Laporan Praktikum Proyek Genetika Molekuler Mikroba

Percobaan 02
Polymerasa Chain Reaction (PCR) dan Elektroforesis


Nama : Ridwan Muhamad Rifai
NIM : 10408040
Tgl. Percobaan : 2 September 2010
Tgl. Pengumpulan : 23 September 2010
Kelompok : 6
Asisten : Rahma










Program Studi Mikrobiologi
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati
Institut Teknologi Bandung
2010
1. Tujuan
a. Membuat campuran templat DNA untuk PCR
b. Mendeskripsikan output band hasil elektoforesis yang telah dilakukan PCR
c. Menentukan keakurasian dan kepresisisian mikropipet

2. Metode
a. Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR adalah suatu metode dalam memperbanyak fragmen DNA berdasarkan
konsep replikasi DNA secara in vitro. Secara umum PCR berupa siklus termal yang
dilakukan dalam beberapa set dengan satu setnya terdiri dari beberapa proses.
Proses tersebut adalah :
1) Denaturasi DNA
Proses ini berlangsung pada suhu tinggi sekitar 94-98
o
C. Pada proses ini DNA
akan terpisah menjadi single strand. Suhu berperan sebagai pengganti enzim
helikase yang berperan dalam replikasi DNA.
2) Annealing
Pada proses ini primer akan melekat pada templat DNA secara spesifik pada
bagian yang komplemen dengan primer. Bagian ini biasanya merupakan
fragmen target dari PCR. Suhu pada proses ini lebih rendah dari suhu
denaturasi yaitu sekitar 50-65
o
C. Suhu annealing sangat menentukan apakah
primer akan melekat tepat pada fragmen target atau tidak. Biasanya suhu
annealing ini lebih rendah 3-5
o
C dari Tm primer.
3) Elongasi
Pada proses ini fragmen DNA akan direplikasikan masing-masing oleh enzim
DNA polimerase sama seperti pada proses replikasi. Suhu bergantung pada
jenis DNA polimerase yang digunakan namun secara umum berada pada suhu
cukup tinggi mengingat jenis DNA polimerase yang digunakan merupakan
enzim termostabil. Penempelan primer pada masing-masing ujung dari
fragmen target akan sangat menentukan apakah fragmen target tersebut yang
diamplifikasi sehingga akan muncul fragmen target yang murni. (Rychlik, 1990)

Ketiga proses tersebut berlangsung secara siklus dengan lebih dari 20 kali
pengulanagan. Fragmen target DNA murni baru akan didapat pada siklus ketiga.
Fragmen target ini akan diamplifikasikan dengan kecepatan logaritmik sehingga
akan menghasilkan jutaan kopi dalam waktu yang cukup singkat.
Gambar 1. Proses PCR

PCR memerlukan beberapa komponen yaitu sebagai berikut.
- Templat DNA (berisi fragmen target) sebagai vektor fragmen target yang akan
diamplifikasi
- DNA polimerase sebagai pelaksana ampifikasi DNA. DNA polimerase yang
dipakai haruslah bersifat termostabil seperti Taq polymerase
- dNTP sebagai building block dari DNA yang akan dibuat
- Buffer sebagai pelarut yang berfungsi menjaga pH agar reaksi berjalan
optimum
- Mg
2+
sebagai kofaktor DNA polimerase
- Primer (sepasang) sebagai penentu fragmen target yang akan diamplifikasi.
Primer berjumlah 2 buah yang masing-masing bekerja secara forward dan
backward sehingga akan menentukan daerah spesifik fragmen DNA
(Sambrook, 2001)

Metode kerja PCR diawali dengan mencampur semua komponen dalam tube PCR.
Kuantitas komponen adalah sebagai berikut.
Bahan Konsentrasi akhir Volume (L)
DreamTaq Buffer 1x 2,5 L
dNTPS 0.08 mM / 0.2 mM 0,5 L
SP6 0.5 M 0,625 L
T7 0.5 M 0,625 L
DreamTaq 2.5 unit 2 unit
Sampel DNA 100 ng 2,5 ng
Deion - 17,75 L

Komponen harus selalu diletidakan dalam es untuk mencegah kerusakan. Setelah
itu tube PCR disentrifugasi terlebih dahulu untuk memastikan kehomogenisasian
campuran. Lalu tube (8 tube) diamsukan dalam alat PCR gradien. Alat ini memiliki
96 plate yang terdiri dari 8 baris dan 12 kolom. Alat ini akan membuat 8 variasi
suhu annealing secara gradien berdasarkan pada range suhu yang diinput. Setiap
baris plate akan memiliki suhu masing-masing. Kelompok kami mendapat baris
nomor 6 dengan suhu annealing 57
o
C dengan range suhu 55-65
o
C. Setelah tube
dimasukan maka program PCR yang digunakan dalam pengaturan suhu dan waktu
dijalankan. Profil suhu yang digunakan oleh kelompok kami adalah sebagai berikut.



