Lap.

Mikroteknik
TINJAUAN PUSTAKA
Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena
hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara
mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen
jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat
dengan metode paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah
metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent,
baik pada tumbuhan ataupun pada hewan.
Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode parafin
melalui beberapa tahapan, yaitu:
A. Pembiusan (Narcose)
Pembiusan merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan
yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada
hewan. Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati
adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-kelenjar(endokrinologi), karena
mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di
dalamnya.
Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah:
1. Eter, biasanya digunakan untuk membius tikus, kelinci, marmut, dan anjing
2. Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera.
Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain,
aseton- CHCl3, Morfin HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan
garam magnesium.
B. Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting)
Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari
sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan
sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan
pengambilan diperlukan proses pencucian (washing).
Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin
hewan dengan tumbuhan. Percobaan ini perlu dilakukan karena jaringan yang
diambil pada hewan dengan tumbuhan.pencucian ini perlu dilakukan karena
jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keaadaan kotor oleh darah
atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih
cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat
mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara.
Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam
fisiologis. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai:
1. NaCl 0.8-0.9%
2. Larutan Ringer, dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin.
Komposisi larutan ringer adalah:
o NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas.
o NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin.
NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam

waktu 15 menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena
akan menyebabkan pembengkakan sel.
Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut:
1. objek yang diambil dalam kondisi sehat
2. objek yang diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan
3. menggunakan pisau yang tajam
4. ukuran jaringan yang diambil kurang lebih 0.5 cm
5. langsung dicuci dan difiksasi.
C. Fiksasi (Fixation)
Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau
jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan
bentuk maupun ukuran.. media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan
fiksatif. Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan
atau gas yang berfungsi agar Jaringan tidak membusuk, dan dapat
mempertahankan struktur jaringan.
Fiksatif yang sering digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah FAA
(Formaldehyde Acetic Acid). Formula FAA untuk jaringan tumbuhan adalah:
Ethil alcohol . 50 ml
Asam asetat grasial . 5 ml
Formalin . 10 ml
Akuadest . 35 ml
FAA ini juga dapat digunakan untuk jaringan hewan. Formula FAA untuk jaringan
hewan adalah:
Formalin . 10 ml
Alkohol 70% . 90 ml
Asam asetat grasial . 2 ml
Lama fiksatif 3 jam, tanpa pencucian.
Lama jaringan disimpan dalam larutan fiksatif tergantung pada:
o Jenis jaringan, misalnya jaringan tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan
intestinum
o Tebal atau tipisnya jaringan atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar
jaringan yang difiksasi maka semakin lama waktu yang diperlukan
o Jenis fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi yang berbeda.
Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan
metode paraffin adalah:
1. mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat,
sedangkan keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.
2. mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh
mikroorganisme ataupun kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh
jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autoloisis.
3. Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant)
yang merupakan komponen jaringna fiksatif.
D. Aerasi
Aerasi merupakan proses penarikan udara dari dalam jaringan dengan cara di
vakum, yang bertujuan untuk memudahkan fiksatif masuk ke dalam jaringan

dengan sempurna,. Tahap ini diutamakan pada jaringan tumbuhan, karena sel
pada jaringan hewan hanya terdiri dari membrane sel dan vakuola yang kecil,
sehingga udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan
mudah keluar melalui membrane sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan pada sel
tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola yang besar, sehingga mengandung
banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan melalui
dinding sel yang tebal waktu fiksasi.
E. Dehidrasi (dehydration)
Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan
bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari
dalam jaringan yang telah difiksasi. Proses dehidrasi merupakan serangkaian
proses dengan cara memasukan sample ke dalam larutan dehidrasi secara
berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dengan mengurai
konsentrasi air.
Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode
paraffin adalah alkohol. Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol,
aniline oil dan bergamot oil.
Alcohol merupakan dehidran yang umum digunakan, karena relatife lebih murah
dan mudah diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil yang baik, bahkan untuk
jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak, sumsum tulang belakang, dan
embrio. Dalam penggunaan alcohol dipakai serial dengan konsentrasi yang
berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi (35%-50%-70%80%-95%-100%). Lama perendaman tergantung untuk masing-masing konsetrasi
berkisar 1-6 jam. Alcohol 70% sebagai stoping point, jaringan di malamkan.
Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alcohol dilakukan setingkat demi
setingkat. Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara
tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang
terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti
masih ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi
ini dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat
penjernih, dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah
lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan
harus dikembalikan ke dehidran.

