PEWARNAAN ALIZARIN RED

Oleh :
Nama
NIM
Rombongan
Kelompok
Asisten

: Fajar Husen
: B1J013002
: VII
:1
: Kamilah Dwi Septiani

LAPORAN PRAKTIKUM PERKEMBANGAN HEWAN

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2014

I.

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Pewarnaan alizarin red merupakan suatu metode atau cara pewarnaan terhadap
hewan dengan tujuan untuk mengetahui pembentukan tulang pada hewan atau
mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio hewan. Tulang yang diwarnai oleh
alizarin red akan berwarna merah tua, yang menandakan bahwa tulang tersebut telah
mengalami kalsifikasi. Warna merah tua terbentuk karena zat warna alizarin red yang
diberikan terikat oleh ion-ion kalsium pada matriks tulang (Sudarwati, 1990).
Tulang selalu terbentuk dalam kerangka jaringan penyambung (connective
tissue) yang telah ada sebelumnya. Perbedaan-perbedaan dalam perkembangan
terjadi karena dalam embrio beberapa dari tulang-tulang itu diendapkan dalam
mesenkim yang belum terdiferensiasi (pembentukan tulang intra membran),
sedangkan di bagian lain dari tubuh terjadi pembentukan tulang yang didahului oleh
sistem tulang rawan penumpu yang sementara (pembentukan tulang endokondral)
(Storer, 1978 dan Jessop, 1988).
Proses penting pembentukan matriks tulang dan osifikasi (penulangan) adalah
sama. Osifikasi bermembran terjadi dalam tulang-tulang tengkorak pipih dan
klavikula (tulang selangka), sedangkan osifikasi endokondral bersifat khas untuk
sebagian besar sisi kerangka tubuh. Perbedaan antara kedua proses itu terletak dalam
kenyataan bahwa pada osifikasi endokondral, tiap spikula diendapkan sekeliling
pecahan matriks tulang rawan yang telah mengapur, sedangkan pada spikula tulang
intra membran tidak terdapat kerangka semacam itu (Yatim, 1983). Tulang
membentuk rangka tubuh, yang fungsinya untuk menahan berat badan. Otot volunter
(rangka) diinsersikan pada tulang melalui penyisipan tendon ke jaringan penyambung
periosteum. Tulang panjang membentuk suatu sistem tuas yang meningkatkan
kekuatan yang dihasilkan oleh kontraksi otot. Tulang melindungi sistem saraf pusat
(yang terdapat di dalam tengkorak dan kanalis spinalis) dan sumsum tulang (Adnan,
2010).
Matriks tulang mengandung unsur-unsur yang sama seperti jaringan-jaringan
penyambung lainnya, serat-serat dan bahan dasar. Pengendapan matriks ini oleh
osteoblast disebut osifikasi. Pengendapan garam-garam kalsium dalam matriks ini
disebut kalsifikasi (pengapuran), suatu proses yang terjadi normal pada tulang tetapi

dapat terjadi patologis dalam jaringan penyambung lain, seperti tulang rawan dan
dinding pembuluh darah. Kalsifikasi belum terjadi dalam matriks tulang, daerah itu
disebut osteoid (Connolly, 2010).
Manfaat dari pewarnaan alizarin red adalah dapat mengetahui proses penting
pembentukan matriks tulang dan osifikasi (penulangan). Osifikasi bermembran
terjadi dalam tulang-tulang tengkorak pipih dan klavikula (tulang selangka),
sedangkan osifikasi endokondral bersifat khas untuk sebagian besar sisi kerangka
tubuh yang dapat teramati. Pewarnaan alizarin red juga dapat memberikan gambaran
tentang perbedaan antara osifikasi endokondral dan osifikasi membran yang intinya
bahwa pada osifikasi endokondral, tiap spikula diendapkan disekeliling pecahan
matriks tulang rawan yang telah mengapur, sedangkan pada spikula tulang intra
membran tidak terdapat kerangka semacam itu (Villee, 1988).
Alasan menggunakan hewan uji yaitu ikan nilem (Osteochilus hasselti) karena
ikan ini mudah didapat. Ikan nilem juga murah harganya dan dapat memberikan
gambaran langsung serta mudah dalam proses pewarnaannya. Ikan nilem yang
ukurannya tidak terlalu besar memudahkan serta mempercepat proses pewarnaan
alizarin dan mengamati kalsifikasinya.
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum pewarnaan alizarin red adalah mengerjakan suatu
prosedur pewarnaan alizarin red dan menerangkan klasifikasi tulang pada embrio.

II.

