Alur Pemeriksaan Analisis Semen

Persiapan pasien

Pengumpulan spesimen

Kelayakan spesimen

Makroskopis

Mikroskopis

Format pelaporan hasil

lutfidr@yahoo.com

Menilai:
1. Likuifaksi (umumnya terjadi dalam
1530 menit setelah diejakulasikan)
2. Viskositas
3. Warna
4. Bau
5. Volume
6. pH (diperiksa dalam waktu 3060
menit setelah diejakulasikan)

Diperiksa setelah likuifaksi sempurna

(dalam 3060 menit setelah semen
diejakulasikan), menilai:
1. Agregasi. Jika agregasi banyak
ditemukan, evaluasi apakah likuifaksi
sudah lengkap dan homogenisasi
dilakukan dengan baik.
2. Aglutinasi
3. Motilitas
4. Vitalitas. Harus dilakukan jika
spermatozoa immotile (IM) > 50%.
Penting dilakukan terutama jika
spermatozoa progresif (PR) < 40%.
5. Konsentrasi
6. Morfologi
7. Sel nonsperma
Page 1

MAKROSKOPIS

1530 menit pertama setelah diejakulasikan

Likuifaksi

Pemeriksaan
selanjutnya ditunda
dan di tunggu dalam
30 menit berikutnya

Tidak Lengkap dalam 30 menit pertama

Lengkap dalam 30 menit pertama

Lengkap dalam
60 menit

Viskositas
Viskositas tinggi

Viskositas < 2 cm

Tidak lengkap
dalam 60 menit

Warna & Bau

Volume
Dalam 3060 menit setelah diejakulasikan

MIKROSKOPIS

Setelah likuifaksi sempurna (3060

menit setelah diejakulasikan)

pH

Preparat basah
perbesaran 100400

Evaluasi likuifaksi
dan homogenisasi

Tindakan/penambahan:
Pipetasi
Dulbeccos PBS
Bromelain

Jika agregasi banyak

Agregasi & Aglutinasi

Aglutinasi
positif

Spermatozoa <4/400)

Spermatozoa >4/400

Konsentrasi spermatozoa
Motilitas
Harus dilakukan jika IM > 50%
Penting dilakukan jika PR < 40%

Vitalitas
Konsentrasi
Morfologi
Sel nonsperma
(sel bulat)

lutfidr@yahoo.com

Perhitungan akurat:
Memeriksa semua grid (9
grid) improved Neubauer,
atau
Menggunakan bilik hitung
volume besar secara
fluoresensi

Sel bulat >106/ml

Pemeriksaan
antibodi antisperma

Perhitungan tidak akurat:

Konsentrasi dilaporkan sebagai
<2 106/ml dengan ditemukan
atau tidak spermatozoa motil,
atau
Memeriksa semen yang telah
disentrifus untuk menemukan
spermatozoa, atau
Memeriksa sampel yang tidak
disentrifugasi untuk mencari
spermatozoa motil

Leukosit
peroksidase

Page 2

Alur Pemeriksaan Analisis Semen

Alat dan Bahan Analisis Semen Dasar secara Umum
1. Sarung tangan
2. Masker
3. Jas lab
4. Sepatu lab
5. Kursi dengan meja yang tidak menyerap air
6. Mikroskop dgn perbesaran 100x, 400x, 1000x
7. Stage micrometer (optional)
8. Minyak imersi
9. Tip kuning dan biru
10.Tisu halus, lint-free
11. Cairan pembersih lensa
12.Tabung reaksi kaca steril ukuran 12x75mm + rak tabung
13.Rak pewarnaan
14. Mikropipet 5l, 10, 100l, 500l, dan 1000l
15.Tip pipet kuning dan biru
16.Tempat tip pipet
17.Kontainer/tempat tip kotor
18.Label
19.Slide kaca dan slide pengapus
20.Slide kaca dengan grid (optional)
21.Pensil HB
22.Counter hemocytometer
23.Kertas dan alat tulis
24.Kalkulator
25.Refrigerator 28 C
26.Termometer ruangan
27.Kertas saring (saringan 0,45 mikron)
28.Improved Neubauer
29.Coverslip* 2222 mm, ketipisan no 4 (0,44 mm)
30.Cawan petri + tutup
31.Timer
32.Counter
33.Kalkulator
34.Alat tulis

lutfidr@yahoo.com

35.Penggaris, cm
36.Tabel/grafik perbedaan perhitungan konsentrasi yg dpt diterima
37.Tabel perkiraan kesalahan pemeriksaan (sampling error)
38.Desinfektan/sodium hipklorit, 0,1% (v/v) dan 1% (v/v) dalam akuades
39.Sabun desinfektan/antiseptik pembersih kulit
40.Eye-wash solution/eye-rinse
41.First-aid kit
42.Blanko formulir hasil pemeriksaan semen
43.Sample mixers:
Shaker dua dimensi atau rotator(optional)
Vortex untuk mencampur semen yg telah diencerkan
40 Wadah semen
41 Reagen pengencer
40 Reagen pewarnaan
41 Reagen peroksidase
42 Kriteria spermatozoa normal dan abnormal
43 Alat bantu gambar (vitalitas, peroksidase positif, ketentuan spermatozoa
yg dihitung, grid bilik hitung improved neubauer, morfologi, atlas
spermatozoa (plate 114 WHO 2010))
44 Tabel-tabel/grafik untuk menentukan perhitungan yang dapat diterima

Page 3

Pemeriksaan analisis semen dasar

Spesimen
: Semen
Wadah
: Wadah khusus semen/wadah dari gelas bersih yang sudah diketahui beratnya atau wadah dari gelas ukur berskala (ketepatan 0,1 ml)
dimodifikasi bermulut lebar

yang

Semua alat/bahan habis pakai sebaiknya steril

Makroskopis
No Parameter
1
Likuifaksi

Alat
1. Timer
2. Termometer ruangan
3. Batang pengaduk*
Optional:
1. Inkubator
2. Shaker dua dimensi
3. Spuit + jarum* no 18 (
internal 0,84 mm) atau
19 G ( internal 0,69

lutfidr@yahoo.com

Bahan
Cara pemeriksaan
1. Semen

Diamati sejak 15 setelah semen diejakulasikan

dalam wadah
Semen diletakkan pada suhu kamar (2024C) atau pada inkubator (37C)
Optional:

Sambil menunggu, sampel dengan perlahan di homogenkan menggunakan

1. Dulbeccos
batang pengaduk/memutar/menggoyang wadah semen atau menggunakan shaker
phosphatedua dimensi pada suhu kamar (2024C) atau dalam inkubator 37C.
buffered

Dilakukan pencatatan waktu antara pengeluaran semen (sesuai keterangan

saline
pasien menggunakan jam yg sama) sampai waktu semen mengalami likuifaksi
lengkap
2. Bromelain

