Pemeriksaan HCV (Hepatitis C Virus ELISA)

Hari/Tanggal praktikum

: Jumat, 10 Oktober 2014

Tempat

: Unit Donor Darah RSUP Sanglah

I.

TUJUAN
1. Tujuan Instruksional Umum
Mahasiswa dapat mengetahui prosedur pemeriksaan HCV dengan menggunakan
metode ELISA secara manual.

2. Tujuan Instruksional Khusus

a. Untuk mengetahui cara pemeriksaan HCV metode ELISA manual
b. Untuk mengetahui adanya antibody terhadap virus Hepatitis C dalam plasma pasien

II. METODE
Metode yang digunakan dalam praktikum adalah ELISA manual dengan reagen
Hepanostika HCV ultra.

III. PRINSIP
Hepanostika HCV Ultra menggunakan immunosorbent yang terikat pada dasar
sumur yang terdiri dari peptide sintetik khusus untuk mengikat antigen yang sangat antigenic
pada segmen inti, NS3, NS4, dan NS5 pada daerah dari Hepatitis C virus. Adanya HCV
antibody spesifik pada sampel akan mengikat immunosorbent. Proses pencucian dilakukan
untuk menghilangkan antibody terikat dan komponen serum lainnya. Peroxidase conjugated
antibody spesifik human igG ditambahkan ke setiap sumur. Kemudian conjugate ini akan
berekasi dengan antibody terikat. Setelah pencucian kedua dimasukkan TMB ke dalam
setiap sumur. Sebuah warna biru akan berkembang sesuai jumlah antibody HCV yang ada
pada serum. Reaksi enzim-substrat diakhiri dengan penambahan asam sulfat yang
memberikan warna kuning. Perubahan warna yang terjadi di masig-masing sumur diukur
secara spektrofotometri pada panjang gelombang 450 nm. Reaksi reaktif adalah specimen
dengan nilai absorbansi lebih besar atau sama dengan nilai cut off.

IV. DASAR TEORI

A. Hepatitis
Penyakit yang mempengaruhi hati meliputi kelainan sekunder pada

berbagai

penyakit sistemik dan kelainan primer yang lebih spesifik bagi hati itu sendiri. Ada
beberapa penyakit yang ditemukan akibat gangguan hati antara lain hipertensi porta, pirav
vena-porta, sistemik splenomegali, ikterus/jaundice/penyakit kuning, sirosis, dan hepatitis.
Dari beberapa contoh ini yang paling sering dijumpai dalam beberapa kasus adalah
hepatitis.
Hepatitis adalah peradangan pada hati. Penyakit ini dapat disebabkan oleh infeksi
atau toksin termasuk alcohol, dan dijumpai pada kanker hati. Hepatitis disebabkan oleh
virus. Telah ditemukan 6 atau 7 kategori virus yang menyebabkan hepatitis (Firefly, 2010).

B. Hepatitis C
a. Pengertian
Penyakit hepatitis C adalah penyakit hati yang disebabkan oleh virus hepatitis C
(HCV = hepatitis C virus). HCV adalah virus RNA yang digolongkan dalam Flavivirus
bersama-sama dengan cirus hepatitis G, Yellow fever, dan Dengue. Virus ini umumnya
masuk ke dalam darah melalui transfusi atau kegiatan-kegiatan yang memungkinkan
virus ini langsung terpapar dengan sirkulasi darah.
Kehadiran virus hepatitis C di organ hati memicu dikeluarkannya sistem
kekebalan tubuh yang mengakibatkan proses peradangan. Proses peradangan yang
terus-menerus mengakibatkan penumpukan jaringan parut di hati. Maka terjadilah apa
yang dinamakan sirosis hati.. Hati yang menjadi sirotik dapat gagal melakukan
fungsinya secara normal. Hal ini disebut dengan gagal hati. Gagal hati dapat
mengakibatkan banyak komplikasi penyakit, bahkan kematian. Selain itu sirosis hati
juga meningkatkan kemungkinan terjadinya kanker hati.

b. Cara Penularan
Yang paling umum dari penyebaran virus hepatitis C adalah penggunaan jarum
suntik yang sama secara berganti-gantian dari satu orang kepada yang lain. Hal ini