1 = Denaturasi 1
2 = Denaturasi 2,3,...,n
3 = Annealing
4 = Elongasi 1,2,...,n-1
5 = Elongasi n
6 = Cooldown
Dari profil di atas, terjadi pengulangan proses 2 3 4 sebanyak 30 kali ( 30
siklus).

b. Elektoforesis
Elektroforesis adalah suatu prosedur dalam mengisolasi DNA dan membaca
keberadaan berbagai fragmen DNA dengan media agar/gel berdasarkan suatu
pemisahan. Elektroforesis menggunakan arus listrik sebagai penggerak molekul
karena seperti diketahui bahwa DNA memiliki muatan negatif sehingga akan
menuju kutub positif. Pemisahan terjadi berdasarkan massa molekul yang
diperlakukan. Makin berat massa molekul maka akan semakin lama ia bergerak
dalam agar/gel yang berarti semakin dekat ia dari titik awal elektroforesis.

Elektroforesis memerlukan beberapa komponen, yaitu
- Agarosa sebagai media elektroforesis
- Buffer sebagai pelarut dan perendam agar dan menjaga pH
- EtBr sebagai pewarna radioaktif yang akan berikatan dengan DNA sehingga
jalannya DNA akan diketaui di bawah sinar UV
- Bromphenolblue sebagai pewarna loading yang akan menentukan kapan
elektroforesis selesai dengan menunjukan sampai mana pergerakan molekul
- Ladder sebagai satuan baku penunjuk kuantitas suatu band DNA berdasarkan
banyaknya pasang basa pada band
(Lodish, 2004)


1
2
3
4 5
6
Berikut adalah tampilan dari hasil elektoforesis dan cara membacanya.
Gambar 2. Hasil Elektrofresis (Perbandingan dengan Ladder)

Proses pembutan agar diawali dengan mencampur agarosa dengan buffer TAE
sambil dididihkan. Setelah suhunnya menurun lalu ditambah larutan EtBr (Etidium
Bromida). Setelah itu, larutan agar ini dicetidak dalam cetidakan gel bersisir.
Setelah padat gel diambil dan sisir dilepas. Bekas sisir ini akan menimbulkan well
(sumur) yang merupakan tempat memasukan sampel. Selanjutnya gel ditaruh
dalam tangki elektroforesis dan direndam dalam buffer TAE.

Kemudian sampel DNA hasil PCR ditambah loading dye bromphenolblue sebanyak
0,5 L untuk selanjutnya dihomogenisasi dalam tube PCR. Lalu 10 L campuran
dipipet dan dimasukan dalam masing-masing well (8 sampel, 1 ladder, 2 kontrol).
Setelah semua campuran sampel DNA dimasukan, ladder dimasukan dan alat
elektroforesis dinyalakan pada tegangan listrik 100V. Rentang waktu tidak
ditentukan sebelumnya karena ditentukan oleh petunjuk dari seberapa jauh
loading dye telah berjalan.

Setelah elektroforesis selesai, gel diangkat dan difoto di bawah sinar UV dalam
ruang gelap yang akan menghasilkan tampilan yang dapat dilihat di bagian Hasil
Pengamatan.




c. Penggunaan Mikropipet
Mikropipet adalah alat ukur volume yang sangat penting dalam genetika
molekuler. Mikropipet memiliki nilai keakurasian dan kepresisian yang berbeda
dan dapat diuji melalui metode berikut.

Pertama-tama lima buah tube 1,5 ml ditimbang sehingga menghasilkan berat
kosong. Kemudian masing-masing tube tersebut ditmabahkan air sebanyak 1 ml
dengan mikropipet. Lalu kelima tube tersebut ditimbang ulang untuk dilihat berat
isinya. Selisih berat isi dan berat kosong merupakan berat air yang ditera oleh
mikroppipet.

Setelah diketahui selisihnya maka dapat dihitung persen error untuk setiap
peneraan dengan mikropipet.

Dengan x = selisih massa
n = volume sebenarnya
Setelah itu dapat ditentukan nilai standar deviasinya () sebagai berikut

Jika %Error < 0,8% @ 375-1000 L maka mikropipet dapat dikatidakan akurat.
Jika < 1,3 L @ 1000 L maka mikropipet dapat dikatidakan presisi.