Tampilan likuifaksi lengkap berupa semen yang homogen, hanya tersisa

(enzim

Page 4

mm)

Viskositas

1. Batang gelas*
atau
2. Pipet plastik* berlubang
besar ( 1,5 mm),
sebaiknya steril
3. Penggaris 10 cm
Optional:
1. Spuit + jarum* no 18 atau
19 G

proteolitik)
dalam
Dulbeccos
phosphatebuffered
saline

1. Semen
Optional:
1. Dulbeccos
PBS
2. Bromelain
dalam
Dulbeccos
PBS

sedikit daerah yang menggumpal, kadang mengandung butiran jeli/benang mukus

Pelaporan likuifaksi dilakukan dalam satuan menit
Bila pada 30 menit belum terjadi likuifaksi lengkap, maka pemeriksaan
selanjutnya ditunda dan di tunggu dalam 30 menit berikutnya

Bila dalam 60 menit belum juga terjadi likuifaksi lengkap maka dilakukan
pipetasi perlahan (610 kali) menggunakan syringe dengan ukuran jarum 18G atau
19G
Atau dengan penambahan:
Medium fisiologis:Dulbeccos phosphate-buffered saline dengan volume yang sama
dengan volume semen diikuti dengan pipetting
Bromelain 10 IU/ml dalam Dulbeccos phosphate-buffered saline
Catatan: Penambahan dengan medium fisiologis atau Bromelin harus diperhitungkan
ketika melakukan perhitungan konsentrasi sperma. Perlakuan-perlakuan untuk
mendapatkan likuifaksi (mengurangi viskositas) semen di atas dapat berpengaruh
pada biokimia plasma seminal, motilitas dan morfologi sperma sehingga
penggunaannya harus dilaporkan.

Dinilai setelah likuifaksi lengkap

Melakukan aspirasi perlahan menggunakan pipet plastik berlubang lebar (
1,5 mm), kemudian membiarkan semen menetes akibat gaya gravitasi

Mengukur panjangnya benang tetesan

Atau dengan cara:

Membiarkan semen menetes melalui batang gelas

Panjang benang tetesan semen dinilai/dilaporkan dalam cm

Panjang normal: < 2 cm

Metode untuk mengurangi viskositas yang abnormal dapat dilakukan dengan

cara yang sama seperti yang dilakukan pada likuifaksi abnormal.

Warna

1. Cahaya terang
2. Papan putih

1. Semen

Semen dilihat dengan latar belakang putih di tempat terang

Pelaporan: putih abu-abu/putih seperti kanji, putih kekuningan, kuning, kemerahan,
atau kecoklatan.

Bau

1. Indra penciuman yg baik

1. Semen

Dilakukan penilaian bau semen yang tercium saat pemeriksaan

Bau semen dilaporkan sebagai bau khas (bunga akasia), busuk, atau amis
Mengumpulkan semen menggunakan wadah yang sudah ditimbang/diketahui
beratnya

Volume

1. Timbangan digital
2. Gelas ukur* dgn skala

lutfidr@yahoo.com

1. Semen
dalam wadah

Page 5

ukur 0,1ml
atau
3. Pipet volume* dgn skala
ukur 0,1 ml + bola pipet

pH

1. Kertas pH, skala ukur

6,010,0,
jika ada dengan ketepatan
0,1

Menimbang wadah yang sudah berisi semen

Mengurangi berat semen dengan berat wadah
Menghitung volume semen dari berat semen dengan menganggap densitas semen
sebesar 1 g/ml (densitas semen bervariasi antara 1,0431,102 g/ml)
Atau dengan cara:
Mengumpulkan semen secara langsung ke dalam gelas ukur yang dimodifikasi
dengan mulut lebar
Membaca volume semen secara langsung dalam gelas ukur (akurasi 0,1 ml).
Catatan: Mengukur volume dengan cara aspirasi semen dari wadah semen ke dalam
pipet atau syringe, atau menuang ke dalam gelas ukur tidak direkomendasikan, karena
tidak semua sampel akan terukur sehingga volume yang terukur akan lebih rendah
(volume yang hilang antara 0,30,9 ml).
1. Semen
Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak 10 kali
dalam wadah
menggunakan pipet berlubang lebar ( 1.5 mm) secara perlahan
Meratakan 1 tetes semen pada kertas pH.
Ditunggu sampai perubahan warna yang terjadi menjadi seragam (<30 detik).
Dilakukan penilaian perubahan warna yang terjadi dengan cara mencocokkan
dengan pH standar.

*Sebaiknya steril
Mikroskopis
No Parameter/
Persiapan
1.
Pembuatan
preparat
basah

2.

Pemeriksaan
awal

Alat

Bahan

Cara pemeriksaan:

1. Pipet plastik* berlubang

besar ( 1,5 mm)
2. Mikropipet 10 l + tip
kuning*
3. Gelas objek*
4. Coverslip* 2222 mm,
ketipisan no 4 (0,44 mm)
Optional:
1. Sentrifus

1. Semen

1. Mikroskop dengan

1. Preparat
basah

Pemeriksaan dilakukan pada suhu kamar (2024C)

Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak 10 kali
menggunakan pipet berlubang lebar (diameter 1.5 mm) secara perlahan (hindari
terbentuknya gelembung udara)
Sebanyak 10l semen diletakkan di atas gelas objek
Gelas objek ditutup dengan coverslip 2222 mm (hindari terbentuknya gelembung
udara)
Membuat replikat preparat basah dengan cara yang sama.
Dilakukan pemeriksaan dengan segera preparat basah yang sudah jadi setelah semen
tidak lagi mengalir ( 1 menit).
Catatan: Homogenisasi tidak boleh menggunakan vortex (merusak spermatozoa).
Preparat basah diperiksa dengan perbesaran 100 sebagai scanning awal untuk
melihat formasi benang mukus, agregasi, aglutinasi, sel non sperma. Perbesaran

perbesaran 100400

lutfidr@yahoo.com

Page 6

(skrining)

3.

Pembuatan
preparat
basah dengan
sentrifugasi

1. Pipet plastik* berlubang

besar ( 1,5 mm)
2. Mikropipet 50 l + tip
kuning*
3. Gelas objek*
4. Coverslip* 2222 mm,
ketipisan no 4 (0,44 mm)

1. Semen

4.

