LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROTEKNIK
INOUYE

Aditya Wardana
K4314001
Kelas A
PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2016

LAPORAN RESMI MIKROTEKNIK

A. Judul
Inouye
B. Tujuan
Untuk mempelajari proses pembuatan preparat awetan anatomi skeletal dengan
menggunakana double staining
C. Prisnsip Kerja
Membius hewan uji (burung pipit / Estrida sp) dengan eter. Dan dilakukan
penghilangan derivat kulit yang menghalangi pewarnaan (bulu, sisik), kemudian
spesies difiksasi dalam toples menggunakan alkohol 95% atau ETOH selama 3 hari.
Hewan uji dibersihkan lagi seperti kulit, otot dan organ dengan disectio kit
dan direndam dalam alkohol 95% baru selama 3 hari. Hal ini agar tidak
menghalanginya proses penyerapan zat warna ke dalam tulang.
Kemudian alkohol itu diganti dengan aceton selama 4 hari dan setiap 2 hari
dilakukan penggantian aceton dengan aceton yang baru. Hal ini dimaksudkan zat
aceton ini bersifat penghilangan lemak. Dan perlu penggantian setiap 2 hari untuk
menjaga aceton tetap bersih sehingga penghilangan lemak dapat dilakukan dengan
maksimal.
Aceton diganti dengan larutan pewarna ganda Alizarin red S Alcian Blue
dengan komposisi 1 bagian 0.3 %Alcian Blue dalam alkohol 70% dan 17 bagian 0.1%
Alizarin red S dalam alkohol 95% + 1 bagian AAG + 17 bagian alkohol 70%.
Direndam selama 2-3 hari.
Spesimen dicuci dengan air mengalir 3 menit lalu disimpan dalam larutan
KOH 1% selama 5 hari sampai hewan transparan. KOH ini dapat melarutkan warna
dibagian otot pada daerah yang tidak dibersihkan seperti pada tengkorak, anggota
gerak, dan dirongga badan.
Spesimen dimasukkan dalam campuran Gliserin : KOH 1% dengan
perbandingan 20:80, 50:50, dan 80:20 masing-masing 2 jam. Spesimen dimasukkan
dalam Gliserin bertingkat dari yang kosentrasi 20 ke 80 karena untuk menggantikan
larutan KOH dengan Gliserin secara perlahan.
Spesimen dapat disimpan dalam gliserin murni. Yang bertujuan tidak
terbentuknya jamur pada spesimen.

D. Data Pengamatan

E. PEMBAHASAN
a. Pembuatan Preparat
Metode alizarin adalah suatu metode pembuatan preparat utuh yang bertujuan
untuk mengetahui pembentukan tulang pada embrio atau untuk mendeteksi proses
kalsifikasi pada tulang embrio dengan menggunakan larutan alizarin. Tulang yang
diwarnai dengan alizarin red akan berwarna merah tua apabila tulang tersebut telah
mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul karena zat warna yang diberikan terikat oleh
kalsium pada matriks tulang.
Larutan-larutan yang digunakan dalam percobaan ini mempunyai fungi masingmasing. Eter berfungsi sebagai pembius embrio sebelum digunakan untuk percobaan.
Larutan alkohol berfungsi sebagai fiksatif. Larutan KOH berfungsi agar otot menjadi
transparan dan skeletonnya terlihat jelas. Larutan pewarna Alizarin berfungsi agar
skeleton berwarna merah sehingga dapat terlihat jelas. larutan gliserin berfungsi
sebagai larutan media penyimpan dan timol sebagai larutan pengawet dan untuk
mencegah penjamuran.
Terdapat 5 periode pembentukan tulang yaitu: (1) periode embrionik:
mandibula, maksila, humerus, radius, ulna, femur,dan fibia. (2) periode fetal: scapula,
illium, fibula. (3) tulang muda: epiphisis pada anggota badan, karpal, tarsal, dan
sesamoids. (4) tulang remaja: scapula, tulang rusuk, tulang pinggul/pinggang. (5)
tulang dewasa (Soeminto,2002).
Alizarin Red S (ARS) merupakan senyawa turunan antraquinone yang telah
digunakan secara luas pada kimia analitik terutama sebagai agen pengkhelat
(reduktor) yang kuat dan kromofor. Alizarin Red S bereaksi dengan berbagai macam
ion logam tersebut dan membentuk khelat ion tyang tidak terekstrasi ke dalam fase
organik. Pewarna Alizarin Red dapat mewarnai organ yang terkalsifikasi tanpa
merusak struktur dari organ tersebut. Ion Ca2+ yang terdapat dalam proses kalsifikasi
tulang akan bereaksi dengan ARS membentuk komples Ca-ARS yang berwarna
merah (Sufyani, 2009) Tulang yang diwarnai dengan Alizarin Red akan berwarna
merah tua apabila tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul
karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang.
Pembentukan System rangka dimulai pada inkubasi hari ke 5 ditandai dengan
kondensasi mesenkim prekartilago. Kondrifikasi dimulai pada hari ke 8 sedangkan
osifikasi dimulai pada hari ke 9 (Soeminto, 2002).
Faktor yang dapat mempengaruhi pewarnaan alizarin adalah pH, Senyawa ion
logam lain, konsentrasi reagen, Alizarin akan mampu mengikat ion Cl- pada pH yang
relative rendah asam (2,8). Sedangkan untuk ion logam seperti Ca2+ akan lebih
efektif pada pH yang basa (11 12,5). Oleh karena itu, sebelum ditambahkan Alizarin
Red S substrat ditambahkan larutan KOH 1% untuk mempermudah kondisi suasana
basa pada Spesimen (Somasundaran, 1986).