sering terjadi pada pecandu narkoba yang kurang peka akan kesterilan alat suntik yang
mereka gunakan. Alat suntik yang aman digunakan adalah alat suntik baru yang steril
dan dipakai hanya untuk sekali pakai untuk satu orang saja.
Alat tatto dan tindik yang tidak steril juga beresiko untuk menularkan virus ini.
Selain itu penggunaan sikat gigi, alat cukur, gunting kuku, alat facial dan alat-alat yang
memungkinkan kontaminasi dengan darah lainnya secara bersama-sama juga beresiko.
Cara penularan yang lain adalah kecelakaan yang terjadi di laboratorium atau
rumah sakit/klinik pada petugas kesehatan yang tangannya secara tak sengaja tertusuk
jarum bekas pasien penderita hepatitis C (1,8%).
Yang juga berisiko adalah hubungan seksual tanpa kondom dengan pasangan
yang mengidap hepatitis C (1-4%).
Penularan dari ibu kepada anak yang dikandung dan dilahirkannya juga
memungkinkan (sekitar 4 dari 100 anak yang lahir dari ibu yang terinfeksi). Sedangkan
penularan lewat air susu ibu yang menderita hepatitis C kepada bayi yang disusuinya
belum pernah dilaporkan sehingga ASI dianggap aman. Meski demikian bila terjadi
luka di sekitar puting ibu atau si ibu juga mengidap HIV, menyusui tidak boleh
dilakukan.
Palang Merah Indonesia (PMI) saat ini sudah melakukan screening virus
hepatitis C terhadap tiap sampel darah dari donor untuk mencegah penularan lewat
transfusi darah.
Untuk hubungan sosial seperti berjabat tangan, berpelukan, berciuman,
menggunakan alat makan dan minum yang sama, menggunakan jamban dan kamar
mandi yang sama secara wajar tidak menularkan virus hepatitis C. Oleh sebab itu
dalam merawat dan berhubungan sosial dengan keluarga atau sahabat yang menderita
hepatitis C kita tidak perlu ragu atau kawatir. Mereka sangat membutuhkan perhatian
dan suport dari kita (Firefly, 2010).

c. Gejala
Orang yang mulai terinfeksi virus Hepatitis C, sekitar 75% tidak menunjukkan
gejala sakit. Kebanyakan dari mereka tampak sehat-sehat saja. 25% lainnya mungkin
merasakan keletihan, kehilangan napsu makan, nyeri otot atau demam yang tidak

spesifik. Pada tahap awal penyakit jarang sekali terjadi ikterus/ jaundice atau kekuningan
pada kulit atau mata. Hal ini yang membuat kenapa banyak orang tidak sadar bahwa
dirinya sudah terinfeksi. Bila virus masuk ke dalam tubuh biasanya akan dilawan oleh
sistem kekebalan tubuh kita dan mati, namun virus hepatitis C sulit dilawan oleh sistem
imun kita dan biasanya akan menjadi kronis.
Setelah lama berselang dan hati mengalami peradangan yang menetap barulah
terlihat beberapa gejala yang tidak spesifik, seperti cepat lelah dan gejala-gejala tidak kas
lainnya (tidak enak badan). Dalam pemeriksaan darah peningkatan fungsi hati yang
menunjukkan kerusakan hati mulai terjadi. Disinilah biasanya seseorang baru mengetahui
bahwa dirinya terinfeksi.
Bila sudah sampai tahap sirosis hati akan terlihat gejala badan terasa lemah,
kehilangan napsu makan dan turunnya berat badan, kemerahan di telapak tangan, bercak
pembuluh darah di kulit yang bentuknya mirip laba-laba (spider nevi/ spider angioma),
proses pembekuan darah terganggu, pembesaran kelenjar payudara pada laki-laki dan
lain-lain. Bila sudah masuk sampai gagal hati (fungsi hati berhenti) maka hal ini bisa
mengakibatkan penurunan kesadaran seperti ling-lung sampai koma dan yang paling
menakutkan adalah kematian. Pada sirosis hati yang parah biasanya tubuh akan
menguning/ terjadi jaundice (terlihat pada kulit dan mata) akibat hati tidak mampu
mengeliminasi bilirubin (komponen kekuningan hasil perombakan hemaglobin dan sel
darah merah) karena banyak selnya yang sudah rusak.
Akibat sirosis yang lain adalah pengerutan hati akibat bertumpuknya jaringan
parut dapat mencekik pembuluh darah besar yang melewatinya sehingga tekanan disana
menjadi sangat besar. Hal ini disebut dengan Hipertensi Portal/ Portal Hypertension.
Dengan berbagai mekanisme hal ini menimbulkan penumpukan cairan di rongga perut
dan perut menjadi membuncit karenanya. Keadaan ini disebut Ascites. Lainnya terjadi
varises di pembuluh vena di kerongkongan (esofagus, saluran yang menuju ke lambung
dari mulut) yang sewaktu-waktu bisa pecah dan menimbulkan perdarahan serius/ masif.
Hipertensi portal juga dapat mengakibatkan gagal ginjal, bembesaran limpa dan anemia
(Firefly, 2010).

