

Setelah 4 jam Pada suhu ruang

8,35 8,26 7,15 5,63 0,63 2,66

Setelah 6 jam Pada suhu ruang

Hasil penetuan sampel uji setelah penyimpanan pada suhu kamar sampai 6 jam, memiliki rentang % diff dari nilai sebenarnya antara -1,22% hingga 14,39% untuk konsentrasi rendah dan -7,71% hingga 8,35% untuk konsentrasi tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa sampel stabil selama 6 jam pada suhu ruang. b. Pada Kondisi Penyimpanan Pengujian stabilitas dilakukan dengan menyimpan larutan QC rendah dan QC tinggi pada kondisi penyimpanan (200C) selama 0 dan 15 hari. Kemudian konsentrasi pyrazinamide

ditetapkan setelah jangka waktu penyimpanan dicapai. Jika hari yang telah ditentukan dimana sampel uji harus ditentukan jatuh pada hari minggu atau hari libur nasional, maka penetapan ditunda hingga hari berikutnya. Dalam setiap kasus,

pengujian stabilitas dilakukan setelah penyerahan laporan akhir, uji sampel ditentukan pada hari yang dijadwalkan dan laporan akhir diubah sesuai dengan amandemen standar operasional prosedur yang tertera. Hasil Pengujian dapat dilihat pada Tabel 20 untuk Konsentrasi Rendah dan Tabel 21 untuk Konsentrasi Tinggi. Tabel 20 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Rendah Pada Kondisi Penyimpanan Konsentrasi Rendah 1525,12 ng/mL Sebelum penyimpanan Hari ke-0 Setelah penyimpanan selama 15 hari Konsentrasi yang Terukur (ng/mL)
1717,04 1643,38 1714,37 1737,12 1730,04 1578,40

% diff

Standar

12,58 7,75 12,41

% diff 15,00%

14,59 14,12 4,12

65

Tabel 21 Pengujian Stabilitas Sampel Konsentrasi Tinggi Pada Kondisi Penyimpanan Konsentrasi Tinggi 1525,12 ng/mL Sebelum penyimpanan Hari ke-0 Setelah penyimpanan selama 15 hari Konsentrasi yang Terukur (ng/mL)
26048,29 23529,87 29020,64 23818,39 26976,81 24641,77

% diff 2,48 -7,43 14,17

Standar

% diff 15,00%

-5,73 6,77 -2,47

Hasil penentuan sampel uji untuk konsentrasi rendah dan tinggi setelah penyimpanan selama 0 dan 15 hari pada suhu 200C yang menunjukan stabilitas yang baik sampai hari ke-15 dengan masing-masing konsentrasi memiliki % diff dari nilai sebenarnya berkisar antara 4,12% hingga 14,59% untuk konsentrasi rendah dan -7,43% hingga 14,17% untuk konsentrasi tinggi. Hal ini menunjukan pyrazinamide stabil dalam plasma pada suhu 200C selama 15 hari. c. Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan (Influences of Freeze and Thaw Cycle) Pengujian parameter ini dilakukan dengan cara

menggunakan sampel QC konsentrasi rendah dan QC konsentrasi tinggi dalam plasma dengan tiga siklus pencairan dan pembekuan. Setiap konsentrasi pada setiap siklus dibuat tiga replikasi. Kemudian pengaruh siklus pembekuan dan pencairan diperiksa. Di bawah ini merupakan hasil pengujian pengaruh siklus pembekuan dan pencairan. Tabel 22 untuk QC konsentrasi rendah dan Tabel 23 untuk QC konsentrasi tinggi.

66

67

Tabel 22 Pengujian Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan Terhadap Sampel Konsentrasi Rendah
QC Rendah 1512,92 ng/mL Nilai yang Terukur (ng/mL) 1562,57 Siklus ke-0 1363,07 1387,75 1598,61 Siklus ke-1 1523,98 1552,84 1727,78 Siklus ke-2 1711,22 1656,04 1552,40 Siklus ke-3 1579,75 1633,16 % diff 3,08 -10,08 -8,45 5,46 0,53 2,44 13,98 12,88 9,24 2,41 4,21 7,73 % diff 15,00% Standar