MATERI DAN METODE

A Materi

Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah preparat embrio ikan
nilem (Osteochilus hasselti), larutan alkohol 96 %, larutan pewarna alizarin red,
larutan penjernih A, B dan C, larutan KOH 1 %, larutan KOH 2 % dan aquades.
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah botol spesimen dan
spuit injeksi tanpa jarum.
B Metode
1
2

Preparat ikan disiapkan.

Ikan dimasukan ke dalam gelas arloji, kemudian dituang larutan alkohol 96 %

selama 12 jam.
Diambil larutan alkohol dengan spuit injeksi tanpa jarum dengan hati-hati,

kemudian diambil foto untuk ikan setelah diberi alkohol 96 %.

Ikan yang dibersihkan dari sisa alkohol 96 % dengan dituangkan larutan aquades

selama 10 menit kemudian diambil foto.

Aquades diambil dengan spuit injeksi tanpa jarum, kemudian ikan dituang
larutan KOH 1 % selama 3 jam, kemudian setelah 3 jam dibersihkan dan diambil

foto.
Ikan yang sudah dibersihkan dari KOH 1 % kemudian di beri larutan pewarna

alizarin red selama 6 jam, dan setelah selesai dibersihkan dan di foto.
Ikan yang sudah dibersihkan dari alizarin red kemudian diberi larutan KOH 2 %
selam 15 menit, hal ini dilakukan karena masih ada bagian ikan yang belum

terlihat transparan dan setelah selesai kemudian di foto.

Ikan kemudian dibersihkan dengan larutan penjernih A selama 1 jam, kemudian
di ikan di foto. Setelah diberi penjernih A, ikan kemudian diberi larutan
penjernih B selama 1 jam, di foto setelah selesai dan diberi larutan penjernih C

selama 1 jam, kemudian di foto setelah selesai.

Setiap perlakuan 1 sampai 8 dicatat data dan waktu serta keterangan pada lembar
pengamatan.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar 1. Ikan sebelum

Gambar 2. Ikan setelah diberi

diperlakukan.

larutan Alkohol 96 %.

Gambar 3. Ikan setelah diberi

larutan Aquades.

Gambar 4. Ikan setelah diberi

larutan KOH 1 %.

Gambar 5. Ikan setelah diberi

Gambar 6. Ikan setelah diberi

pewarna Alizarin Red.

larutan KOH 2 %

Gambar 7. Ikan setelah diberi larutan

penjernih A.

Gambar 8. Ikan setelah diberi

larutan penjernih B.

Gambar 9. Ikan setelah diberi larutan penjernih C.

Gambar 10. Skematis Tulang Ikan

Tabel 1. Data Pengamatan Tulang yang Terkalsifikasi

No.

Kelompok

1.

2.

3.

4.

5.

6.

1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
1.
2.
3.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Tulang yang Terkalsifikasi

Tengkorak
Rongga mata
Rongga Insang
Sirip dada
Sirip punggung
Sirip belakang
Sirip ekor
Tengkorak bagian anterior
Sirip dada
Sirip punggung
Sirip anal
Sirip ekor
Tulang belakang
Rongga insang
Tulang belakang
Sirip ekor
Rongga mata
Tengkorak
Tengkorak
Sirip dada
Sirip anal
Sirip punggung
Sirip perut
Sirip ekor
Sirip ekor
Sirip belakang
Tulang belakang
Tulang rusuk
Sirip punggung
Sirip dada
Rongga mata