Agregasi &
Aglutinasi

1. Mikroskop
2. Contoh gambar agregasi
3. Contoh gambar aglutinasi

1. Preparat basah
semen

lutfidr@yahoo.com

200400 digunakan untuk memperjelas temuan skrining awal, menilai motilitas

sperma dan untuk menentukan besar pengenceran
Pemeriksaan dimulai dengan perkiraan jumlah sperma/lapang pandang besar (LPB),
agregasi, aglutinasi dan motilitas
Jika jumlah spermatozoa pada pemeriksaan mikroskopis awal rendah (<4/LPB
(400)= 1106/ml) maka perhitungan konsentrasi sperma yang akurat mungkin
tidak diperlukan. Untuk penilaian konsentrasi sperma rendah (<2/LPB(400)=
<0,5106/ml) yang akurat, direkomendasikan untuk menggunakan semua grid
(sembilan grid) pada bilik hitung improved Neubauer atau bilik hitung
bervolume besar dengan menggunakan pemeriksaan fluoresensi.
Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak 10 kali
menggunakan pipet berlubang lebar (diameter 1.5 mm) secara perlahan (hindari
terbentuknya gelembung udara). Jika semen viskous, maka dilakukan perlakuan
untuk mengurangi viskositas seperti perlakuan pada likuifaksi semen yang
abnormal.
Sebanyak 1 ml semen diletakkan dalam tabung reaksi steril
Dilakukan sentrifugasi pada 3000g selama 15 menit
Membuang supernatan dengan menyisakan 50l
Melakukan resuspensi sedimen, kemudian sedimen dihomogenkan
10l sedimen diteteskan pada gelas objek dan tutup dengan coverslip
Membuat replikat preparat dengan cara yang sama
Dilakukan pemeriksaan preparat dengan perbesaran 100250 (WHO 2010
menyarankan perbesaran 200250)
Memeriksa seluruh lapang pandang coverslip secara sistematis (zig-zag). Dimulai
dari satu sudut dan bergerak sepanjang sumbu x sampai ke sudut seberang;
kemudian berpindah satu lapang pandang sepanjang sumbu y dan kembali
memeriksa sepanjang sumbu x sampai seluruh lapang coverslip diperiksa
Ditemukan spermatozoa pada salah satu replikat menunjukkan cryptozoospermia.
Tidak ditemukan spermatozoa pada kedua preparat menunjukkan dugaan
azoospermia.
Preparat basah diperiksa dengan perbesaran 100400
Perbesaran 100 digunakan untuk skrining awal
Perbesaran 200400 digunakan untuk memperjelas temuan awal
Memeriksa ada tidaknya agregasi atau aglutinasi
Jika agregasi banyak ditemukan, maka dilakukan evaluasi apakah likuifaksi sudah
lengkap dan apakah homogenisasi sudah dilakukan dengan baik
Hasil pemeriksaan agregasi dilaporkan sebagai positif atau negatif
Agregasi sperma yang positif dilaporkan sebagai agregasi sedikit atau banyak

Page 7

(ratusan spermatozoa yang beragregasi)

Aglutinasi dilaporkan sebagai positif atau negatif
Bila aglutinasi positif maka ditentukan bentuk dan derajat aglutinasi.
Jika aglutinasi positif disarankan untuk pemeriksaan antibodi antisperma.
5.

Motilitas

1. Mikroskop
2. Coverslip* 22 x 22
3. Spidol permanen (0,05
mm) untuk membuat
garis 5 mm pada pinggir
coverslip)
Atau
4. Eyepiece reticle
5. Gambar area baca
coverslip dan alur baca
6. Counter (hemocytometer)
7. Kriteria motilitas
progresif, nonprogresif
dan imotil
8. Tabel/grafik untuk
menentukan perbedaan
perhitungan yang dapat
diterima

lutfidr@yahoo.com

1. Preparat basah
semen

Pemeriksaan motilitas dilakukan dalam 30 menit1 jam sesudah ejakulasi

Menggunakan preparat basah segar
Pemeriksaan motilitas dilakukan setelah 1 menit dilakukan inkubasi preparat
basah (semen tidak ada lagi yang mengalir)
Menggunakan perbesaran 200 atau 400
Dilakukan pada suhu kamar (2024C) atau pada suhu 37C sesuai standarisasi tiap
laboratorium
Area baca untuk menilai motilitas sperma adalah pada > 5 mm dari pinggir
coverslip (pada bidang tengah coverslip)
Penilaian motilitas sperma pada preparat basah mengikuti alur yang sistematis dan
acak
Jika menggunakan eyepiece reticle, maka area penilaian hanya dipilih baris bagian
atas jika spermatozoa banyak (konsentrasi tinggi) atau seluruh baris jika
spermatozoa sedikit (konsentrasi rendah)
Menilai dan menghitung dengan cepat, tidak menunggu spermatozoa berenang pada
area baca. Menghitung salah satu saja, spermatozoa yang berenang keluar area baca
atau yang masuk ke dalam area baca
Hanya sperma utuh (mempunyai kepala dan ekor) yang dinilai, spermatozoa motil
kepala jarum (pinhead) tidak dinilai
Penilaian dimulai dengan bertahap; menghitung spermatozoa yang progresif (PR)
terlebih dahulu dalam 1 LP, kemudian dilanjutkan dengan menghitung spermatozoa
yang non progresif (NP) dalam LP yang sama, dan selanjutnya spermatozoa yang
imotil (IM) dalam LP yang sama
Untuk mencegah bias pada penilaian motilitas, tahapan penilaian dapat dibalik
dengan menilai IM terlebih dahulu, kemudian NP dan terakhir PR
Perhitungan jumlah tiap kategori motilitas spermatozoa dibantu dengan counter
(hemocytometer)
Penilaian motilitas spermatozoa dilakukan pada minimal 200 spermatozoa dalam
total minimal 5 lapang pandang tiap replikat
Jika perhitungan sedang pada tahap pertama atau kedua (contoh, pertama menilai
PR, kedua menilai NP dan ketiga menilai IM dalam area yang sama) dan
perhitungan mencapai 200 spermatozoa sebelum semua tingkat motilitas dinilai,
maka perhitungan harus dilanjutkan melebihi 200 spermatozoa sampai semua

Page 8

tingkat motilitas telah dinilai

Selanjutnya dilakukan penilaian motilitas sperma pada preparat replikat dari sampel
yang sama dengan cara yang sama
Menghitung rerata dan perbedaan persentase sperma hidup dari 2 preparat dengan
melihat tabel perbedaan yang dapat diterima dari hasil perhitungan rerata pada 2
preparat basah (melihat tabel/grafik)
Menentukan penerimaan perbedaan dari rerata persentase perhitungan antara 2
preparat basah dilakukan dengan cara menghitung rerata persentase sperma PR, NP
atau IM. Kriteria yang sering digunakan adalah rerata IM, dengan rumus:
Rerata imotil= Jumlah % total sperma imotil dari 2 preparat basah
2
Hasil yang didapat merupakan % rerata
Menghitung selisih jumlah persentase antara 2 preparat basah. Hasil yang didapat
merupakan batas atas perbedaan yang dapat diterima (melihat tabel/grafik)
Bila perbedaan antara 2 preparat basah dapat diterima (sesuai dengan tabel 2.1),
maka dilanjutkan dengan perhitungan hasil. Bila tidak, maka dilakukan pembuatan 2
preparat basah baru dan dilakukan penilaian ulang
Melaporkan hasil rerata persentase tiap tingkatan motilitas sperma
Pembulatan ke nilai terdekat. Ketentuan pembulatan nilai 0,5 untuk puluhan
dilakukan pembulatan ke bawah, untuk satuan dilakukan pembulatan ke atas
(contoh, 32,5% dibulatkan ke bawah menjadi 32%; tapi 3,5% dibulatkan ke atas
menjadi 4%).
Hasil dilaporkan dalam persentase ketiga tingkatan motilitas sperma.