Tabel 23 Pengujian Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan Terhadap Sampel Konsentrasi Tinggi
QC Tinggi 25265,26 ng/mL Nilai yang Terukur (ng/mL) 22781,48 Siklus ke-0 23075,04 22063,18 24964,28 Siklus ke-1 23701,58 24933,93 25602,09 Siklus ke-2 25362,84 25282,49 24464,23 Siklus ke-3 24225,67 23126,87 % diff -9,83 -8,67 -12,67 -1,19 -6,19 -1,31 1,33 0,39 0,07 -3,17 -4,11 -8,46 % diff 15,00% Standar

Hasil dari penetapan pengaruh siklus pembekuan (200C) dan pencairan (pada suhu ruang) terhadap sampel menunjukkan

nilai yang ditunjukkan oleh nilai akurasi (% diff) sebesar -10,08% hingga 13,98% untuk QC konsentrasi rendah dan -12,67% hingga 1,33% untuk QC konsentrasi tinggi. dan pencairan. d. Stabilitas Pasca Preparasi (Post Preparative Stability) Stabilitas pasca preparasi ditentukan dengan menyimpan QC sampel (rendah, sedang, dan tinggi) di dalam auto sampler selama waktu yang dibutuhkan untuk satu kali pengujian bioanalitik. Kemudian nilai akurasi (% diff) dari sampel uji dihitung. Tabel 24 Pengujian Stabilitas Sampel Pasca Preparasi
Waktu Penyimpanan (Jam) QC Rendah 0 QC Sedang QC Tinggi QC Rendah 6 QC Sedang QC Tinggi QC Rendah 12 QC Sedang QC Tinggi QC Rendah 24 QC Sedang QC Tinggi QC Rendah 36 QC Sedang QC Tinggi QC Rendah 48 QC Sedang QC Tinggi QC sampel Konsentrasi Sebenarnya (ng/mL) 1525,12 6100,49 25418,72 1525,12 6100,49 25418,72 1525,12 6100,49 25418,72 1525,12 6100,49 25418,72 1525,12 6100,49 25418,72 1525,12 6100,49 25418,72 Konsentrasi yang Terukur (ng/mL) 1733,88 5277,29 26239,19 1704,89 5589,21 25745,11 1671,14 5206,11 23343,01 1740,62 6689,54 28025,25 1736,36 6715,77 28533,62 1692,47 6973,08 26037,59 13,69 -13,49 3,23 11,79 -8,38 1,28 9,57 -14,66 -8,17 14,13 9,66 10,25 13,85 10,09 12,25 10,97 14,30 2,43 % diff 15,00% % Diff Standar

Hal ini menunjukkan

pyrazinamide dalam plasma stabil untuk tiga kali siklus pembekuan

68

69

Hasil dari uji stabilitas pasca preparasi dari sampel QC rendah, sedang, dan tinggi untuk penyimpanan selama 48 jam di dalam auto sampler memiliki rentang % diff antara 9,57% hingga 14,13% untuk konsentrasi rendah, -14,66% hingga 14,30% untuk konsentrasi sedang, dan -8,17% hingga 12,25% untuk konsentrasi tinggi dari konsentrasi sebenarnya. Hal ini menunjukkan bahwa

pyrazinamide dalam plasma stabil untuk 48 jam penyimpanan dalam auto sampler.

Berikut merupakan rangkuman parameter uji dalam validasi metode analisis pyrazinamide beserta hasi analisisnya dengan standar mengacu pada United State Food and Drugs Administration (USFDA) dan European Medicines Agency (EMA). Tabel 25 Rangkuman Hasil Validasi Metode Analisis Pyrazinamide
Parameter Uji Validasi Metode Linearitas LLOQ Presisi Pada Hari yang Sama Presisi Presisi Pada Hari yang Berbeda Sampel Uji Standar pada Kurva Kalibrasi Standar 1 QC Rendah QC Sedang QC Tinggi QC Rendah QC Sedang QC Tinggi QC Rendah QC Sedang QC Tinggi QC Rendah QC Sedang QC Tinggi Plasma A Blanko + ISTD Plasma B Plasma C dan Plasma D Plasma E Standar 1 Plasma F Blanko + Analit Internal Standar (Methyl prednisolone) dan ISTD Plasma A Plasma B Plasma C Plasma D Plasma E Hasil Analisis CV % diff (%) 11,75% - 13,55% 0,70 2,00 10,00 4,71 3,93 6,55 6,86 Standar Regresi (r) 0,9999 % diff 20,00% CV (%) 20,00 15,00 Regresi (r) r 0,990 -