F. Penjernihan (Clearing)
Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari
penjernihan ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan
yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium
penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini akan
menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai
dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.
Lama jaringan dalam medium penjernih tergantung pada:
1. Ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan
2. jenis reagen yang dipakai

3. bila dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah
setengah hingga tiga jam. Bila dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka
jaringan akan mengeras dan rapuh yang tentunya sulit untuk di sayat.
4. Jenis jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam
menggunakan minyak cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung
menjadi keras atau getas bila dijernihkan dengan xilol atau benzene.
Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

minyak anilin
Benzene
karbon tetraklorida
karbon bisulfida
minyak kayu cadar
kloroform
minyak cengkeh
Xylol

G. Infiltrasi (Infiltration)
Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding
media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan
bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam
infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam
oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan.
Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan paraffin keras dengan titik leleh
56-58C.
Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn langsung dimasukan ke dalam
paraffin murni, tetapi sebelum paraffin murni jaringan dimasukkan terlebih
dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan paraffin murni dengan
perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan campuran ini terlalu
lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar kecilnya jaringan.
Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dsri prubshsn
lingkungsn yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang mendadak ini
dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan menjadi
sangat mengkerut,dll.
Setelah dalam campuran paraffin dan bahan penjernih, jaringan baru
dipindahkan ke paraffin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya
berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan
dalam oven.
Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin
sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama
seperti hidup.
H. Penanaman (Embedding)
Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman
jaringan ke dalam balok-balik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses
penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk

membuat balok paraffin yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat
permanen.
Paraffin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh yang
sama dengan paraffin yang digunakn waktu infiltrasi. Paraffin ketiga yang dipakai
pada infiltrasi dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat
memang sudah bersih dari bahan penjernih.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam penanaman adalah:
o Paraffin yang digunakan benar-benar bersih dan murni
o Peralatan yang digunakan benar-benar khusu untuk prose situ saja
o Pembuatan balok sebaiknya dilakukan dekat oven atau lampu Bunsen agar
lebih cepat, susunjaringan sesuai dengan orientasi yang direncanakan.
o Jaringan sebaiknya diberi label untuk menghindari kesalahan atau bertukar.
o Untuk jenis-jenis jaringan yang halus perlu dikerjakan di bawah lup
o Jangan sampai ada gelembung udara pada balok paraffin yang dibuat terutama
dekat jaringan.
I. Penyayatan (Sectioning)
Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang
telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk
membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop.
Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan,
diantaranya adalah yaitu proses embedding lebih cepat dan lebih simpel,
material embedding dapat disimpan dalam waktu yang lama pada kondisi kering,
serta dapat membuat irisan yang tipis. Embedding menggunakan paraffin sangat
baik digunakan untuk studi embriologi, anatomi dan sitologi (Khasim, 2002).
Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagian yang
sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotom menggunakan
pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau
tumbuhan dalam histologi(Wikipedia).
Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:
1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk
organ-organ keras seperti kayu
2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang
akan mengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap.
Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin
3. Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan
pisau yang bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan pada
mikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan
jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek
yang keras.
4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan
jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringan
yang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan dengan
memakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakai
lebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya
adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit
dipotong.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:

o Mikrotom harus seberat mungkin
o Meja tempat mikrotom harus stabil
o Pisau harus cocok dengan mikrotom
o Posisi pisau harus stabil
o Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan
yang akan disayat.
J. Penempelan dan Afiksasi (Afixing)
Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca
objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah
untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca
objek.
Media pelekat yang umumnya digunakan adalam mayers albumen yang
formulanya adalah sebagai berikut :
Putih telur sebanyak 50 bagian
Gliserin sebanyak 50 bagian
Kristal Tymol beberapa butir
Akuadest beberapa tetes
K. Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining)
Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan
menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek.
Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan
pewarnaan. Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek
dari paraffin.
Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau
memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapat
dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akan
transparan sehingga sulit untuk diamati.
Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk
dipelajari. Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vital
a. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui
fiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan,
terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan
preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa.
b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih
dalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu
untuk menyerap warna maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat
warna. Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik
bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara
umum digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel
tersebut mampu memfagosit zat warna.
c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan
Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan
anorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati.

Ditinjau dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan
pada kategori-kategori tertentu. Berikut ini adalah pembagian zat warna
bergasarkan berbagai kategori tersebut.
1. Berdasarkan sifatnya, meliputi:
a. Zat warna asam, adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna
dengan radikal basa yang tidak berwarna. Contoh: acid fuchsin, eosin, dan lain
sebagainya
b. Zat warna basa, adalah garam-garam dari basa pembawa warna dengan
radikal asam yang tidak berwarna.
2. Berdasarkan asalnya, meliputi:
a. Zat warna alami, berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari
tumbuhan maupun dari hewan, contoh hematokillin, adalah zat warna yang
berasal dari tumbuhan (Hehatoxylin campechianum)
b. Zat warna sintetis, mencakup jenis-jenis zat warna yang dibuat di pabrik.
Contoh: basic fuchsin, dibuat dari campuran analin dan paratoluidin.

3. Berdasarkan kemampuan mengenai warna (staining power), meliputi:

a. Zat warna substantife
Jenis zat warna yang mampu mewarnai jaringan secara langsung. Contoh janus
green B, Neutral red.
b. Zat warna ajektif
Jenis zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan,
harus menggunakan bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich.
Pada formula tersebut diberikan pula kalium alumunium secara berlebihan yang
berfungsi sebagai mordan.
4. Berdasarkan jumlah/ komposisi zat warna yang digunakan,meliputi:
a. Pewarna tunggal (single staining), hanya menggunakan satu jenis zat warna,
contohnya untuk melihat polysacharida sulphate ester serta hyaluronic, maka
digunakan zat warna tunggal gentian violet.
b. Pewarna ganda/ rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat warna,
contoh pada system pewarnaan hematoxilin-eosin
c. Pewarnaan rangkap tiga (triple staining), menggunakan tiga jenis zat warna,
contohnya formula Marllory triple stai yang menggunakan zat-zat warna acid
fuchsin, aniline blue serta orange G.
d. Pewarnaan rangkap empat, jarang digunakan dalam kerja rutin, kecuali untuk
tujuan khusus.
5. Berdasarkan struktur jaringan yang akan diwarnai, meliputi:L
a. Pewarnaan umum, seperti Hematoxillin eosin, fastgreen safranin
b. Bewarnaan khusus, seperti pewarnaan jaringan ikat yaitu Molary azan, aniline
blue, asam phospatungistik, korhensen, dan lain-lain.

METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari senin dan jumat sepanjang semester 5,