6.

Vitalitas

a. Eosin:
1. Pipet plastik* berlubang
besar ( 1,5 mm) untuk
homogenisasi
2. Mikropipet 5 l + tip
kuning*
3. Coverslip ukuran 22mm
x 22mm
4. Minyak imersi

lutfidr@yahoo.com

1. Eosin Y
(colour index
45380)
2. NaCl 0,9%
Cara pembuatan:
Melarutkan 0,5 g
eosin Y dalam
100 ml NaCl
0,9%

Pembuatan preparat:
Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak 10 kali
menggunakan pipet berlubang lebar (diameter 1.5 mm) secara perlahan (hindari
terbentuknya gelembung udara)
Meneteskan 5 l semen dan 5 l larutan eosin 0,5% pada objek gelas
Mencampur 5 l semen dan larutan eosin 0,5% menggunakan tip pipet dengan
gerakan melingkar
Menutup campuran dengan coverslip ukuran 22mm 22mm
Sediaan diinkubasi selama 30 detik
Membuat preparat replikat/duplikat dengan cara yang sama

Page 9

Atau dengan cara:

Setelah dilakukan homogenisasi, selanjutnya dilakukan pencampuran 5 l semen
dan 5 l larutan eosin 0,5% pada objek gelas
Melakukan inkubasi selama 1 menit
Membuat apusan seperti membuat apus darah tepi
Membiarkan preparat kering di udara
Membuat replikat preparat
Preparat dapat diperiksa menggunakan minyak imersi, perbesaran 1000.
Cara pemeriksaan vitalitas:
Dilakukan perhitungan jumlah spermatozoa yang terwarnai (mati) dan tidak
terwarnai (hidup) menggunakan counter. Menghitung 200 spermatozoa tiap
preparat. Spermatozoa mati akan berwarna pink tua/merah, spermatozoa hidup
berwarna putih
Membaca masing-masing preparat, sebaiknya menggunakan optik fase kontras
negatif (fase kontras positif membuat warna merah muda sulit dilihat) pada
perbesaran 200 atau 400
Menghitung rerata dan perbedaan persentase sperma hidup dari 2 preparat
Menentukan apakah perbedaan dapat diterima; Jika perbedaan dapat diterima, maka
dilaporkan persentase sperma hidup; Jika perbedaan tidak dapat diterima maka
dilakukan pembuatan 2 preparat baru dan melakukan pemeriksaan ulang
Persentase sperma mati tidak boleh melebihi persentase sperma imotil, jika keadaan
ini terjadi maka dilakukan pemeriksaan ulang, bila perlu dengan menggunakan 2
preparat baru; Persentase sperma hidup umumnya lebih banyak dibandingkan
dengan sperma motil. Hasil pemeriksaan dilaporkan dalam persentase rerata sperma
hidup yang digenapkan ke angka terdekat.

b. Eosinnigrosin:
1. Pipet plastik* berlubang
besar ( 1,5 mm) untuk
homogenisasi
2. Mikropipet 50 l + tip
kuning*
3. Minyak imersi
4. Porcelain spot plate well

lutfidr@yahoo.com

1. Eosin Y
(colour index
45380)
3. NaCl 0,9%
2. Nigrosin
(colour index
50420)

Cara pembuatan eosin-nigrosin:

Melarutkan 0,67 g eosin Y dalam 100 ml NaCl 0,9%
Menambahkan 10 g nigrosin dalam 100 ml larutan eosin Y
Mendidihkan suspensi campuran, kemudian membiarkan dingin dalam temperatur
kamar
Menyaring menggunakan kertas saring ( 90 g/m2)
Menyimpan pada botol gelas hitam tertutup rapat.

Page 10

c.
1.
2.
3.
7.

Konsentrasi

atau test-tube
Hypotonic swelling:
Freezer 20 C
Tabung mikrosentrifus
Inkubator

1. Refrigerator 28 C
2. Termometer ruangan
3. Kertas saring (saringan
0,45 mikron)
4. Gambar ketentuan
spermatozoa yg dihitung
5. Improved Neubauer
6. Mikropipet 10l
7. Coverslip* 2222 mm,
ketipisan no 4 (0,44 mm)
8. Tip kuning
9. Tabung reaksi
10. Cawan petri + tutup
11. Timer
12. Counter
13. Kalkulator
14. Alat tulis
15. Tabel/grafik perbedaan
perhitungan konsentrasi
yg dpt diterima
16. Tabel perkiraan
kesalahan pemeriksaan
(sampling error)
Optional:
1. Coverslip ukuran 24
mm 50 mm
2. Mikropipet 40l atau
20l

lutfidr@yahoo.com

1. Swelling
solution;
2. Akuades

1. Semen
2. Reagen
sebagai
larutan
pengencer

Cara pembuatan Swelling solution:

0.735 g sodium citrate dihydrate + 1.351 g of D-fructose dalam 100 ml akuades,
kemudian bekukan 1 ml larutan pada 20 C
Untuk penggunaan: solusi 1 ml dicairkan pada inkubator suhu 37C selama 530
menit, kemudian diencerkan dengan akuades 1 + 1 (1:2).
Tahapan pemeriksaan konsentrasi sperma:
Menentukan besarnya pengenceran menggunakan preparat basah yang digunakan
pada pemeriksaan motilitas
Mencampur semen dengan larutan pengencer
Mengisi bilik hitung dan membiarkan spermatozoa mengendap pada suasana
lembab
Menilai sampel dalam 1015 menit (mencegah pengaruh penguapan pada posisi
spermatozoa dalam bilik hitung)
Menghitung minimal 200 spermatozoa per replikat (total 400) dengan
memperhatikan ketentuan spermatozoa yg dihitung pada bilik hitung
Membandingkan perhitungan replikat untuk menentukan apakah perhitungan
dapat diterima atau tidak. Jika perhitungan dapat diterima maka dilanjutkan
dengan perhitungan konsentrasi spermatozoa per mililiter; jika tidak maka
dilakukan pembuatan preparat baru.
Perhitungan konsentrasi spermatozoa per mililiter.
Perhitungan jumlah total spermatozoa per ejakulasi.
a.
Persiapan reagen sebagai larutan pengencer
Melarutkan 50 g sodium bikarbonat (NaHCO3) dan 10 ml formalin 35% (v/v) dalam
1000 ml akuades
Bila perlu dapat ditambahkan 5 ml gentian violet jenuh (>4mg/ml) untuk
memperjelas kepala spermatozoa
Menyimpan reagen pada suhu 4C. Bila terbentuk kristal pada larutan, maka
dilakukan penyaringan reagen dengan kertas saring (saringan 0,45 mikron) sebelum
digunakan.
b. Melakukan pengenceran menggunakan larutan pengencer sesuai ketentuan
pada tabel.
Jika ditemukan terlalu sedikit spermatozoa per lapang pada pengenceran yang
direkomendasikan, maka dilakukan pembuatan preparat baru dengan pengenceran
yang lebih rendah
Jika ditemukan terlalu banyak spermatozoa yang tumpang tindih per lapang