B. Pembahasan
Berdasarkan praktikum yang dilakukan oleh tiap-tiap kelompok dalam
prosedur pewarnaan alizarin red didapatkan data yang berbeda-beda dilihat dari
preparat yang terwarnai tulangnya oleh pewarna alizarin red. Kelompok satu sampai
dengan kelompok enam menggunakan preparat yang sama kemungkinan besar terjadi
kesalahan dan berbedanya waktu masing-masing kelompok dalam menggunakan tiap
larutan, yang menyebabkan perbedaan prosedur pewarnaan alizarin red sehingga
hasil berbeda. Kelompok satu mendapatkan hasil di mana tulang tengkorak, rongga
mata, rongga insang, sirip dada, sirip punggung, sirip belakang dan ekor terwarnai
dengan baik.
Hasil kelompok sata sama dengan hasil dari kelompok dua dan kelompok
enam, perbedaannya hanya terletak pada sirip anal yang terwarnai pada kelompok
dua, namun tidak terwarnai atau tampak pada kelompok satu dan kelompok enam,
hal ini dikarenakan saat prosedur perlakuan dengan penambahan larutan KOH 1%
sirip analnya rusak, sehingga tidak dapat diidentifikasi, namun pada kelompok enam
terlihat tulang rusuk bagian dalam terwarnai dengan baik di mana pada semua
kelompok tulang rusuk tidak terwarnai. Kelompok lain justru mendapatkan hasil
yang sangat berbeda dari kelompok satu, dua dan enam, contohnya pada kelompok
tiga yang medapatkan hasil di mana tulang yang terwarnai hanya berjumlah tiga saja
yaitu rongga insang, tulang belakang dan sirip ekor, hal ini terjadi karena ada
beberapa sirip dari ikan yang rusak sehingga tidak terwarnai atau sulit diidentifikasi
dengan baik. Hal tersebut sama dengan kelompok empat yang hanya mendapatkan
hasil yaitu tulang rongga mata dan tengkorak saja yang terwarnai, sedangkan pada
kelompok lima tulang tengkorak dan semua sirip pada ikan terwarnai dengan baik,
karena pada kelompok ini ikan masih utuh dan tidak rusak semua siripnya sehingga
pewarna alizarin red dapat meresap kedalam tulang, disamping karena faktor jumlah
Ca yang baik sehingga dapat terikat oleh pewarna alizarin red.
Menurut Jasin (1992) bahwa kalsifikasi tulang bergantung pada kadar ion Ca
pada tulang itu sendiri. Kadar ion Ca akan mempengaruhi pewarna alizarin untuk
mewarnai tulang yang diindikasi telah terkalsifikasi karena meraka akan saling
membentuk ikatan seingga pewarna akan mewarnai tulang. Pewarnaan yang umum
dilakukan adalah dengan alizarin red yang membutuhkan waktu 5 sampai 8 jam

untuk mewarnai tulang dengan kondisi preparat yang sedang. Hasil pewarnaan pada
tiap kelompok menunjukan perbedaan karena masing-masing kelompok terdapat
prosedur yang berbeda ketika dilakukan, seperti keterlambatan waktu saat menaruh
larutan KOH 1 %, yang seharusnya 3 jam tepat tetapi ada yang kurang, hal ini
berpengaruh kepada kemampuan pewarna alizarin red untuk masuk ke dalam
preparat dan menghalangi proses pengikatan ion Ca dengan pewarna alizarin red.
faktor lain yang menyebabkan pewarnaan pada tulang berbeda-beda adalah
kandungan ion Ca dari preparat itu sendiri karena kandungan ion Ca pada tiap
organisme berbeda-beda, dan perbedaan kandungan ion Ca pada preparat ini dapat
mengakibatkan proses kalsifikasi pada tiap organisme berbeda-beda, sehingga ketika
pewarna alizarin red masuk ke dalam tulang maka proses pengikatannya bervariasi
hasilnya tulang yang terkalsifikasi bervariasi. Faktor lain seperti kelalaian praktikan
ketika memasukan larutan yang mengakibatkan preparat yang kondisinya sudah
lunak namun ketika perlakuan kurang berhati-hati sehingga preparat rusak, hasilnya
beberapa sirip dari ikan rusak dan hilang.
Berdasarkan praktikum yang dilakukan prosedur pertama yang perlu
diperhatikan adalah kondisi dari preparat itu sendiri, pengamatan ini perlu dilakukan
untuk pembanding ketika preparat mulai dimasukan ke dalam larutan uji. Larutanlarutan yang digunakan dalam percobaan ini mempunyai fungsi sendiri-sendiri.
Larutan alkohol berfungsi sebagai fiksatif. Larutan KOH dalam percobaan tersebut
berfungsi agar otot menjadi transparan dan skeletonnya terlihat jelas. Larutan
pewarna Alizarin Red berfungsi skeleton berwarna merah tua atau ungu. Larutan
penjernih A, B, dan C berfungsi untuk mengurangi kelebihan pewarna yang masuk
ke dalam jaringan otot sehingga otot menjadi tampak jernih transparan. Sedangkan,
larutan gliserin berfungsi sebagai pengawet spesimen. (Soeminto, 2000).
Waktu yang dibutuhkan keseluruhan dalam pewarnaan alizarin red ini adalah
24 jam, setiap penambahan dan pergantian larutan terlihat perbedaannya.
Penambahan larutan alkohol 96 % mengakibatkan preparat menjadi lebih lunak dan
terlihat lebih kusam, hal ini memudahkan larutan KOH 1 % pada saat
menambahkannya lebih mudah, karena larutan KOH 1 % ini akan lebih mudah
masuk dan membuat preparat menjadi transparan, pada penambahan alkohol
membutuhkan waktu 12 jam dan penambahan KOH 1 % sampai preparat terlihat