3. Hasil Pengamatan
a. PCR
Hasil PCR tampak berwarna bening baik sebelum dilakukan PCR maupun setelah
dilakukan PCR. Tidak ada perbedaan yang berarti. Dengan kondisi ini tidak akan
diketahui apakah semua komponen sudah dimasukan atau belum. Perlu ketelitian
dalam melakukan pencampuran PCR. Saat PCR, kelompok kami mendapatkan
suhu annealing 57
o
C yang lebih sesuai dengan Tm primer. Running PCR sebanyak
30 siklus dengan profil seperti di atas membutuhkan waktu sekitar 3 jam.


b. Elektroforesis
Berikut adalah foto hasil Elektroforesis

1 2 3 4 5 5 6 7 8 L + -



Ket : L = Ladder
+ = Kontrol Positif
- = Kontrol Negatif

Terlihat dari gambar di atas, kelompok kami (6) mendapatkan hasil elektroforesis
berupa 2 band. Band ini dicocokan dengan band ladder untuk mengetahui berapa
pasang basakah DNA yang terdeteksi dan terisolasi dari sampel. Terlihat pula
bahwa kontrol positif menunjukan band dan kontrol negatif tidak menunjukan
band.

c. Penggunaan Mikropipet
Setelah melalui penimbangan, maka didapat data sebagai berikut.

No Tube Berat Tube Kosong (gr) Berat Tube + Air (gr)
1 0,9992 1,4966
2 1,0151 1,5010
3 1,0145 1,5100
4 1,0454 1,5412
5 0,9922 1,4873


4. Pembahasan
a. PCR
PCR merupakan suatu proses yang sangat krusial karena rentan sekali terhapad
kontaminan berupa enzim DNAse yang dapat mendegradasi DNA. Enzim ini
berada di tubuh kita. Karena itu dilarang terjadi kontidak antara tubuh dengan
komponen, bahkan sarung tangan pun tidak boleh terkena tangan bagina luarnya.
Hal ini penting karena akan memengaruhi hasil elektroforesis yaitu tak terbacanya
band. Secara kasat mata, tidak dapat terdeteksi kontaminan dan komponen apa
saja yang ada dalam tube PCR. Larutan sampel DNA senantiasa berwarna bening.
Hal ini menyebabka perlunya ketelitian dalam bekerja dan menggunakan
komponen karena kekurangan komponen juga mengakibatkan hal yang fatal pada
elektroforesis. Hasil elektroforesis kami sangat dipengaruhi oleh cara kerja PCR
kami dan akan dibahas di bagian pembahasan elektroforesis.

Pada praktikum ini, sebenarnya akan diisolasi fragmen DNA insert dari suatu
vektor berupa plasmid. Skemanya sebagai berikut.
Gambar 3. dCT plasmid
Templat DNA di atas bernama dCT plamid yang terdiri dari vektor plasmid pGEMT-
Easy sebesar 3015 bp dan fragmen insert sebesar 1300 bp. Fragmen insert inilah
yang merupakan target utama PCR. Untuk mendapatkan fragmen murni
digunakan dua buah primer yaitu SP6 dan T7. Keduanya akan bekerja antiparalel
dan menghasilkan fragmen target DNA. Namun, pada fragmen insert ini ternyata
ada dua tempat pengenalan primer T7 sehingga akan didapatkan fragmen yang
lebih pendek daripada fragmen insert. Gambarnya sebagai berikut.

Gambar 4. Fragmen Insert

Dari gambar di atas dapat diketahui bahwa akan didapatkan dua buah amplifikan
yaitu yang sepanjang 1300 bp dan 875 bp. Hasil elektroforesis pun seharusnya
sejalan dengan teori ini. Namun kelompok kami menemukan adanya anomali
pada hasil elektroforesis yaitu tak ditemukannya band dengan besaran 1300 bp
maupun 875 bp. Analisis akan dilakukan pada bagian pembahasan elektroforesis.

b. Elektroforesis
Hasil elektroforesis kelompok kami menunjukan ada 2 band yang setelah
dicocokan dengan lader akan menghasilkan besaran 4300an pb dan 3000an pb.
Analisis foto sebagai berikut.