Page 11

pandang pada pengenceran yang direkomendasikan, maka dilakukan pembuatan

preparat baru dengan pengenceran yang lebih tingg
Jika pengenceran 1 + 19 (1:20) tidak memadai (banyak ditemukan spermatozoa
yang tumpang tindih), maka digunakan pengenceran 1 + 49 (1:50).
c.
Cara melakukan pengenceran
Mempersiapkan 2 tabung reaksi berisi larutan pengencer (sesuai pengenceran yang
digunakan)
Semen dihomogenkan dengan baik menggunakan cara seperti yang telah dijelaskan
sebelumnya
Segera melakukan aspirasi sejumlah volume semen (sesuai pengenceran)
Menyeka bagian luar tip pipet semen (tidak mengenai lubang pipet)
Memasukkan semen ke dalam tabung berisi larutan pengencer dan melakukan
aspirasi laruran pengencer untuk membilas tip pipet
Melakukan tindakan yang sama untuk membuat replikat pengenceran
d.
Cara mengisi bilik hitung improved Neubauer
Menggunakan bilik hitung yang bersih dan bebas sisa sampel dari penggunaan
sebelumnya
Mengaduk campuran semen dengan pengencer yang sudah dibuat menggunakan
vortex selama 10 detik pada kecepatan maksimal, kemudian segera mengaspirasi
10l campuran
Menyentuhkan ujung tip pipet dengan hati-hati pada tepi bawah lekukan
berbentuk huruf V pada salah satu sisi bilik hitung
Menekan mikropipet dengan perlahan, untuk membiarkan bilik hitung terisi oleh
gaya kapiler. Coverslip tidak boleh bergerak saat mengisi semen, dan bilik hitung
tidak boleh diisi berlebihan (dapat ditandai dengan coverslip yang bergerak) atau
kurang (ditandai dengan udara yang menempati beberapa daerah bilik hitung).
Melakukan cara yang sama pada replikat pengenceran kedua (mengisi sisi seberang
bilik hitung)
Melakukan inkubasi preparat minimal 4 menit pada suhu kamar dalam suasana
lembab (contohnya diletakkan di atas kertas saring yang basah dalam cawan petri
tertutup). Pemeriksaan dilakukan dalam 510 menit.
e.
Cara mengisi bilik hitung improved Neubauer
Menggunakan bilik hitung yang bersih dan bebas sisa sampel dari penggunaan
sebelumnya

lutfidr@yahoo.com

Page 12

Menyiapkan bilik hitung dengan coverslip. Cara mempersiapkan bilik hitung

dengan coverslip; membuat permukaan bilik hitung sedikit lembab dengan
menghembuskan nafas pada bilik hitung, kemudian mengunci/menempatkan
coverslip pada ruang penghitungan dengan menekan kuat kedua bagian pilar
(pinggir) ruang penghitungan). Terbentuknya warna seperti pelangi
(iridescence atau beberapa cincin Newton) antara dua permukaan kaca
menunjukkan posisi yang benar dari coverslip. Semakin banyak baris seperti
pelangi terbentuk, menunjukkan posisi coverslip semakin baik; jika hanya satu
atau dua baris mungkin menunjukkan masalah pada variasi kedalaman ruang.
Mengaduk campuran semen dengan pengencer yang sudah dibuat menggunakan
vortex selama 10 detik pada kecepatan maksimal, kemudian segera mengaspirasi
10l campuran
Menyentuhkan ujung tip pipet dengan hati-hati pada tepi bawah lekukan
berbentuk huruf V pada salah satu sisi bilik hitung
Menekan mikropipet dengan perlahan, untuk membiarkan bilik hitung terisi oleh
gaya kapiler. Coverslip tidak boleh bergerak saat mengisi semen, dan bilik hitung
tidak boleh diisi berlebihan (dapat ditandai dengan coverslip yang bergerak) atau
kurang (ditandai dengan udara yang menempati beberapa daerah bilik hitung)
Melakukan cara yang sama pada replikat pengenceran kedua (mengisi sisi seberang
bilik hitung)
Melakukan inkubasi preparat selama 1015 menit pada suhu kamar dalam suasana
lembab (contohnya diletakkan di atas kertas saring yang basah dalam cawan petri
tertutup).
f. Cara Pemeriksaan
Menggunakan bilik hitung dengan mikroskop perbesaran 200 atau 400
Memeriksa minimal 200 spermatozoa per preparat jika dapat, dengan menyesuaikan
area pemu sisi eriksaan yang digunakan.
Pertama: Memeriksa bagian sentral grid (nomor 5) pada satu sisi bilik hitung, baris
demi baris
Melanjutkan perhitungan sampai minimal 200 spermatozoa telah diperiksa.
Perhitungan harus dilakukan pada baris secara sempurna, tidak boleh berhenti pada
pertengahan baris. Jika spermatozoa tidak ditemukan pada 5 baris dalam grid
sentral, maka perhitungan dilanjutkan pada baris (terdiri dari 4 kotak besar) dalam 2
grid tambahan yaitu grid 4 dan 6.
Mencatat jumlah baris yang digunakan pada perhitungan minimal 200 spermatozoa,
jumlah baris yang sama akan digunakan untuk menilai spermatozoa pada replikat
(sisi seberang bilik hitung).