yang bertempat di Laboratorium Terpadu lab.fisiologi, Jurusan Biologi Fakultas

Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan dan hewan:
Botol film
Pinset
Skalpel
Mikrotom
Vakum
Kotak kertas kalender
Balok
Mikroskop
Kaca objek
Oven
Hotplate
Bahan yang digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan dan hewan:
Jaringan daun anggrek
Jaringan pada Burung
FAA
Alkohol, dengan berbagai konsentrasi
Xilol
Parafin lunak dan keras
mayers albumin
Hematoksilin
Eosin
Safranin
Fastgreen
3.3 Cara kerja
A. Pembuatan Preparat Tumbuhan
Pembuatan preparat tumbuhan terdiri beberapa tahap:
1. pengambilan jaringan tanaman dengan mengambil bagian organ tanaman
berukuran 0.5 cm
2. Dilakuakn fiksasi dengan menggunakan larutan fiksatif (FAA)
3. Aerasi dalam larutan fiksatif menggunakan pompa vakum sampai udara dalam
jaringan habis
4. difiksasi dengan larutan FAA 12jam
5. Didehidrasi dalam seri alkohol dari kosentrasi rendah ke konsentrasi tinggi
(35%-40%-45%-50%-60%-70%-80%-90%-96%-100%) masing-masing 1 jam,
kecuali 70% boleh dimalamkan.
6. Dimasukan ke dalam Alkohol 100%:Xilol (1:1) selama 1 jam sebagai perantara
sebelum proses penjernihan
7. Sisa alcohol dijernihkan dengan proses clearing, yaitu xilol 1 jam

8. Dilakukan tahapan perantara sebelum infiltrasi yaitu perendaman di dalam

larutan Xilol : paraffin (paraffin keras)(1:1) 1 jam di dalam oven
9. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin lunak 3 kali masing-masing 30 menit
dalam oven
10. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin keras 3 kali masing-masing 30 menit
dalam oven. Paraffin ketiga boleh dimalamkan
11. Parafin berisi objek dipotong seperti balok dan ditempel pada balok untuk
pegangan pada mikrotom
12. Penyayatan dengan mikrotom
13. Afiksing atau diletakan sayatan jaringan ke kaca objek yang diolesi dengan
mayers albumin.
14. Setelah pengeringan dengan menggunakan hotplate yang sebelumnya telah
diteteskan oleh xilol (disebut proses deparafinasi) mulai memasuki ke dalam
proses staining/pewarnaan, dengan proses sebagai berikut, rendam preparasi ke
dalam xilol:alcohol (1:1) selama 3 menit, selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan
alkohol 100%-90%-80%-70% masing-masing selama 3 menit lalu masukkan
dalam air lalu dilakukan pewarnaan dengan safranin selama 5-15 menit,
kemudian bersihkan dengan air.
15. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan eosin dengna cara sbb,
setelah distaining dengan safranin masukkan dalam alcohol 50%, 60%, 70%,
80%, masing-masing 3 menit, lalu dimasukkan ke dalam fastgreen 15-30 menit,
dilanjutkan dengan alcohol (90%-100% tiga kali)masing-masing 3 menit.
Selanjutnya penjernihan dengan menggunakan xilol 5-15 menit serta dibersihkan
16. penyelesaian dengan ditutup pakai kaca penutup sebagai media pelekat
17. Amati preparat yang dibuat dengan menggunakan mikroskop
B. Pembuatan Preparat Hewan
1. Hewan percobaan (burung) dibius dengan menggunakan eter dan diambil
organ-organ dalamnya, seperti jantung, ginjal, lambung, hati, usus, testes, paruparu dll. Potong organ-organ tersebut dengan ukuran 0,5 cm.
Organ-organ yang diambil kemudian langsung dimasukan ke dalam larutan
fiksasi (FAA) sebanyak 15 menit sebanyak 3X.
2. Dilakukan dehidrasi dengan direndam dalam alcohol 30, 40%, 50%, 70%, 80%,
90%, alcohol absolute. Masing-masing selama 60 menit,kecuali alkohol 70%
boleh dimalamkan.
3. Dimasukan ke dalam Alkohol 100%:Xilol (1:1) selama 1 jam sebagai perantara
sebelum proses penjernihan
4. Sisa alcohol dijernihkan dengan proses clearing, yaitu xilol 1 jam
5. Dilakukan tahapan perantara sebelum infiltrasi yaitu perendaman di dalam
larutan Xilol : paraffin (paraffin keras)(1:1) 1 jam di dalam oven
6. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin keras 3 kali masing-masing 1 jam dalam
oven. Pada paraffin ketiga boleh dimalamkan
7. Tahap selanjutnya adalah embedding atau penanaman, organ dimasukkan
kedalam kotak
8. Parafin yang berisi objek dipotong seperti balik di tempel balok kayu untuk
pegangan di mikrotom
9. Selanjutnya ke proses sectioning atau pengirisan, setelah melalui pendiaman