C. Pemeriksaan Laboratorium Penyakit Hepatitis C

Bagi orang yang beresiko atau dicurgai menderita hepatitis C dan belum diobati
sebaiknya melakukan screening test. Screening test pertama untuk hepatitis C adalah
pemeriksaan Anti-HCV dengan teknik ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).
Pada pemeriksaan ini dilihat apakah tubuh kita memproduksi antibodi terhadap virus
Hepatitis C. Bukan mendeteksi virusnya melainkan antibodinya. Pada orang yang sehat,
tubuhnya tidak memproduksi antibodi terhadap virus hepatitis C. Bila tubuh meproduksi
antibodi terhadap virus hepatitis C itu tandanya virus tersebut ada di dalam tubuh dan
tubuh berusaha untuk melawannya dengan mengeluarkan antibodi.
Hasil anti-HCV ELISA bisa positif/reaktif, borderline/nilainya positif ringan, atau
negatif/non reaktif. Bila hasilnya negatif dan orang yang bersangkutan bukan tergolong
beresiko tinggi tertular hepatitis C, berarti orang tersebut tidak terinfeksi dan tidak perlu
melakukan pemeriksaan lain. Bila hasilnya positif/ reaktif atau borderline, belum tentu
orang tersebut terinfeksi. Kadang kala hasil tes pertama yang positif bisa saja salah.
Sehingga bila hanya sekali melakukan tes Anti-HCV hasilnya reaktif atau borderline
sebaiknya dilakukan tes penunjang (tahap kedua).
Tes penunjangnya adalah tes Anti-HCV dengan teknik RIBA (Recombinant
Immunoblot Assay) yang juga mendeteksi adanya antibodi terhadap virus hepatitis C. Bila
hasilnya negatif dan orang yang bersangkutan bukan tergolong beresiko tinggi tertular
hepatitis C, berarti orang tersebut tidak terinfeksi dan menunjukkan bahwa tes sebelumnya
hasilnya salah sehingga tidak perlu melakukan tes lainnya lagi. Bila positif berarti orang
tersebut benar terinfeksi. Sedangkan bila hasilnya indeterminate berarti hasilnya masih
belum jelas (unclear).
Untuk hasil tes anti-HCV RIBA yang positif dan indeterminate sebaiknya
dilakukan tes berikutnya (tahap ketiga) yang lebih sensitif yaitu HCV-RNA. Pada orangorang yang tergolong beresiko tinggi untuk terpapar hepatitis C juga dianjurkan untuk
meakukan tes ini. Dalam pemeriksaan ini dideteksi kadar RNA virus di dalam tubuh. Yang
dideteksi bukan antibodinya melainkan virusnya. Bila ditemukan virus di dalam darah/
positif berarti infeksi sedang berlangsung. Bila hasilnya negatif belum tentu orang tersebut
tidak terinfeksi. Bisa saja virusnya baru saja masuk ke dalam tubuh atau masih berjumlah
sedikit sehingga tes sebaiknya diulang kembali untuk memastikan. Bila orang yang

beresiko tertular telah melakukan dua kali tes Anti-HCV dan hasilnya negatif, lalu
melakukan tes HCV-RNA dan hasilnya positif, ini artinya infeksi telah berlangsung namun
tubuh tidak mampu memproduksi antibodi secara memadai.
Tes HCV-RNA juga berguna untuk mengetahui respon virologi pasien hepatitis C
untuk menilai keberhasilan pengobatan terhadap obat-obatan antiviral yang diberikan
dokter.
Untuk mendeksi adanya kerusakan pada organ hati biasanya dokter menganjurkan
pemeriksaan fungsi hati, seperti SGPT, SGOT dan bilirubin. Atau dokter bisa juga
menganjurkan biopsi hati (Putri, 2012).

D. ELISA (Enzim-linked immunosorbent assay)

ELISA disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut-enzim, merupakan
teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibodi dan
antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk
mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam suatu sampel seperti dalam
pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia
khususnya). Namun seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan, teknik ELISA juga
diaplikasikan dalam bidang patologi tumbuhan, kedokteran, dll.
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA
kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan
teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada
teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan
enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut
sebagai teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagai macam jenis teknik.
Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA
tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam
teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain:
1. ELISA Direct
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik
ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada

sampel. ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk

mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. ELISA
direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
a. Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut
dengan enzim.
b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi
pada percobaan yang berbeda.
d. Amplifikasi signal hanya sedikit.
e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum
digunakan untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:
a.

Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi

b.

Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang

dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi.

2. ELISA Indirect
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang
paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur
konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen
spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk
mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji. ELISA
indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
a.

Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct
karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat
terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan
antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal,
sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu
pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik
tertaut enzim signal.

Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain:

a. Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual secara

komersial di pasar.
b. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh
oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan
pada wadah berbeda.
c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki
beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder

3. ELISA Sandwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer spesifik untuk
menangkap antigen yang diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk
mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari
ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich,
larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi.
Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi
dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal,
maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki
minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat
multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibodi primer
seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi sekunder
seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam pengaplikasiannya, ELISA
sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen
multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat
kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas
tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk
berinteraksi dengan kedua antibodi. Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa
faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain:
a. Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding
lubang microtiter.
b. Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen.

Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik

ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada
dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen
yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi
penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga
memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat
berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus
berbeda).

4. ELISA Biotin Streptavidin (Jenis Elisa Modern)

Pada

perkembangan

selanjutnya,

teknik

ELISA

sandwich

ini

juga

dikembangkan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih

tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip
kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan pada teknik ini
adalah antigen penangkap dan antigen detektor (antigen bertaut enzim signal, bersifat
optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut dengan enzim signal).

5. ELISA Kompetitif
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan dari teknik ELISA
terdahulu. Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu
kompetitor ke dalam lubang microtiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat
diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi. Kelebihan dari
teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan
sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang
diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesifisitas dari
antibodi dan antigen.

6. ELISA Multiplex

Teknik ELISA multiplex merupakan pengembangan teknik ELISA yang

ditujukan untuk pengujian secara simultan, sedangkan prinsip dasarnya mirip
dengan teknik ELISA terdahulu (Novie, 2014).

E. PENGOBATAN
Belum ada vaksin yang dapat mencegah hepatitis C, tidak seperti hepatitis B
yang sudah didapatkan vaksinnya yang dapat memberikan perlindungan kepada tubuh
terhadap virus itu. Kesulitan mendapatkan vaksin hepatitis C antara lain disebabkan
karena virus ini bisa bermutasi dan mengelak dari respon imunitas tubuh.
Untuk pengobatan, dokter biasanya memberikan antivirus seperti Ribavirin dan
Pegylated Interferon sesuai dengan kondisi pasien. Namun hal ini bisa dilakukan
setelah pemeriksaan yang menyeluruh, dalam pengawasan yang ketat serta tidak
selamanya dapat berhasil.
Sampai saat ini terus dikembangkan penelitian untuk mendapatkan formula
baru dari interferon yang lebih ampuh. Selain itu obat-obatan baru yang akan
menyempurnakan kombinasi flagylated interferon dan ribavirin juga sedang diteliti
agar dimasa mendatang semakin maningkatkan tingkat kesembuhan pasien.
1. Menghindari penyakit lebih baik daripada mengobati.
2. Segera periksakan diri ke dokter/ laboratorium apabila anda termasuk orang
yang beresiko tinggi tertular virus hepatitis C (Spiritia, 2013).

V. ALAT DAN BAHAN

Alat
Mikroplate ELISA strip plates
Washer
Spektrofotometer
Mikropipet
Yellow tip
Incubator
Timer

Bahan
Sampel serum atau plasma
Reagen Hepanostika yang terdiri dari :
a. Larutan TMB Substrate
b. Control positif
c. Control negative
d. Specimen diluents (Phospate Buffer)
e. Conjugate Working Solution
Asam sulfat

VI. CARA KERJA

1.

Strip mikroelisa disiapkan sebanyak bahan yang diperiksa ditambah dengan 3 positif
control dan 1 negatif control

2.

Spesimen diluents dipipet sebanyak 100 l dan dimasukkan ke dalam masing-masing

sumur mikroelisa

3.

Sampel dipipet 10 l dan dimasukkan ke dalam masing-masing sumur mikroelisa

dimulai dari sumur E1

4.

Control negative dipipet 10 l dan dimasukkan ke sumur A1

5.

Control positif 10 l dipipet dan dimasukkan ke sumur B1, C1, dan D1

6.

Pemeriksaan Opsi I :
Dicampurkan dengan hati-hati (misalnya dengan menggunakan mikroshaker)
Diinkubasi pada suhu 37 C selama 60 2 menit
Pemeriksaan Opsi II :
Dicampurkan dengan hati-hati (misalnya dengan menggunakan mikroshaker)
Diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 2 menit

7.

Plate dicuci dengan mesin washer sebanyak 6 kali

8.

Conjugate working solution dipipet 100 l dan dimasukkan ke dalam masing-masing

sumur

9.

Diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 2 menit

10.

Plate dicuci dengan mesin washer sebanyak 6 kali

11.

TMB substrate dipipet sebanyak 100 l dan dimasukkan ke dalammasing-masing

sumur

12.

Diinkubasi pada suhu 20-30 C selama 30 2 menit

13.