lutfidr@yahoo.com

Page 13

Perhitungan dilakukan menggunakan alat bantu hitung

Hanya sperma utuh (dengan kepala dan ekor) yang dihitung, sperma kepala jarum
(pinhead/free tail) tidak dihitung.
Jika banyak ditemukan spermatozoa dengan bentuk pinheads atau free tail hasil
dilaporkan sebagai catatan tambahan. Perhitungan dapat menggunakan preparat
yang digunakan pada pemeriksaan morfologi sebagai persentase relatif terhadap
spermatozoa normal.
Beralih ke ruang perhitungan sisi kedua/seberang bilik hitung untuk
melakukan perhitungan replikasi dengan menggunakan jumlah baris yang
sama (volume yang sama) seperti pada preparat pertama, walaupun pada
perhitungan kedua ini menghasilkan kurang dari 200 spermatozoa.
Menghitung jumlah total spermatozoa dari kedua preparat.
Menghitung selisih/perbedaan dari 2 perhitungan kedua preparat.
Menilai apakah perhitungan dapat diterima atau tidak dengan ketentuan seperti
tercantum dalam tabel.
Jika perbedaan dapat diterima, selanjut dilakukan perhitungan konsentrasi
spermatozoa/ml dengan menggunakan rumus kalkulasi.
g. Rumus kalkulasi konsentrasi sperma/ml:
C = (N/n) (1/20) faktor pengenceran 106/ml semen
Keterangan:
C= konsentrasi sperma
N= Jumlah spermatozoa
n = jumlah baris
Pelaporan dilakukan dalam satuan per ml (106/ml) atau per nl.
h.
Kalkulasi konsentrasi sperma/ejakulat. Setelah konsentrasi spermatozoa/ml
didapat, selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah spermatozoa/ejakulat dengan
mengalikan nilai konsentrasi spermatozoa dengan volume ejakulat. Pelaporan
dilakukan sebagai jumlah spermatozoa 106/ejakulat
i.
Perkiraan kesalahan pemeriksaan (sampling error). Presisi dari perkiraan
jumlah sperma tergantung pada jumlah spermatozoa yang terhitung. Menurut
distribusi Poisson, standard error (SE) dari perhitungan (N) adalah akar kuadrat N
(N) dan confidence interval (CI) untuk jumlah spermatozoa dalam volume semen
adalah sekitar N 1.96 N (atau N sekitar 2 N). Perkiraan kesalahan
pemeriksaan dapat diekspresikan dalam persentase kesalahan perhitungan
(100(N/N), dapat dilihat pada tabel perkiraan kesalahan pemeriksaan dengan
membulatkan jumlah total spermatozoa yang terhitung dari kedua preparat ke nilai
terdekat.

lutfidr@yahoo.com

Page 14

8.

Pada keadaan
konsentrasi
rendah atau
tidak
ditemukan
spermatozoa

9.

Pembuatan
preparat
basah dengan
sentrifugasi

1. Pipet plastik* berlubang

besar ( 1,5 mm)
2. Mikropipet 50 l + tip
kuning*
3. Gelas objek*
4. Coverslip* 2222 mm,
ketipisan no 4 (0,44 mm)

lutfidr@yahoo.com

2. Semen

Jika perkiraan jumlah sperma rendah/LPB

1. Jika perhitungan yang akurat tidak diperlukan
Jika jumlah spermatozoa per LPB pada pemeriksaan awal preparat basah rendah
(04/LP 400 atau 016/200), dapat dilakukan beberapa pilihan tindakan:
a. Tidak mengambil tindakan lebih lanjut
Jika jumlah spermatozoa/LP 400 < 4 (yaitu< 1106/ml), maka cukup untuk
sebagian besar tujuan klinis untuk melaporkan konsentrasi sperma sebagai <2
106/ml (dengan memperhitungkan kesalahan perhitungan yang tinggi berhubungan
dengan jumlah sperma yang rendah), dengan catatan, apakah ditemukan atau tidak
spermatozoa yang motil.
b. Memeriksa semen yang telah disentrifus untuk menemukan spermatozoa
Jika tidak ditemukan spermatozoa pada kedua preparat basah maka dilakukan:
Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak 10 kali
menggunakan pipet berlubang lebar (diameter 1.5 mm) secara perlahan (hindari
terbentuknya gelembung udara). Jika semen viskous, maka dilakukan perlakuan
untuk mengurangi viskositas seperti perlakuan pada likuifaksi semen yang
abnormal.
Sebanyak 1 ml semen diletakkan dalam tabung reaksi steril
Dilakukan sentrifugasi pada 3000g selama 15 menit
Membuang supernatan dengan menyisakan 50l
Melakukan resuspensi sedimen, kemudian sedimen dihomogenkan
10l sedimen diteteskan pada gelas objek dan tutup dengan coverslip
Membuat replikat preparat dengan cara yang sama
Dilakukan pemeriksaan preparat dengan perbesaran 100250 (WHO 2010
menyarankan perbesaran 200250)
Memeriksa seluruh lapang pandang coverslip secara sistematis (zig-zag). Dimulai
dari satu sudut dan bergerak sepanjang sumbu x sampai ke sudut seberang;
kemudian berpindah satu lapang pandang sepanjang sumbu y dan kembali
memeriksa sepanjang sumbu x sampai seluruh lapang coverslip diperiksa
Ditemukan spermatozoa pada salah satu replikat menunjukkan cryptozoospermia.
Tidak ditemukan spermatozoa pada kedua preparat menunjukkan dugaan
azoospermia.
Catatan: Jika sentrifugasi sampel untuk tujuan teknologi bantuan reproduksi,
maka seluruh sampel semen dalam sedimen (misalnya empat 10L aliquot
sedimen) dapat dianalisis untuk menemukan spermatozoa hidup. Tidak
ditemukan spermatozoa motil dari aliquot yang diperiksa tidak berarti bahwa

Page 15

tidak ditemukan spermatozoa motil pada sisa sampel. Karena sentrifugasi tidak
membuat semua spermatozoa membentuk sedimen, maka metode ini tidak dapat
digunakan untuk menentukan jumlah total spermatozoa.

10.

Morfologi

1. Objek glass
2. Mikropipet 10l, 200 l,
500 l + tip
3. Pipet plastik* berlubang

lutfidr@yahoo.com

c. Memeriksa sampel yg tidak disentrifugasi untuk mencari spermatozoa motil

Jika spermatozoa motil sangat dicari (seperti pada sampel semen pascavasektomi),
Mengencerkan spesimen pada larutan pengencer atau sentrifugasi kecepatan tinggi
pada spermatozoa harus dihindari. Pada kasus ini dilakukan pemeriksaan
menggunakan satu aliquot sampel yang tidak diencerkan, dengan cara:
Menghomogenkan semen dengan baik
Mengambil 40 l aliquot semen dan menempatkan di bawah coverslip ukuran 24
mm 50 mm
Memeriksa slide dengan perbesaran 200 atau 250
Memeriksa seluruh lapang coverslip secara sistematis,lapang demi lapang. Mulai
dari satu ujung dan bergerak sepanjang sumbu x ujung seberang, kemudian
berpindah satu lapang pandang searah sumbu y dan memeriksa kembali sepanjang
sumbu x. Pemeriksaan menggunakan cara zig-zag ini dilakukan pada seluruh lapang
slide.
2. Jika perhitungan yang akurat diperlukan
Digunakan untuk menentukan konsentrasi spermatozoa yang rendah tanpa sentrifugasi
dengan menggunakan pengenceran yang rendah dan memeriksa volume yang lebih
banyak. Pilihan yang dapat digunakan:
a. Menggunakan bilik hitung improved Neubauer
Untuk mengurangi kesalahan pemeriksaan (sampling errors), sebaiknya menghitung
minimal total 400 spermatozoa dari 2 replikat (200/replikat). Cara pemeriksaan:
Menghomogenkan semen dengan baik
Mengambil satu aliquot semen dan mengencerkan 1 + 1 (1:2) dengan pengencer
Memeriksa semua grid (9 grid) improved Neubauer
Selanjutnya pemeriksaan dilakukan dengan cara yang sama seperti pada perhitungan
konsentrasi spermatozoa secara umum
Catatan: Tidak ditemukan spermatozoa dari aliquot yang diperiksa tidak menunjukkan
bahwa tidak ditemukan spermatozoa pada sisa sampel.
b. Menggunakan bilik hitung volume besar secara fluoresensi. Membutuhkan
mikroskop fluoresensi dan pewarna Hoechst 33342 bisbenzimide fluorochrome.
1. Methanol 95% a. Membuat preparat apus sperma
2. NaCl
Membersihkan objek gelas dengan methanol 95%
fisiologis
Meneteskan 10l semen pada objek gelas
3. Reagen DiffCara membuat apusan dapat menggunakan metode seperti membuat preparat apus

