PCR-RFLP

(PCR-Restriction
Fragment length
Polymorphism)

Polimorfisme: perbedaan urutan DNA pada

individu atau populasi yang tidak
mempengaruhi fenotipe.
Umumnya pada daerah bukan pengode
protein.

PCR-RFLP

Merupakan
suatu
metode
yang
berdasarkan pada pemotongan enzim
restriksi di sisi pengenalan enzim restriksi
pada templat DNA
Sisi restriksi ini dapat terbentuk pada
templat DNA normal atau templat DNA
yang
termutasi
dimana
mutasi
menciptakan suatu sisi pengenalan untuk
enzim restriksi tertentu.

PCR-RLFP merupakan marker DNA yang

paling awal dikembangkan yang diperantarai
oleh penemuan enzim restriksi.
Spesifitas enzim restriksi akan memotong
DNA sesuai dengan targetnya.
Perbedaan genetik antar kromosom (individu)
akan memberi panjang fragmen DNA hasil
pemotongan enzim restriksi yang berbeda
pula. Sehingga panjang fragmen yang
dihasilkan dari pemotongan enzim restriksi
menunjukkan diversitas gen yang ada.

 Teknik

ini dapat digunakan untuk

aplikasi data polimorfisme dalam
studi antropologi molekul, untuk
kebutuhan forensik untuk
mengetahui hubungan antar
individu, dan untuk upaya
mendefinisikan mutasi yang
berkaitan dengan penyakit.

Prinsip RFLP
A

A
Alele1

X
A

Alele 2

B
Enzim A
1
2

Enzim B
1
2

BM

Restriction Enzyme Types

At present, three different types of restrictionmodification systems are known-types I, II, and
III. Each system consists of two distinct enzyme
activities: a DNA methylase and an endonuclease
that catalyzes a double-strand DNA break. The
type II sequence-specific endonucleases are the
most widely used ones in molecular biology.

Properties of each of the three types of

restriction systems

 Enzim

restriksi tipe II: enzim yang

mengenali urutan tertentu dari DNA
dan memotong DNA pada tempat
yang spesifik.
Satuan: Unit/ul
Satu unit biasanya didefenisikan
jumlah enzim yang dapat memotong
1ug DNA tertentu.
Reaksi berlangsung dengan bantuan
buffer yang sesuai.

Restriksi dan Ligasi DNA

Pemotongan DNA dengan
enzim restriksi:
5- NNNGAATTCNNN -3
3- NNNCTTAAGNNN -5
EcoRI
5- NNNG
3- NNNCTTAA

AATTCNNN -3
GNNN -5

Sisi pengenalan enzim

restriksi:
Urutan nukleotida rantai
atas = Urutan nukleotida
rantai bawah

Penyambungan DNA dengan

ligase
5- NNNGOH
3- NNNCTTAAP

AATTCNNN -3
OHGNNN -5

ligase
5- NNNGAATTCNNN -3
3- NNNCTTAAGNNN -5

PCR-RFLP

Untuk Analisis Penyakit

ANALISIS MUTASI
DENGAN METODE PCR-RFLP

Contoh Soal

Identifikasi mutasi heteroplasmi A3243G

gen tRNALeu dengan enzim restriksi ApaI.
Sisi restriksi enzim tsb adalah G/GGCCC,
sedangkan gen normal mempunyai urutan
GAGCCC. Setelah diamplifikasi dengan
primer D1/D2, kemudian direstriksi dengan
enzim ApaI.
D1: AAC GTT GGG GCC TTT GCG TA (3.4233.404)
D2: AGG ACA AGA GAA ATA AGG CC (3.1303.149)
Tentukan pola restriksi dan karakterisasi?

PCR-RFLP
3

5
3130

3149

3423

3404

5
PCR

3423

3130

294 pb gen tRNAleu

Restriksi dengan enzim ApaI

5
3

112 pb

3
5

5
3

182 pb

3
5

294 bp
182 bp
112 bp

Mutasi Heteroplasmi A3243G