8,60% - 14,66% -12,20% - 8,88% -14,03% - (-4,16%) -4,18% - 14,66% -12,20% - 8,88% -14,03% - 13,94% 4,79 6,74 3,65 3,94 5,27 5,31 1,62 2,01 2,70 2,64 2,06

15,00

Akurasi Pada Hari yang Sama Akurasi Akurasi Pada Hari yang Berbeda

15,00%

15,00%

Analit (Pyrazinamide) Selektifitas

20,00%

5,00%

70

Plasma F

0,89 % Recovery 82,10 86,81 86,73 86,21 86,46 105,71 99,78 107,25 102,92 105,92 103,96 98,62 95,22 99,83 103,16 11,84 10,37 10,49 6,26 10,06 -6,38 11,59 -13,80 9,39 10,76 -0,15 0,12 0,03 -0,41 -0,33 -0,48 -0,08 % Recovery

QC Rendah

Recovery

QC Sedang

80% - 120%

QC Tinggi

Standar 6 Dilution Effect Standar 6

15,00%

Stabilitas

Larutan Standar dan Internal Standar

0 Jam Pada Suhu Ruang Standar (Pyrazinamide)

15,00%

2 Jam 4 Jam

71

6 Jam

0 Jam

Internal Standar (Methyl prednisolone)

2 Jam

4 Jam

6 Jam

Hari ke-0 Standar (Pyrazinamide) Pada Suhu Penyimpanan

Hari ke-7

Hari ke-17

Hari ke-0 Internal Standar (Methyl prednisolone)

Hari ke-7

0,06 0,08 -0,06 0,13 -0,13 -0,21 0,16 0,05 -1,37 -1,05 -0,97 0,18 0,47 0,11 0,18 0,52 0,07 -0,15 0,12 0,03 -0,37 0,07 0,15 -0,85 -0,78 -1,03 -0,21 0,16 0,05 -1,09 0,39 0,25

15,00%

15,00%

15,00%

Sampel

Pada Suhu Ruang

QC Rendah

0 Jam 2 Jam

6,97 4,09 8,17 12,91

15,00%

72

4 Jam

6 Jam

0 Jam

2 Jam QC Tinggi 4 Jam

6 Jam

Hari Ke-0 QC Rendah Hari Ke-15 Pada Suhu Penyimpanan Hari Ke-0 QC Tinggi Hari Ke-15

Pengaruh Siklus Pembekuan dan Pencairan

Siklus Ke-0 QC Rendah Siklus Ke-1

-1,22 1,35 14,39 3,36 5,32 9,82 9,35 8,27 2,76 -0,99 -5,51 -7,71 -4,96 7,55 8,35 8,26 7,15 5,63 0,63 2,66 12,58 7,75 12,41 14,59 14,12 4,12 2,48 -7,43 14,17 -5,73 6,77 -2,47 3,08 -10,08 -8,45 5,46 0,53

15,00%

15,00%

15,00%

15,00%

73

Siklus Ke-2

Siklus Ke-3

Siklus Ke-0

Siklus Ke-1 QC Tinggi Siklus Ke-2

Siklus Ke-3 QC Rendah QC Sedang QC Tinggi QC Rendah QC Sedang QC Tinggi QC Rendah QC Sedang QC Tinggi QC Rendah QC Sedang QC Tinggi QC Rendah QC Sedang QC Tinggi QC Rendah QC Sedang QC Tinggi

0 Jam

6 Jam

12 Jam Pasca Preparasi 24 Jam

36 Jam

48 Jam

2,44 13,98 12,88 9,24 2,41 4,21 7,73 -9,83 -8,67 -12,67 -1,19 -6,19 -1,31 1,33 0,39 0,07 -3,17 -4,11 -8,46 13,69 -13,49 3,23 11,79 -8,38 1,28 9,57 -14,66 -8,17 14,13 9,66 10,25 13,85 10,09 12,25 10,97 14,30 2,43

15,00%

15,00%

15,00%

15,00%

15,00%

15,00%

15,00%

74

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan
Berdasarkan hasil analisis yang didapat dari Validasi Metode Senyawa Pyrazinamide dalam Plasma Darah secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menunjukkan perbedaan yang tidak melebihi jangkauan nilai yang ditentukan (standar USFDA). Sehingga, dapat disimpulkan bahwa

metode pengujian untuk penetapan konsentrasi Pyrazinamide dalam plasma darah manusia, baik dan layak digunakan untuk analisis rutin karena hasil Validasi Metode tersebut telah memenuhi kriteria yang ditetapkan.