dalam blok paraffin

10. Selanjutnya dilakukan Afiksing (membentuk sayatan jaringan ke kaca objek
yang diolesi dengan mayers albumin.
11. Setelah pengeringan dengan menggunakan hotplate yang sebelumnya telah
diteteskan oleh xilol (disebut proses deparafinasi) mulai memasuki ke dalam
proses staining/pewarnaan, dengan proses sebagai berikut, rendam preparasi ke
dalam xilol:alcohol (1:1) selama 3 menit, selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan
alkohol 100%-90%-80%-70% masing-masing selama 3 menit lalu masukkan
dalam air lalu dilakukan pewarnaan dengan hematoxillin selama 5-15 menit,
kemudian bersihkan dengan air.
12. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan eosin dengna cara sbb,
setelah distaining dengan hematoxilin masukkan dalam alcohol 50%, 60%, 70%,
80%, masing-masing 3 menit, lalu dimasukkan ke dalam eosin 15-30 menit,
dilanjutkan dengan alcohol (90%-100%)masing-masing 3 menit. Selanjutnya
penjernihan dengan menggunakan xilol 5-15 menit serta dibersihkan
13. penyelesaian dengan ditutup pakai kaca penutup sebagai media pelekat
14. Amati preparat yang dibuat dengan menggunakan mikroskop

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Pembahasan
Pada praktikum mikroteknik ini, dilakukan pembuatan preparat tumbuhan dan
hewan. Bahan yang digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan adalah
anggrek (Dendrobium sp.) dan bahan yang digunakan untuk pembuatan
preparat hewan adalah burung dara(. Pembuatan preparat pada praktikum ini
dilakukan dengan metode parafin. Metode ini dilakukan dengan beberapa tahap
yang dilakukan secara berurutan dan terus-menerus, yaitu pembiusan(untuk
hewan), collecting, fiksasi, aerasi, dehidrasi, clearing, infiltrasi, embedding,
sectioning, afixing, deparafinasi dan pewarnaan. Metode ini digunakan karena
hampir semua jaringan dapat disayat dengan metode ini.
Pada proses pembuatan preparat tumbuhan tidak diawali dengan pembiusan,
karena tahap ini hanya untuk preparat hewan, yaitu untuk memudahkan
pengambilan jaringan. Pembuatan preparat tumbuhan diawali dengan
pengambilan jaringan atau collecting, pengambilan jaringan biasanya
menggunakan pisau atau gunting yang tajam dengan ukuran kurang lebih 0,5
cm. Sampel jaringan yang telah diambil, sebaiknya langsung dimasukan ke
dalam larutan fiksatif agar dapat mempertahankan bentuk sel atau jaringan
seperti dalam keadaan hidup. Larutan fiksatif yang digunakan adalah FAA.
FAA (Formaldehyd Acetic Acid) yang digunakan dalam fiksasi merupakan larutan
fiksatif campuran dan sebagai fiksatif koagulan yang lebih banyak digunakan
untuk studi dalam aspek anatomi dan morfologi, serta studi pencocokan
kromosom. Tujuan digunakan FAA yaitu untuk menjaga sel dalam waktu tertentu
atau tidak terbatas dan tanpa mengalami kerusakan. Waktu minimal yang
diperlukan untuk fiksasi dengan FAA adalah 18 jam. Komposisi dari FAA adalah
sebagai berikut (Khasim, 2002 dalam Imran,2008):
" Ethyl alcohol 70 % 90 ml