Reaksi dihentikan denagn penamabahan 100 l 1 mol/I sulfuric acid ke dalam

masing-masing sumur

14.

Hasil dibaca dengan mikroplate reader pada panjang gelombang 450 nm dan 620-630
nm sebagai refrensi

VII. INTERPRETASI HASIL

a. Kualifikasi Kontrol Negatif
1. Masing-masing NC harus 0,200

b. Kualifikasi Kontrol Positif

1. Masing-masing PC harus bernilai > 0,500
2. Rata-rata dari PC yang tersisa dihitung kembali
3. Masing-masing PC harus 0,5 x Px
PC dibuang bila tidak memenuhi syarat tersebut
4. Rata-rata dari PC dihitung kembali
5. Masing-masing PC harus 1,5 x PCx
PC dibuang bila tidak memenuhi syarata tersebut
6. Rata-rata dari PC dihitung kembali

c. Tes Validitas
1. Pemeriksaan valid jika PCx NC 0,400
2. Pemeriksaan tidak valid jika NC tidak memenuhi syarat kualifikasi
3. Pemeriksaan tidak valid jika lebih dari 1 PC tidak memenuhi syarat kualifikikasi

d. Nilai Cut Off

1. Jika pemeriksaan valid, maka dapat dihitung nilai cut off = 0,27 x PCx
2. Hasil reaktif bila nilai absorbansi dari sampel cut off

3. Hasil non reaktif bila nilai absorbansi dari sampel cut off

VIII. HASIL PENGAMATAN

a. Identitas Sampel
-

Tanggal pengiriman

: 10 Oktober 2014

Tanggal AFTAP

: 10 Oktober 2014

Asal sampel

: UUD PMI Provinsi Bali

No Urut

Nama Donor

Golongan Darah

Jenis Kelamin

Umur

432Y4707A

25

433C5996A

18

432Y4723A

AB

40

b. Identitas Pemeriksaan
-

Petugas penerima sampel : Ni Putu Anugrah Eni

Nama pemeriksa

: Ni Kadek Ratnayanti

Tanggal diterima

: 10 Oktober 2014

Tanggal diperiksa

: 10 Oktober 2014

Nomor Plate

:I

Nomor Lot

: BJ02723

Tanggal kadaluarsa

: 03-2015

Dicatat oleh

: Ni Putu Anugrah Eni

Dicek oleh

: Ni Kadek Ratnayanti

c. Data Hasil Pemeriksaan

No.

Serum

Kode

Absorbansi

Kontrol negatif

NC1

0,096

Kontrol positif 1

PC1

1,635

Kontrol positif 2

PC2

1,315

Kontrol positif 3

PC3

1,000

Sampel 1

SM 1

0,066

Sampel 2

SM 2

0,078

Sampel 3a

SM 3

0,077

Sampel 3b

SM 3

0,096

d. Gambar Hasil Pengamatan

e. Perhitungan

Rata rata nilai kontrol positif (PCx)

PCx =
=
= 1,317

Nilai kontrol negatif (NCx)

NCx = 0,096

Nilai Cut-off
Cut off

= PCx x 0,27
= 1,317 x 0,27
= 0,356

Tes Validitas
-

Hasil Valid jika:

PCx NCx

400

1,317 0,096 400

1,221

400 VALID

f. Interpretasi Hasil
Reaktif

= Nilai Absorbance Sampel Cut-Off

Non Reaktif = Nilai Absorbance Sampel < Cut-Off

Diketahui Nilai Cut-off = 0,356

Sampel 1
Absorbansi sampel = 0,066
0,066 < 0,356 Hasil non reaktif

Sampel 2
Absorbansi sampel = 0,078
0,078 < 0,356 Hasil non reaktif

Sampel 3a
Absorbansi sampel = 0,077
0,077 < 0,356 Hasil non reaktif

Sampel 3b
Absorbansi sampel = 0,096
0,096 < 0,356 Hasil non reaktif

IX.

PEMBAHASAN
Penyakit

Hepatitis C merupakan penyakit hati yang disebabkan oleh virus

Hepatitis C (HCV). HCV (Hepatitis C Virus) adalah virus RNA yang digolongkan dalam
Flavivirus bersama-sama dengan virus hepatitis G, Yellow fever dan Dengue. Virus ini
umumnya masuk ke dalam darah melalui tranfusi atau kegiatan kegiatan yang
memungkinkan virus ini langsung terpapat dengan sirkulasi darah.
Diagnosa dan pengobatan awal sangatlah penting. Tujuan pengobatan dari
Hepatitis C adalah menghilangkan virus dari tubuh sedini mungkin serta untuk mencegah
perkembangan yang memburuk pada stadium akhir penyakit hati. Untuk mendiagnosa
penyakit Hepatitis C dapat dilakukan dengan cara Pemeriksaan HCV dengan
menggunakan metode Elisa Manual.
Prinsip dari pemeriksaan HCV metode manual ini adalah hepanostika HCV Ultra
menggunakan immunosorbent yang terikat pada dasar sumur yang terdiri dari peptide
sintetik khusus untuk mengikat antigen yang sangat antigenic pada segmen inti, NS3,

NS4 dan NS5 pada daerah dari Hepatitis C Virus. Adanya HCV antibodi spesifik pada
sampel

akan

mengikat

immunosorbent.