Dari teori dan analisis skema plasmid dCT seperti di pembahasan PCR, seharusnya
ada band dengan besaran 1300 bp dan 875 bp yang menunjukan adanya fragmen
insert disamping band 4300 bp dan 3000 bp ( keduanya plasmid dCT). Hal ini
merupakan suatu anomali mengingat suhu annealing kelompok kami merupakan
suhu yang paling tepat. Sebelum dibahas mengenai penyebabnya, akan dibahas
dahulu kemunculan band 4300 bp dan 3000 bp.

Seperti yang telah diketahui, band 4300 bp merujuk pada plasmid dCT itu sendiri
yang memiliki panjang 4315 bp (pGEMT-Easy + fragmen insert). Sedangkan band
yang terbaca memiliki besaran 3000 bp pun sebenarnya adalah plasmid dCT juga
yang sebenarnya memiliki besar 4315 bp. Hal ini diakibatkan karena pada plasmid
yang bersifat sirkular, sering terjadi kasus supercoiling. Hal ini alami terjadi dan
membuat plasmid yang tadinya bulat menjadi terpelintir. Konformasi terpelintir
inilah yang ternyata membuat pergerakan plasmid tersebut dalam agar/gel
elektroforesis menjadi lebih cepat dibandingkan plasmid sirkular. Hal ini
dimungkinkan karena dalam konformasi supercoil, bentuk menjadi lebih efisien,
momentum menurun, dan permukaan kontak menjadi lebih kecil. (Berg, 2007)

Selanjutnya ketidakmunculan band 1300 bp dan 875 bp ternyata diakibatkan oleh
kesalahan prosedur pada saat membuat campuran PCR. Primer T7 tak termasukan
ke dalam campuran sehingga dalam campuran PCR hanya terdapat templat, Taq
polymerase, Taq buffer, dNTP, dan primer SP6. Karena hanya terdapat satu
macam primer yaitu SP6, maka daerah target tidak akan terisolasi dan
teramplifikasi tetapi malah seluruh plasmid dCT yang teramplifikasi terus menerus
karena plasmid dCT yang dipakai berbentuk sirkular. Hal ini terbukti ketika
dilakukan elektroforesis hanya terdapat band 4300 bp dan 3000 bp yang
keduanya merujuk kepada plasmid dCT.

c. Penggunaan Mikropipet
Dari hasil pengamatan dapat ditentukan nilai %Error masing-masing teraan
mikropipet dan rataannya. Perhitungannya sebagai berikut.

No Tube Berat Tube Kosong (gr) Berat Tube + Air (gr) Selisih (gr)
1 0,9992 1,4966 0,4974
2 1,0151 1,5010 0,4859
3 1,0145 1,5100 0,4955
4 1,0454 1,5412 0,4958
5 0,9922 1,4873 0,4951

Rata-rata selisih = 0,49394 gr

Karena %Error > 0,8 % maka mikropipet dapat dikatakan tidak presisi

( )

a. ( )

= 11,972 + 64,642 + 2,4336 + 3,4596 +1,3456

= 83,852

b.
()

c. = 4,5785 L
Karena > 1,3 L maka mikropipet dapat dikatakan tidak akurat


5. Kesimpulan
a. Larutan DNA PCR terdiri dari campuran buffer, DNA polimerase termostabil,
dNTP, 2 buah primer, template, dan kofaktor logam. PCR dilakukan dengan
30 siklus denaturasi-annealing-elongasi dengan suhu gradien.
b. Dari hasil elektroforesis terbaca 2 band yang setelah dicocokan dengan
ladder menunjukan besaran 4300 bp dan 3000 bp. Kedua band ini merujuk
kepada plasmid dCT dalam bentuk sirkular (4300 bp) dan supercoil (3000 bp).
Tidak ditemukan adanya band dengan besaran 1300 bp dan 875 bp yang
menunjukan fragmen insert tidak berhasil diisolasi.
c. Dari hasil perhitungan, maka mikropipet yang digunakan memiliki
karakteristik tidak akurat (%Error > 0,8 % ) dan tidak presisisi ( > 1,3 L).

6. Daftar Pustaka
Berg, Jeremy M., John L. Tymoczko, dan Lubert Stryer. 2007. Biochemistry 5th ed. San
Francisco : W. H. Freeman
Lodish H, Berk A, Matsudaira P, et al. 2004. Molecular Cell Biology 5th ed. . New York : W. H.
Freeman
Rychlik W., Spencer W. J., dan Rhoads R. E. 1990. "Optimization of the annealing
temperature for DNA amplification in vitro". Nucl Acids Res 18 (21): 64096412
Sambrook, Joseph dan David W. Russel. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd
ed. . New York : Cold Spring Harbor