" Glacial acetic acid 5 ml

" Formalin 5 ml
Acetic acid berfungsi untuk membunuh jaringan, selanjutnya formalin dan etil
alkohol berperan dalan modifikasi gambar atau tampilan, pada intinya FAA untuk
fiksasi yang memberikan tampilan yang tajam. Untuk material daun, waktu
minimal fiksasi yang harus digunakan adalah sekitar 12 jam. Untuk daun yang
sangat tipis atau batang yang kecil diperlukan waktu 24 jam (Khasim, 2002
dalam Imran, 2008).
Tahap selanjutnya adalah aerasi, yang digunakan khusus untuk preparat
tumbuhan, karena sel pada jaringan hewan hanya terdiri dari membrane sel dan
vakuola yang kecil, sehingga udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan
hanya sedikit dan mudah keluar melalui membrane sel yang tipis saat fiksasi.
Sedangkan pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola yang besar,
sehingga mengandung banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau
jaringan melalui dinding sel yang tebal waktu fiksasi. Pada tahap aerasi
digunakan vakum sampai udara dari dalam jaringan sudah keluar.
Tahap selanjutnya adalah dehidrasi yang menggunakan alkohol secara bertahap
dari konsentrasi rendah sampai tinggi, agar dapat menjaga bentuk jaringan dari
perubahan secara tiba-tiba dan untuk memaksimalkan pengeluaran air dari
dalam jaringan. Penggunaan alkohol 70% sebagai stopping point karena alkohol
70% juga dapat digunakan sebagai desinfektan. Dehidrasi berfungsi untuk
membuat preparasi permanen, sehingga ketika dipotong tidak rusak dan dapat
disimpan dalam waktu yang lama. Alkohol digunakan karena alkohol bersifat
menarik air sehingga jaringan mengkerut dan mengeras (Khasim, 2002 dalam
Imran,2008). Setelah tahap ini adalah tahap infiltrasi yang digunakan untuk
menggantikan tempat alkohol di dalam jaringan dengan bahan penjernih yaitu
xilol. Sebelum menggunakan xilol, jaringan dimasukan dahulu ke dalam larutan
alkohol dan xilol dengan perbandingan 1:1 agar tidak terjadi perubahan pada
jaringan secara tiba-tiba dari alkohol ke dalam xilol.
Tahap selanjutnya adalah embedding, embedding adalah penanaman jaringan ke
dalam kotak dengan menggunakan parafin murni. Kotak yang dibuat dengan
menggunakan adalah kertas yang berasal dari kalender. Tahap ini dilakukan agar
mempermudah proses penyayatan. Yang harus diperhatikan adalah pada saat
penanaman tidak boleh ada gelembung.
Setelah tahap embedding, baru bisa dilakukan penyayatan (sectioning). Proses
penyayatan (sectioning) adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin
yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk
membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop.
Mikrotom yang digunakan pada praktikum ini adalah Sliding microtom atau
mikrotom sorong, dmana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju
dan mundur. Setelah sayatan jaringan telah terbentuk, sayatan tersebet
ditempelkan di kaca objek (afixing) yang sebelumnya telah dioleskan mayers
albumin secara merata. Selanjutnya sayatan ditetesi oleh xilol dan dipanaskan
sampai kering atau tahap ini disebut deparafinasi. Setelah itu preparat bisa
disimpan di dalam kotak sampai akhirnya nanti dilakukan proses pewarnaan
(Staining).
Tahap staining pada tumbuhan dengan menggunakan Pewarna ganda/ rangkap