Proses

pencucian

dilakukan

untuk

menghilangkan antibodi terikat dan komponen serum lainnya. Peroxidase conjugated

antibodi spesifik human IgG ditambahkan ke setiap sumur. Kemudian konjugat ini akan
bereaksi dengan antibody terikat. Setelah pencucian kedua dimasukkan TMB ke dalam
setiap sumur. Sebuah warna biru akan berkembang sesuai jumlah antibody HCV yang
ada pada serum. Reaksi enzim-substrat diakhiri dengan penambahan asam sulfat yang
memberikan warna kuning. Perubahan warna yang terjadi di masing-masing sumur
diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 450 nm. Reaksi reaktif adalah
specimen dengan nilai absorbansi lebih besar atau sama dengan nilai cut-off.
Pada praktikum pemeriksaan HCV metode ELISA manual kali ini, dapat
dikelompokkan menjadi 3 tahap yaitu:

a. Tahap pre-analitik
Pada tahap ini sampel diterima oleh petugas. Sampel yang diterima dipastikan
menggunakan tabung EDTA (tutup tabung berwarna ungu). Hal ini bertujuan agar darah
yang diperiksa tidak mengalami pembekuan sehingga nantinya akan dapat diperoleh
plasma dalam pemeriksaan HCV ini. Sebelum sampel dianalisa pertama-tama dilakukan
pengisian formulir sampel berupa tanggal pengiriman, tanggal AFTAP, dan asal sampel
oleh petugas. Pada praktikum kali ini sampel yang digunakan berjumlah 3 sampel yaitu:
Golongan

No

Nama Donor

432Y4707A

433C5996A

432Y4723A

AB

Darah

Jenis Kelamin

Dipastikan semua formulir telah terisi dengan data yang benar agar pemeriksaan
yang dilakukan tidak mengalami penukaran hasil. Pada tahap pre-analitik ini dilakukan
preparasi sampel

yaitu sampel darah disentrifugasi untuk diperoleh plasmanya.

Dipastikan sampel darah yang digunakan tidak lisis agar hasil yang didapatkan benarbenar valid. Setelah diperoleh plasmanya sampel darah ini siap untuk diperiksa. Pada

tahap ini juga dilakukan penyiapan alat dan bahan/reagen dimana alat dan bahan/reagen
yang digunakan dikondisikan pada suhu kamar. Hal ini dimaksudkan agar proses reaksi
pada pemeriksaan HCV nantinya berjalan dengan optimal. Pada pemeriksaan ini
dipastikan reagen yang digunakan tidak kadaluarsa dan jumlahnya cukup untuk
pemeriksaan HCV yang akan dilakukan.

b. Tahap analitik
Pada tahap ini pemeriksaan perlu diperhatikan agar sesuai dengan prosedur kerja
yang telah disiapkan yaitu dengan menggunakan reagensia Hepanostika HCV Ultra. Hal
ini dikarenakan setiap reagen pada masing-masing pemeriksaan memiliki prosedur
pemeriksaan yang berbeda sehingga cara kerja yang digunakan juga harus disesuaikan
agar diperoleh hasil yang maksimal.
Pada tahap analitik ini mula-mula mikroplate ELISA disiapkan. Dipastikan
mikroplate yang digunakan tidak tertukar dengan mikroplate pemeriksaan lainnya.
Selanjutnya diisi data-data yang diperlukan pada lembar kerja pemeriksaan HCV berupa
tata letak reagen dan sampel agar dalam pemeriksaankali ini tidak bingung dalam
memposisikan kontrol negatif, kontrol positif dan sampel. Dalam praktikum kali ini
kontrol negatif dan kontrol positif berfungsi sebagai kontrol atau pembanding dalam
menentukan hasil pemeriksaan nantinya, apakah sampel yang diuji positif atau negatif
HCV. Kontrol negatif diposisikan pada sumur dengan no A1, kontrol positif diposisikan
pada sumur dengan no B1,C1,D1, sedangkan untuk sampel diposisikan pada sumur
dengan no E1,F1,G1,H1. Pada praktikum kali ini karena sampel yang diperiksa berjumlah
3 maka pada salah satu sampel dilakukan pemeriksaan HCV duplo. Hal ini bertujuan agar
reagen yang digunakan tidak terbuang begitu saja.
Pada masing-masing sumur mikroplate dimasukkan sebanyak 100 l specimen
diluent, kemudian pada sumur no E1, F1, G1 dan H1 dimasukkan masing-masing sampel
sebanyak 10 l. Selanjutnya pada sumur no A1 dimasukkan 10 l Control Negatif dan
pada sumur B1, C1, D1 dimasukkan 10 l Control Positif. Pada pemipetan baik
pemipetan sampel maupun reagensia menggunakan mikropipet. Hal ini bertujuan karena
mikropipet memiliki spesifitas dan sensitifitas yang tinggi sehingga volume sampel dan
reagen yang dimasukkan ke dalam sumur mikroplate benar-benar sesuai dengan prosedur