B. Saran
Validasi Metode dilakukan untuk menjamin kebenaran suatu metode agar metode tersebut dapat digunakan secara terus-menerus. Oleh karena itu, alangkah baiknya jika dilakukan Verifikasi Metode secara berkala untuk menjamin kebenaran metode yang digunakan dalam keadaan tertentu. Selain itu, pada saat melakukan proses validasi harus menggunakan alat-alat yang terkalibrasi, sehingga hasil validasi yang didapatkan lebih akurat.

75

DAFTAR PUSTAKA
Abdullah, Rozi Dr.. 2012. Pyrazinamide.

http://bukusakudokter.wordpress.com/2012/11/08/pyrazinamide/. Minggu, 17 Februari 2013 pukul 21:39. Anonimus. 2001. Bioanalytical Method Validation. USA : U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center of Drug Evaluation and Research (CDER) Center of Veterinary Medicine (CVM). Anonimus. 2004. Pedoman Uji Bioekivalensi. Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. Anonimus. 2011. Penyakit TBC. http://medicastore.com/tbc/penyakit_tbc.htm. Senin, 25 Februari 2013 pukul 22:02. Anonimus. 2011. Pyrazinamide. Minggu, 17

http://infoobat.blogspot.com/2011/03/pyrazinamide.html. Februari 2013 pukul 21:14.

Anonimus. 2012. Obat. http://id.wikipedia.org/wiki/Obat. Minggu, 17 Februari 2013 pukul 21:10. Anonimus. 2013. Analytical Method Validation Report. Jakarta: PT Equilab International. Anonimus. 2013. Pyrazinamide. http://en.wikipedia.org/wiki/Pyrazinamide.

Jumat, 8 Februari 2013 pukul 20:04. Anonimus. 2013. Tuberkulosis. http://id.wikipedia.org/wiki/Tuberkulosis. Senin, 25 Februari 2013 pukul 21:36. Bayu, Ganjar Aji. 2011. Validasi Metode Analisis Domperidon dalam Plasma Darah Manusia Menggunakan LC-MS/MS. Bogor. Universitas Pakuan. Day, R.A dan Underwood. 1994. Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi 6. Jakarta: Erlangga.

76

77

European Medicines Agency, Comitte for Medicinal Products for Human Use (CHMP). Guideline on Bioanalytical Method Validation, 21 July 2011. Farida. 2012. Pengendapan Protein Plasma.

curcol.blogspot.com/2012/10/pengendapan-protein-plasma-dasarteori.html. Sabtu, 2 Maret 2013 pukul 08:39. Gritter, R. J., M. Bobbitt dan A. E. Schwarting. 1991. Kromatografi. Bandung : Penerbit ITB. Ismail, E. Krisnandi, B.Sc, Drs. H dan Arifin, Zaenal, S.Si. 2012. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Bogor: Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor J. Siregar, Charles Prof. Dr. M.Sc. Apt. Dan Hendrayana, Tomi M.Si. Apt. 2007. Praktik Sistem Manajemen Laboratorium-Pengujian yang Baik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Leon Shargel dan Andrew B.C.YU. 1988. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan. Surabaya: Airlangga University Press. Mutshler, Ernst. 1991. Dinamika Obat. Edisi 5. Diterjemahkan oleh Mathilda dkk. Bandung: ITB Pramudiarja, Uyung. 2012. Komplikasi yang Bisa Muncul Karena TBC. http://health.detik.com/read/2012/03/16/105946/1868974/763/komplikasi -yang-bisa-muncul-karena-tbc. Senin, 25 Februari 2013 pukul 21.36 Radhi, Fatimah. 2012. Pyrazinamide (Pyrazinamide).