(double staining, karena dengan menggunakan dua jenis zat warna, yaitu
safranin-fastgreen. Tahap pewarnaan menggunakan beberapa langkah yang
dilakukan bertahap yaitu pertama yaitu preparat direndam dalam xilol:alkohol
(1:1), selanjutnya berturut-turut adalah dehidrasi dengan alkohol 100%-90%80%-70%, pewarnaan I (Safranin), dibersihkan dengan air, alkohol 50%-60%70%-80%, pewarnaan II (fastgreen), alkohol 90%-100% tiga kali, penjernihan
dengan xilol, dan dibersihkan dengan air.
Hasil dari pewarnaan tumbuhan yaitu pada daun anggrek kalajengking (Arachis
flos-aeris) adalah nampak kurang jelas dan sebagian besar rusak ketika dilihat di
mikroskop. Hal ini dimungkinkan karena beberapa hal kemungkinan kesalahan
dalam melakukan prosedur sehingga sample daun menjadi lebih kering dan
mengkerut.
Suku anggrek-anggrekan atau Orchidaceae merupakan satu suku tumbuhan
berbunga dengan anggota jenis terbanyak. Jenis-jenisnya tersebar luas dari
daerah tropika basah hingga wilayah sirkumpolar, meskipun sebagian besar
anggotanya ditemukan di daerah tropika. Kebanyakan anggota suku ini hidup
sebagai epifit, terutama yang berasal dari daerah tropika. Anggrek di daerah
beriklim sedang biasanya hidup di tanah dan membentuk umbi sebagai cara
beradaptasi terhadap musim dingin. Organ-organnya yang cenderung tebal dan
"berdaging" (sukulen) membuatnya tahan menghadapi tekanan ketersediaan air.
Anggrek epifit dapat hidup dari embun dan udara lembab. Daun anggrek
biasanya oval memanjang dengan tulang daun memanjang pula, khas daun
monokotil. Daun dapat pula menebal dan berfungsi sebagai penyimpan air.
Kingdom : Plantae (tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (berpembuluh)
Superdivisio : Spermatophyta (menghasilkan biji)
Divisio : Magnoliophyta (berbunga)
Kelas : Liliopsida (berkeping satu / monokotil)
Sub-kelas : Liliidae
Ordo : Orchidales
Familia : Orchidaceae (suku anggrek-anggrekan)
Genus : Arachis
Spesies : Arachis flos-aeris J.J.S
Jaringan pada daun dapat dibedakan menjadi:
1. Jaringan epidermis
Merupakan lapisan daun yang paling luar. Jaringan epidermis ada dua yaitu;
epidermis atas dan epidermis bawah. Epidermis umumnya transparan karena
tidak memiliki kloroplas. Di epidermis terdapat stomata (tunggal: stoma) yang
berperan sebagai alat respirasi tumbuhan. Stomata umumnya terletak di
epidermis bawah. Pada tumbuhan air, biasanya stomata banyak terdapat di
epidermis atas.
2. Jaringan mesofil
Jaringan mesofil terletak di antara epidermis atas dan epidermis bawah. Pada
tumbuhan dikotil, jaringan mesofil terdiri dari dua jaringan yaitu: jaringan
palisade (jaringan tiang) dan jaringan spons (jaringan bunga karang).

 Jaringan palisade (jaringan tiang)