kerja. Setelah itu mikropalte ditutup dengan rapat menggunakan kertas seal dan
selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit 2 menit. Inkubasi ini
berfungsi untuk melekatkan antibodi spesifik yang positif HCV pada sampel dengan
antigen yang terdapat pada sumur mikroplate ELISA. Setelah dilakukan inkubasi
selanjutnya dilakukan pencucian plate sebanyak 6 kali. Proses pencucian ini berfungsi
untuk membersihkan serta membuang antibodi- antibodi selain antibodi HCV yang
terdapat dalam mikroplate agar nantinya tidak mengganggu dalam proses reaksi antigenantibodi HCV yang dilakukan.
Pada pemeriksaan ini conjugate working solution dibuat dengan mencampurkan
10 l conjugate dengan 1 ml conjugate diluent pada tabung serologis. Kemudian conjugat
working solution yang telah jadi ini dimasukkan ke dalam masing-masing sumur
mikroplate sebanyak 100 l. Penambahan conjugate working ini berfungsi untuk
memperkuat ikatan antara antigen dan antibody pada pemeriksaan ini. Setelah dilakukan
penambahan conjugate working solution ini plate ditutup kembali dengan kertas seal
kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37oC selama 30 2 menit. Inkubasi kali ini
berfungsi untuk mengoptimalkan terjadinya reaksi antigen-antibodi pada pemeriksaan
HCV metode ELISA manual ini. Setelah proses inkubasi selesai kemudian mikroplate
dicuci kembali sebanyak 6 kali. Hal ini dilakukan dengan tujuan untuk membersihkan dan
membuang conjugate-conjugate yang berlebihan pada well mikroplate yang tidak
berikatan dengan antigen antibodi HCV dalam sumur mikroplate sehingga tidak
mengganggu reaksi pembentukan warna, karena jika conjugate-conjugate ini tidak
dibersihkan dikhawatirkan dapat menimbulkan reaksi lain yang menyebabkan
pembentukan warna yang berlebihan dan mengakibatkan hasil reaktif palsu/false positif.
Setelah dilakukan proses pencucian kemudian dilakukan penambahan larutan
TMB sebanya 100 l. Larutan TMB ini dibuat dengan mencampurkan 1 ml TMB
solution dengan 1 ml Urea Peroxida Solution kemudian dihomogenkan. Larutan TMB ini
berfungsi sebagai reagen pembentuk warna sehingga reaksi positif maupun negatif dapat
dibaca dengan menggunakan reader. Setelah penambahan TMB mikroplate ini kemudian
diinkubasi kembali pada suhu 20-30oC selama 302 menit pada tempat yang gelap.
Inkubasi pada tempat yang gelap ini berfungsi untuk memaksimalkan terbentuknya warna
tanpa ada gangguan dari cahaya.pada reaksi ini terbentuk warna biru

pada sumur

mikroplate ELISA. Warna biru ini akan berkembang sesuai dengan jumlah antibodi HCV
yang ada pada plasma sampel pasien.
Setelah proses inkubasi kemudian ditambahkan 100 l 1 mol/l Sulfuric acid ke
dalam masing-masing sumur mikroplate. Penambahan Sulfuric acid ini berfungsi sebagai
stop solution yaitu mengakhiri reaksi atau stop reaksi enzim-substrat pada sumur
mikroplate ELISA. Dengan penambahan Sulfuric acid ini warna biru akan berubah
menjadi warna kuning. Warna kuning ini menandakan pada sampel yang diuji positif
mengandung HCV (Hepatitis C Virus). Semakin pekat warna kuning yang terbentuk
maka semakin besar absorbansi yang dihasilkan. Perubahan warna pada masing-masing
sumur mikroplate ELISA ini kemudian diukur secara spektrofotometri dengan
menggunakan alat yang bernama reader dengan menggunakan panjang gelombang 450
nm.

c. Tahap post analitik

Pada tahap ini dilakukan pencatatan hasil berupa data absorbansi yang didapatkan
serta dilakukan perhitungan untuk mengetahui apakah sampel yang diuji reaktif HCV
atau tidak. Pada pembacaan hasil absorbansi dengan menggunakan reader didapatkan
hasil sebagai berikut:
No.