metode alizarin ini memiliki keuntungan yaitu lebih praktis dan hemat karena
jenis bahan kimia yang digunakan hanya sedikit, dapat mengamati tulang-tulang pada
embrio atau hewan secara utuh tanpa terpisah dan merusak bentuk bagiannya, dan
juga dapat melihat bentuk kelainan tulang pada embrio. Namun kelemahan dari
metode ini adalah hanya tulang keras saja yang terwarnai sedangkan tulang rawan
tidak terwarnai sehingga tidak dapat mengamati tulang rawan yang terbentuk dan
tidak bisa membedakan tulang rawan dan tulang keras pada embrio, proses
pengerjaannya memakan waktu yang cukup lama sehingga tidak efisien waktu, dan
mudah rusak karena embrio yang diwarnai dengan metode alizarin akan sangat lunak
serta mudah hancur jika terkena getaran yang cukup keras.
b. Preparat Spesimen
Gambar Praktikum
1

4
5

3
6

9
8

Keterangan
1. Phalanges
2. Metacarpus
3. Ulna
4. Radius
5. Humerus
6. Femur
7. Tibiotarsus
8. Tarsometatarsus
9. Digits

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan tentang proses

pembuatan preparat skeleton didapatkan hasil yang sangat bagus berupa
preparat skeleton burung pipit / Estrida sp sangat tampak jelas. Tetapi yang
menjadi kekurangannya adalah masih terlihatnya lapisan kulit sehingga
menghalangi jarak pandang. Dan hanya terlihat skeleton pada bagian dekat
kulit. Menurut pendapat Astarini (2012), bahwa Metode preparasi yang
digunakan untuk membuat preparat skeleton adalah metode Alizarin Reds
Alcian Blue (ARAB) Inouye.
Proses pembuatan preparat hewan terdapat suatu tahap yang harus
dilakukan yaitu proses pembiusan, hal ini berfungsi agar preparat yang
dihasilkan lebih sempurna karena tidak akan bergerak pada saat proses sedang
berjalan, selain itu juga pembiusan dilakukan karena menunjukan etika terhadap
penggunaan hewan sebagai bahan uji penelitian. Menurut pendapat Anandari
(2012), bahwa pembiusan (narcose) ialah proses yang khusus untuk preparat
hewan bertujuan untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan
pada hewan. Pembiusan berguna untuk mengambil organ hewan dalam keadaan
hidup sehingga organ yang diambil tidak jauh dari keadaan ketika hidup.
Kualitas preparat skeleton dipengaruhi oleh tahap-tahap yang dilakukan
diantaranya yaitu tahap pencucian, pada proses inilah yang membedakan
pembuatan preparat pada tumbuhan dan hewan, jika pada tumbuhan dapat
hanya menggunakan aquadest namun pada hewan harus digunakan larutan
khusus, hal ini dikarenakan jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi
yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam
larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Menurut pendapat Rozikuliyeva