Sel-sel jaringan palisade berbentuk memanjang seperti tiang dan tersusun rapat.
Pada jaringan palisade, terdapat banyak kloroplas. Oleh sebab itu fotosintesis
terjadi di jaringan ini.
Jaringan spons (jaringan bunga karang)
Berbeda dari jaringan palisade, jaringan spons sel-selnya tidak tersusun rapat.
Karena sel-selnya tidak tersusun rapat, jaringan spons digunakan untuk
menyimpan cadangan makanan.
Pada tumbuhan monokotil, jaringan mesofil tidak terdiri atas jaringan palisade
dan jaringan spons. Fotosintesis terjadi pada jaringan mesofil.
3. Jaringan pembuluh
Jaringan pembuluh terletak pada jaringan spons. Jaringan pembuluh pada daun
merupakan kelanjutan dari jaringan pembuluh pada batang. Ada dua jenis
pembuluh yaitu:
o Pembuluh kayu (xylem).
Merupakan pembuluh yang berperan untuk mengangkut air dan mineral yang
diserap akar dari tanah menuju daun.
o Pembuluh tapis (floem)
Merupakan pembuluh yang berperan untuk mengangkut hasil fotosintesis ke
seluruh bagian tumbuhan.
Pada tumbuhan dikotil, terdapat kambium yang membatasi pembuluh kayu dan
pembuluh tapis. Tapi pada tumbuhan monokotil, tidak terdapat kambium yang
membatasi pembuluh kayu dan pembuluh tapis. Akibat adanya kambium,
memungkinkan batang tumbuhan dikotil bertambah lebar dan terbentuknya
lingkaran tahun pada batang.
Daun terbagi menjadi 4 susunan anatomi, yaitu daun bifacial/dorsiventral
(bentuk permukaan atas dan bawah tidak sama karena palisade hanya pada
permukaan atas), daun unifacial/isolateral (bentuk permukaan atas dan bawah
sama; palisade terdapat pada kedua sisi), daun rumput-rumputan pada
monokotil (mesofil hanya berupa spons), dan daun jarum pada gymnospermae
(mesofil bentuk bunga, penampang melintang bulat membulat, setengah
lingkaran atau segitiga sehingga sulit ditentukan atas dan
bawahnya(Priyanti&Puji,2007).
Pada hasil dari pembuatan preparat hewan, yaitu pada hati, otak dan paru-paru
hasil yang didapatkan juga kurang bagus. Sehingga masih tidak dapat dibedakan
bagian-bagiannya. Kadang preparat yang dihasilkan kurang bagus. Jaringan
kadang melipat sehiingga sulit diamati bagian-bagiannya. Hal ini dikarenakan
pada proses pengirisan kurang berhasil dimana pita menggulung dan jaringan
yang melekat pada parafin hanya sedikit. Warna jaringan yang pudar karena
setelah perendaman di larutan pewarna terlalu lama dibiarkan di udara bebas.
Hal lain yang sangat mungkin adalah pewarna kualitasnya sudah menurun atau
terlalu lama. Jaringan yang teramati kadang rusak aatu terkoyak hal ini dapat
dikarenakan pita sobek sehingga jaringan ikut rusak. Proses infiltrasi dengan xilol
kurang maksimal sehingga jaringan rapuh (Affuwa, 2007).
Salah satu preparat hewan adalah hati. Hati adalah sebuah organ dalam

vertebrata, termasuk manusia. Organ ini memainkan peran penting dalam

metabolisme dan memiliki beberapa fungsi dalam tubuh termasuk penyimpanan
glikogen, sintesis protein plasma, dan penetralan obat. Preparat yang lain adalah
preparat otak dan paru-paru. Pada otak sebagiannya terdiri atas sel syaraf.

PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode parafin
melalui beberapa tahapan, diantaranya adalah Fiksasi, pencucian, dehidrasi,
penjernihan, infiltrasi, penyelubungan (embeeding), pengirisan (sectioning),
penempelan (affixing), pewarnaan (staining), penutupan (mounting).
Berdasarkan hasil pembuatan preparat tumbuhan yaitu pada daun Anggrek,
struktur yang teramati tampak kurang jelas dan sebagian besar rusak.
Sedangkan hasil dari preparat hewan tidak dapat dibedakan bagian-bagiannya.
5.1 Saran
Saran yang ingin disampaikan yaitu sebaiknya untuk praktikum selanjutnya
harus lebih diperhatikan dalam melakukan setiap langkah prosedur agar hasilnya
lebih baik dan maksimal.

DAFTAR PUSTAKA
Dasumiati, 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Prodi Biologi Fak.Sains dan Teknologi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Daun. Http: http://fionaangelina.com/2008/04/01/daun/. Di akses tanggal 29
Desember 2008 jam 14.24
Imron,Tamyis Ali.2008. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan Dengan Metode
Parafin. Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyberbiology.blogspot.com. Di akses tanggal 29 Desember 2008 jam 14.02

__________________ . Pembuatan Preparat Jaringan Hewan Dengan Metode Parafin.

Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Di
akses tanggal 29 Desember 2008 jam 14.17
Mikroteknik. http: wikipedia.com. Di akses tanggal 29 Desember 2008 jam 14.35
Priyanti dan Puji. 2007. Penuntun Praktikum Struktur dan Perkembangan
Tumbuhan (Morfologi dan Anatomi Tumbuhan). Laboratorium Terpadu. UIN
Jakarta