Serum

Kode

Absorbansi

Kontrol negatif

NC1

0,096

Kontrol positif 1

PC1

1,635

Kontrol positif 2

PC2

1,315

Kontrol positif 3

PC3

1,000

Sampel 1

SM 1

0,066

Sampel 2

SM 2

0,078

Sampel 3a

SM 3

0,077

Sampel 3b

SM 3

0,096

Dari data yang diperoleh, dapat dicari nilai rata-rata absorbansi kontrol positif
yaitu sebesar 1,317. Kemudian dicari nilai cut-offnya dengan menggunakan rumus

cut-off = PCx x 0,27

Nilai cut-off merupakan batas bawah dari hasil pemeriksaan yang masih dapat
dinyatakan reaktif. Jika hasil pemeriksaan berada sama dengan atau lebih besar dari nilai
cut-off maka hasil dapat dinyatakan reaktif, sedangkan untuk hasil pemeriksaan yang
berada di bawah nilai cut-off maka hasil dapat dinyatakan non reaktif. Pada pemeriksaan
kali ini didapatkan nilai cut-offnya yaitu sebesar 0,356.
Untuk mengetahui pemeriksaan yang dilakukan kali ini valid atau tidak maka
dapat dihitung dengan menggunakan rumus
PCx NCx 400

Pada praktikum kali ini hasil validasi yang didapatkan yaitu 1,221 400. Hasil
yang didapatkan ini menunjukkan bahwa pemeriksaan yang dilakukan valid dan dapat
dilanjutkan untuk menentukan reaktif/ non reaktif dari sampel yang diuji.
Dari data absorbansi ketiga sampel yang diperoleh kemudian dibandingkan
dengan nilai cut-off yang didapatkan tadi. Hasil yang didapatkankan pada pemeriksaan
kali ini yaitu pada semua sampel baik itu sampel 1, 2 maupun 3 sama-sama memberikan
hasil yang non reaktif terhadap HCV (Hepatitis C Virus). Hal ini dapat dilihat dari nilai
masing-masing absorbansi yang didapatkan setelah pengukuran lebih kecil jika
dibandingkan dengan nilai cut-off yang didapatkan tadi.
Setelah perhitungan selesai dilakukan kemudian dicek lagi untuk meminimalisir
terjadinya kesalahan. Kemudian hasil yang didapatkan ini dapat dilaporkan kepada dokter
untuk ditindaklanjuti kembali.
Adapun kelebihan dari teknik ELISA ini antara lain:
Teknik pengerjaan relatif sederhana.
Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi).
Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen
tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau
antigen yang bersifat sangat spesifik)
Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan untuk kekurangan dari teknik ELISA antara lain :

a) Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis
antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)
b) Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat
kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas
dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat
berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.
c) Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga
pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat
diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

X.

KESIMPULAN
Dari praktikum pemeriksaan ini dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1. Penyakit hepatitis C adalah penyakit hati yang disebabkan oleh virus hepatitis C
(HCV = hepatitis C virus). HCV adalah virus RNA yang digolongkan dalam
Flavivirus bersama-sama dengan cirus hepatitis G, Yellow fever, dan Dengue.
2. Metode yang digunakan pada pemeriksaan HCV kali ini adalah metode ELISA
manual dengan reagen Hepanostika HCV Ultra.
3. Nilai cut-off pada pemeriksaan HCV kali ini adalah 0,356 dan pemeriksaan
dinyatakan valid.
4. Hasil pada masing-masing sampel

XI.

Sampel 1

: non reaktif

Sampel 2

: non reaktif

Sampel 3a

: non reaktif

Sampel 3b

: non reaktif

DAFTAR PUSTAKA
Firefly,

2010,

Hepatitis

C,

online,

http://firefly-serba-

serbi.blogspot.com/2010/12/hepatitis-c.html, 12 Oktober 2014

Novie,

2014,

Pemeriksaan

ELISA,

online,

https://id.scribd.com/doc/188272441/Pemeriksaan-Elisa, 12 Oktober 2014

Putri,

2012,

Pemeriksaan

Imunologis

Hepatitis

C,

online,

http://mahasiswakedokteranonline.blogspot.com/2012/06/pemeriksaanimunologi-hepatitis-c-virus.html, 12 Oktober 2014

Spiritia,

2013,

Hepatitis

(HCV)

&

http://spiritia.or.id/li/bacali.php?lino=506, 12 Oktober 2014

HIV,

online,