http://publichealthnote.blogspot.com/2012/02/pyrazinamidePyrazinamide.html. Minggu, 17 Februari 2013 pukul 21:19. S. Unsulan, M. Sancar, B. Bekce, P.M. Clark, T. Karagoz, F.V. Izzettin, S. Rollas. Therapeutic Monitoring of Isoniazid, Pyrazinamide and Rifampicin in Tuberculosis Patients Using LC. Chromatographia. 2005, 61, 595-598 Sakinah, Ismi. 2012. Laporan Praktik Kerja Industri. Bogor: Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor. Sari, Bina Lohita Apt. Mpd. 2012. Analisis Kimia Farmasi. Bogor: Menengah Analis Kimia Bogor. Sekolah

78

U.S. Department of Health and Human Service Food and Drug Administration . Bioanalytical Method Validation, Guidance for Industry, May 2001. Vinod PS, Midha KK, Dighe S, McGilveray IJ, Skelly JP, Yacobi A, et al. Analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and

pharmacokinetic studies. J Pharm Sci 1992; 81(3): 309-12.

LAMPIRAN
Lampiran 1 Struktur Organisasi PT Equilab International

79

80

Lampiran 2 Instrumentasi HPLC (Waters Alliance e2695)

81

Lampiran 3 Pembuatan Reagen/Pereaksi 1. Buffer pH 4 dan pH 7 : Dari Botol Buffer pH 4 dan pH 7 yang berada dalam kulkas bahan kimia, masing-masing dipipet 5 mL ke dalam tabung reaksi datar (flat test tube) yang kemudian diberi label dan siap digunakan pada saat kalibrasi pH-meter. 2. KCl Jenuh : 1,12 gram KCl dilarutkan dalam 3 mL H2O. 3. NaOH 1 M : 2 gram NaOH dilarutkan dalam 50 mL H2O. 4. Metanol : H2O (1:1) : Dibuat sebanyak 15 mL. Sehingga, 7,5 mL Metanol dicampurkan dengan 7,5 mL H2O. 5. Fase Gerak : Asetonitril 100% : Dalam volume 1 liter, yang kemudian disonifikasi (sonicated) selama 15 menit. H2O 100% : Dalam volume 500 mL, disaring dengan kertas saring millipore 0,45 m, kemudian disonifikasi selama 15 menit. Metanol 10% : Dalam volume 500 mL, maka 450 mL H2O disaring terlebih dahulu dengan kertas saring millipore 0,45 m kemudian ditambahkan 50 mL metanol(p), dihomogenkan dengan magnetic stirrer, kemudian disonifikasi selama 15 menit. Buffer KH2PO4 10 mM pH 6,0 : 1,36 gram KH2PO4 dilarutkan dalam 1 liter H2O dan dihomogenkan. Lalu larutan diatur pH-nya dengan larutan NaOH 1 M hingga pH 6,0. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas saring millipore 0,45 m dan disonifikasi selama 15 menit. 6. H2O yang digunakan yaitu Air Milli-Q, yaitu air yang diperoleh dari alat Milli-QTM air yang berasal dari PAM atau sumur pompa yang dilewatkan melalui resin ion-exchange kemudian dilewatkan lagi ke dalam catridge yang berfungsi untuk menghilangkan kontaminan baik yang organik maupun yang berbentuk ion pada akhir proses dilakukan penyaringan dengan menggunakan filter membran dengan ukuran pori-pori 0,45 m.

82

Lampiran 4 Prosedur Proses Analisis Data di KCKT

83

Lampiran 5 Prosedur Pemakaian pH-meter

84

Lampiran 6 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Blanko (Interday 1)

85

Lampiran 7 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Blanko+Internal Standar (Interday 1)

86

Lampiran 8 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 1 (Interday 1)

87

Lampiran 9 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 2 (Interday 1)

88

Lampiran 10 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 3 (Interday 1)

89

Lampiran 11 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 4 (Interday 1)

90

Lampiran 12 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 5 (Interday 1)

91

Lampiran 13 Contoh Kromatogram Kurva Kalibrasi Standar 6 (Interday 1)

92

Lampiran 14 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control) Konsentrasi Rendah (Interday 1)

93

Lampiran 15 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control) Konsentrasi Sedang (Interday 1)

94

Lampiran 16 Contoh Kromatogram Sampel Pengawasan Mutu (Quality Control) Konsentrasi Tinggi (Interday 1)