Page 16

besar ( 1,5 mm),

sebaiknya steril
4. Termometer ruangan
5. Gelas ukur skala 0,1
6. Sentrifus 800g
7. Timer
8. Tabung reaksi dengan
batas 2040l
9. Pipet Pasteur
10.Gambar pembuatan
preparat apus semen yg
tidak dicuci dan yg dicuci
11.

Pewarnaan
cepat
Diff-Quik

12.

Pewarnaan
Shorr

lutfidr@yahoo.com

Quik
4. Reagen Shorr
5. Reagen
Papanicolaou

darah tepi untuk semen yang tidak diencerkan atau dengan menggunakan metode
pipet untuk preparat yang diencerkan/dicuci
Membiarkan kering pada suhu kamar (2024C)
Membuat replikat preparat dengan cara yang sama

b. Pencucian semen
Mengencerkan 0,20,5 ml tergantung dari konsentrasi semen dengan 10 ml NaCl
fisiologis pada suhu kamar
Melakukan sentrifugasi pada 800g selama 10 menit
Membuang sebagian supernatan dengan menyisakan sekitar 2040l
Melakukan resuspensi sedimen dengan supernatan dengan pipetting perlahan
Meletakkan 510 l suspensi sperma pada slide
Membuat apusan dengan menggunakan pipet Pasteur seperti terlihat pada gambar
Kit pewarna Diff- c. Pewarnaan
Quik:
Pembuatan reagen Diff-Quik:
1. 1,8
1. Pembuatan reagen fiksatif (1,8 triarylmethan dilarutkan dalam 1000 ml
triarylmethan
metanol 95% (v/v)) atau hanya metanol 95 % (v/v) saja
2. Metanol 95%
2. Larutan pewarna 1 (eosinophilic xanthene)
3. Larutan pewarna 2 (basophilic thiazine)
3. Larutan
pewarna 1
Cara pewarnaan:
(eosinophilic
Melakukan fiksasi preparat dengan merendam ke dalam larutan fiksatif
xanthene)
triarylmethane selama 15 detik atau selama 1 jam dalam metanol 95%)
4. Larutan
Membuang kelebihan larutan fiksatif dengan menempatkan preparat
pewarna 2
vertikal di atas kertas saring
(basophilic
Melakukan pewarnaan dengan merendam preparat untuk kedua kalinya dalam:
thiazine)
Larutan pewarna 1 selama 10 detik
Selanjutnya dalam larutan pewarna 2 selama 5 detik
Membilas preparat dengan air bersih 15 kali untuk membuang kelebihan
zat warna
Mengeringkan kelebihan larutan pada tiap langkah di atas dengan
menempatkan preparat secara vertikal pada kertas saring.
Jika latar belakang kotor, maka diperlukan pencucian sebagian semen dan
dibuat preparat baru dengan cara pewarnaan yang sama.
1. Harris
Cara pembuatan reagen:
haematoxylin:
1. Shorr solution:
Papanicolaou No1
Melarutkan 4 gr serbuk Shorr dalam 220 ml etanol panas 50% (v/v). Biarkan
2. Shorr solution
dingin, kemudian tambahkan 2.0 ml asam asetat glasial (dilakukan dalam lemari

Page 17

3. Asam etanol
4. Ammoniacal
ethanol

13.

Pewarnaan
Papanicolaou

lutfidr@yahoo.com

1. Komponenkomponen
pewarnaan
Papanicolaou
2.Asam etanol
3.
Xylene:et
anol, 1+1 (1:2)

asam) kemudian disaring

2. Asam etanol:
Menambahkan 25 ml asam asetat glasial ke dalam 75 ml etanol 95% (v/v)
3. Ammoniacal ethanol:
Menambahkan 5ml amonium hidroksida 25%(v/v) ke dalam 95ml etanol 75%(v/v)
Tahapan pewarnaan:
a. Fiksasi preparat apus semen kering
Merendam preparat apus dalam asam etanol atau etanol 75% (v/v) selama 1 jam
b. Pewarnaan
Merendam secara bertahap preparat apus dalam
1. Air kran bersih 1215 celupan*
2. Haematoxylin 12 menit
3. Air kran bersih 1215 celupan*
4. Ammoniacal ethanol 10 celupan*
5. Air kran bersih 1215 celupan*
6. Etanol 50% (v/v) 5 menit
7. Shorr stain 35 menit
8. Etanol 50% (v/v) 5 menit
9. Etanol 75% (v/v) 5 menit
10. Etanol 95% (v/v) 5 menit
*Satu celupan= merendam 1 detik
Prosedur pewarnaan membutuhkan waktu sekitar 1,5 jam
Tahapan pewarnaan:
a. Fiksasi preparat apus semen kering
Merendam preparat apus dalam asam etanol 95% (v/v) selama 15 menit
b. Pewarnaan
Merendam secara bertahap preparat apus dalam
1. Etanol 80% (v/v) 30 detik
2. Etanol 50% (v/v) 30 detik
3. Akuades 30 detik
4. Harriss haematoxylin 4 menit
5. Akuades 30 detik
6. Asam etanol 48 celupan*
7. Air kran dingin 5 menit
8. Etanol 50% (v/v) 30 detik
9. Etanol 80% (v/v) 30 detik