(2012), bahwa pencucian yang tidak baik akan mengakibatkan organ tida
transparan ketika proses clearing. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai
ialah NaCl 0.8-0.9%, Larutan Ringer ( NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk
hewan berdarah panas dan NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan
berdarah dingin). NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan,
biasanya dalam waktu 15 menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci
dengan air, karena akan menyebabkan pembengkakan sel (hewan).
Pembuatan preparat spesimen burung sangat sulit dilakukan karena
harus membersihkan bulu dan kulit. Pada gambar preparat diatas, terlihat masih
adanya kulit yang menutupi seluruh permukaan tubuh spesimen. Dan hal ini
mengakibatkan kurang dapat diamatinya bagian dalam tubuh spesimen.
c. Perbandingan hasil pengamatan dan hasil penelitian internasional
Nama
Hasil Pengamatan
Hasil Penelitian Internasional
Preparat
burung pipit /
Estrida sp

Hanya didapat preparat yang

terwarnai
skeleton
dengan
seluruhnya warna merah dan tidak
menunjukkan adanya warna biru.
Kulit menghalangi pengamatan,
Skeletal mencit fetus, 20 hari
sehingga yang terlihat hnya
gestation, pada pewarnaan alcian
skeleton didekat kulit saja.
blue-alizarin red S. bagian tulang
rawan berwarna biru dan tulang
keras berwarna merah.
Dalam jurnal Webb, G.N., dan Byrd,
R.A. (1994) dengan pewarnaan,
maceration, dan pembersihan. Kulit
dan skapula jaringan adiposa
dibersihkan dengan gunting dan fetus
dikeluarkan isi perutnya. Untuk
pembersihan total kulit, ditempatkan
pada water bath 70 C untuk 30 detik.
Difikasi ethanol 95%, pewarnaannya
Alcian blue (C.I. 74240, Eastman
Kodak Co., Rochester, NY) 0.3%
(w/v) dalam 70% ethanol

Alizarin red S (C.I. 58005, Eastman

Kodak Co.) 0.1 % (w/v) in 95%
ethanol. alcian blue and alizarin red
S dikombinasikan dengan 70%
ethanol 1 : 1 : 18 (v/v). ditambah
Potassium
hydrogen
phthalate.
Direndam selama 72 jam. Lalu
dicuci
dengan
air
mengalir.
Maceration
dan
pembersihan
jaringan soft dengan Potassium
hydroxide 0.75% (w/v), Glycerin
20% (v/v), dan Glycerin 50% (v/v).
pada terionisasi air.
Maceration
dalam
potassium
hydroxide 0,75% sampai bersih dan
diganti dengan gliserin 20% dan
50%.
F. KESIMPULAN
1. Lama waktu perendaman didalam larutan KOH 1% disesuaikan dengan jenis hewan
yang akan dibuat preparat skeleton.
2. Pembuatan preparat hewan lebih mudah dan tidak memakan waktu yang panjang.
3. Pengamatan preparat skeleton dengan cara preparat tetap terendam pada larutan
gliserin murni dengan volume yang disesuaikan pada jenis bahan sehingga lebih
tampak jelas.
G. DAFTAR PUSTAKA
Anandari, Lyria. 2012. Laporan Praktikum Teknik Laboratorium Membuat Preparat
Anonim. 2002. Mikroteknik. Jakarta: Erlangga.
Permanen Jaringan Hewan Mencit. Jakarta: Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah.
Rozikuliyeva, Lyale. (2012) Laporan Praktikum Teknik Laboratorium Membuat
Preparat Permanen Jaringan Hewan Mencit. Jakarta: Universitas Islam Negeri
Syarif Hidayatullah.
Soeminto. 2002. Embriologi Vertabrata. Purwokerto: Fakultas Biologi UNSOED.
Sufyani, Fahrullah. 2009. Pengaruh Ion Pengganggu Al (Iii) Dan Fe (Iii) Pada
Penentuan Zn (Ii) Dengan Alizarin Red S (Ars) Secara Spektrofotometri. Jurnal
Kimia Analitik vol. 3(5) pp. 55-61.
Somasundaran, P., Fu, E. 1986. Alizarin Red S as a Flotation of Modyfing Agent in
Calcitat-Apatite System. International Journal of Mineral Precessing, Vol. 18. pp.
287-296.
Webb, G.N., dan Byrd, R.A. (1994). Simultaneous Differential Staining of Cartilage
and Bone in Rodent Fetuses: an Alcian Blue and Alizarin Red S Procedure
without Glacial Acetic Acid. Biotechnic & Histochemistry
H. Lampiran
1 lembar foto pengamatan

Mengetahui,
Asisten

Surakarta, 30 Des 2016

Praktikan,

ADITYA WARDANA
K4314001

LAMPIRAN