Page 18

10. Etanol 95% (v/v) minimal 15 menit

11. G-6 orange stain 1 menit
12. Etanol 95% (v/v) 30 detik
13. Etanol 95% (v/v) 30 detik
14. Etanol 95% (v/v) 30 detik
15. EA-50 green stain 1 menit
16. Etanol 95% (v/v) 30 detik
17. Etanol 95% (v/v) 30 detik
18. Etanol 100% 15 detik
19. Etanol 100% 15 detik
*Satu celupan= merendam 1 detik
Prosedur pewarnaan membutuhkan waktu sekitar 1 jam
Catatan: Metode pewarnaan cepat dengan cara meneteskan semen pada slide yang sudah ditambahkan larutan fiksatif dan pewarna yang tersedia secara
komersial tidak direkomendasikan oleh panduan WHO 2010. Hal ini disebabkan karena tidak dilakukan penyebaran spermatozoa seperti yang dilakukan
pada teknik apus, sehingga tidak dapat mengamati rincian yang diperlukan untuk mengklasifikasikan morfologi seperti yang dijelaskan oleh panduan
WHO tahun 2010.
14. Sel
Preparat basah,
Sel bulat (sel-sel germinal dan leukosit) dapat diperkirakan dengan pemeriksaan
1. Termometer ruangan
nonsperma
preparat
menggunakan preparat yang digunakan dalam pemeriksaan konsentrasi sperma
2. Gambar hasil
(sel bulat)
vitalitas,
(preparat basah), vitalitas, morfologi, atau menggunakan preparat yang
pemeriksaan sel bulat
preparat
digunakan dalam pemeriksaan sel positif peroksidase. Cara perhitungan sel bulat:
3. Improved Neubauer*
morfologi,
atau
Memeriksa preparat dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400
4. Mikropipet berbagai
preparat
Menghitung jumlah sel bulat yang terdiri dari leukosit dan germ sel per 200 sperma
ukuran
peroksidase
Melakukan perhitungan dengan menggunakan rumus:
5. Tip* kuning dan biru
C = NS/200
6. Timer
Keterangan:
7. Timbangan digital
C = Jumlah atau konsentasi sel bulat dalam 106/ml.
5. Pipet plastik* berlubang
N = Jumlah sel bulat (leukosit dan/atau sel germinal).
besar ( 1,5 mm)
S = Jumlah sperma atau konsentrasi sperma dalam 106/ml.
6. Gelas objek*
Jika tidak ditemukan sel bulat dalam keseluruhan preparat maka dilaporkan sebagai
8. Coverslip*
sel bulat <3700 sel/ml
9. Counter
Jika konsentrasi sel bulat >106/ml, maka diperlukan pemeriksaan peroksidase
10. Kalkulator & alat tulis
sebagai konfirmasi terdapatnya sel leukosit
15.

Peroksidase
leukosit

Seperti pada perhitungan sel

bulat dengan tambahan:
1. Gambar hasil
pemeriksaan peroksidase
2. Tabel/grafik perbedaan
perhitungan sel

lutfidr@yahoo.com

1.Ortho-toluidine
(karsinogenik)
2.Saline 0,9%
3.Phosphate
buffer
4.Sodium

Cara pembuatan reagen:

1. Phosphate buffer, 67 mmol/l, pH 6.0: Melarutkan 9.47 g sodium hydrogen
phosphate (Na2HPO4) dalam 1000 ml akuades dan 9.08 g potassium dihydrogen
phosphate (KH2PO4) dalam 1000 ml akuades. Menambahkan 12 ml larutan
Na2HPO4 ke dalam 88 ml larutan KH2PO4 sampai pH mencapai 6,0.
2. Larutan amonium klorid (NH4Cl) jenuh: Menambahkan 250 g NH4Cl ke dalam

Page 19

peroksidase yg dpt
diterima

lutfidr@yahoo.com

hydrogen
phosphate
(Na2HPO4)
5.Akuades
6.Potassium
dihydrogen
phosphate
(KH2PO4)
7.Amonium
klorid (NH4Cl)
8.Disodium
ethylenediamin
e tetra-acetic
acid
(Na2EDTA)
9.Hidrogen
peroksida
(H2O2) 30%

1000 ml akuades.
3. Disodium ethylenediamine tetra-acetic acid (Na2EDTA) 148 mmol/l: Melarutkan
50 g/l Na2EDTA dalam phosphate buffer (pH 6.0).
4. Substrat: Melarutkan 2,5 mg o-toluidine dalam 10 ml saline 0,9% (9 g/l).
5. Hidrogen peroksida (H2O2 ) 30% (v/v).
6. Working solution: Menambahkan 1 ml larutan NH4Cl jenuh, 1 ml Na2EDTA 148
mmol/l, dan 10l H2O2 30% (v/v) ke dalam 9 ml substrat o-toluidine kemudian
campur dengan baik.
Larutan ini dapat digunakan sampai 24 jam setelah pembuatan.

Cara pemeriksaan peroksidase:

Menghomogenkan semen dengan baik
Mencampur 0,1 ml semen dengan 0,9 ml ortho-toluidine (pengenceran 1:10)
Menghomogenkan suspensi semen selama 10 detik
Menginkubasi suspensi semen dalam suhu kamar selama 2030 menit
Menghomogenkan kembali suspensi semen kemudian mengisi kedua sisi bilik
hitung dengan suspensi semen
Menempatkan bilik hitung pada posisi horizontal selama paling sedikit 4 menit
dalam suhu kamar dalam ruangan lembab (contoh, di atas kertas saring yang
dibasahi dengan air dalam cawan petri)
Memeriksa preparat dengan perbesaran 200 atau 400
Menghitung paling sedikit 200 sel positif peroksidase pada tiap sisi bilik
hitung/replikat. Sel peroksidase positif berwarna coklat, sedangkan sel peroksidase
negatif tidak berwarna (gambar 2.14). Memeriksa satu sisi bilik hitung dilakukan
pada masing-masing grid satu demi satu sampai didapatkan paling sedikit 200 sel
positif peroksidase dan grid diperiksa dengan sempurna (tidak berhenti pada
sebagian grid).
Mencatat jumlah grid yang diperiksa ketika perhitungan mencapai 200 sel
peroksidase positif
Jumlah grid yang sama digunakan untuk menghitung sel peroksidase positif pada
bilik hitung sisi lain/replikat
Menghitung bilik hitung replikat dengan menggunakan jumlah grid yang sama yang
digunakan pada pemeriksaan pertama, meskipun didapatkan perhitungan sel
peroksidase positif kurang dari 200
Menghitung jumlah total sel peroksidase positif dan menghitung perbedaan antara
dua perhitungan

Page 20

16.

Sel
nonsperma
lain.
*Sebaiknya steril

lutfidr@yahoo.com

Menentukan perbedaan dapat diterima atau tidak

Jika perbedaan dapat diterima, maka dilanjutkan dengan menghitung konsentrasi sel
peroksidase positif
Jika perbedaan tidak dapat diterima maka dilakukan pembuatan dua preparat baru
dan perhitungan ulang secara replikat
Melaporkan rerata konsentrasi sel peroksidase positif
Menghitung jumlah total sel peroksidase positif per ejakulat
Eritrosit, epitel saluran genitourinarius, bakteri dan jamur dapat diperiksa
menggunakan perbesaran 400 pada preparat basah atau preparat apus dan dilaporkan
tersendiri.

Page 21