transparan membutuhkan waktu 3 jam. Penambahan larutan selanjutnya adalah

pewarna alizarin red yang akan memberikan warna tulang merah, karena ion-ion Ca
akan berikatan dengan pewarna alizarin red dan hal ini menandakan bahwa tulang
terkalsifikasi dengan baik, lama waktu yang dibutuhkan sampai tulang pada preparat
terwarnai adalah 6 jam. Perlakuan selanjutnya adalah penambahan larutan KOH 2 %,
hal ini dilakukan karena pada saat penambahan larutan KOH 1 % masih ada bagian
yang belum tertransparansi dengan baik, jadi fungsi KOH 2 % ini sama seperti KOH
1 %. Penambahan larutan selanjutnya pada preparat adalah penjernih A, di mana
memiliki komposisi gliserin, KOH dan akuades, penambahan ini membutuhkan
waktu 1 jam, kemudian dilanjutkan dengan penambahan larutan penjernih B dan C di
mana komposisi penjernih B sama seperti penjernih A dan penjernih C hanya terdiri
dari gliserin dan akuades waktu yang dibutuhkan pada penjernih B dan C masingmasing 1 jam.
Tulang yang diwarnai dengan alizarin red akan berwarna merah tua apabila
tulang tersebut telah mengalami klasifikasi. Warna ini muncul karena zat warna yang
diberikam terikat oleh kalsium pada matriks tulang. Pembentukan system rangka
dimulai pada inkubasi hari ke 5 ditandai dengan kondensasi mesenkim prekartilago.
Kondrifikasi dimulai pada hari ke 8 sedangkan osifikasi dimulai pada hari ke 9
(Soeminto, 2000).
Menurut pendapat Basri (2012) Faktor yang mempengaruhi proses
keberhasilan pewarnaan alizarin red yaitu faktor hormonal dari ikan. Hormon
paratiroid, kalsitonin, dan vitamin D yang bertanggung jawab terhadap tingkat kadar
kalsium darah yang normal, yang akan mempengaruhi proses kalsifikasi. Kalsitonin
adalah hormon yang berasal dari sel-sel parafolikuler dari kelenjar tiroid. Hormon
tersebut mempunyai aksi dalam menurunkan kadar kalsium darah dan menghambat
resorpsi tulang sehingga mempengaruhi proses kalsifikasi. Makanan juga
berpengaruh dalam proses kalsifikasi (Campbell, 2008)
Faktor lain yaitu keberadaan ion Ca dalam tulang yang jumlahnya banyak
akan lebih menyerap warna lebih baik, hal ini menandakan kalsifikasi pada tulang
tersebut juga baik. Kadar dan jumlah konsenterasi pewarna juga mempengaruhi
keberhasilan pewarnaan, semakin banyak pewarna dan pekat pewarnaan akan lebih
baik, waktu pewarnaan yang cukup, karena ketika waktu pewarnaan terlalu cepat

akan mempengaruhi keberhasilan pewarnaan terhadap tulang. Hal ini khususnya

berlaku terhadap cukupnya persediaan dan tersedianya mineral-mineral seperti
kalsium dan fosfor, yang merupakan komponen-komponen anorganik utama dari
tulang. Kekurangan kalsium atau fosfor dalam makanan mengakibatkan pelanggaran
dan kerapuhan tulang. Situasi dimana kalsium cukup tetapi vitamin D kurang,
terjadilah gangguan dalam penyerapan mineral dan mineralisasi pada tulang yang
sedang tumbuh (diantaranya tahap kalsifikasi) menjadi terhambat (Yatim, 1983).

IV.

KESIMPULAN DAN SARAN

A Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang dilakukan terlihat bahwa tulang yang terkalsifikasi
atau terwarnai oleh alizarin red akan menjadi merah. Hal tersebut terjadi karena

ikatan antara ion Ca dan pewarnanya.

Kalsifikasi yang terlihat pada hewan uji ditandai dengan adanya warna pada
tulang tersebut, tulang yang terkalsifikasi pada ikan nilem yaitu tulang
tengkorak, rongga mata, rongga insang, sirip dada, sirip punggung, sirip
belakang, sirip ekor, tulang belakang dan sirip perut.
B Saran
Saran untuk praktikum selanjutnya agar praktikan lebih fokus dalam

praktikum dan teliti dalam menggunakan alat, agar objek dapat di ambil dengan baik
dan benar. Praktikan lebih teliti dalam mengamati objek yang ada di preparat,
sehingga objek dapat teridentifikasi lebih tepat dan jelas.

DAFTAR REFERENSI

Adnan. 2010. Perkembangan Hewan. Makassar : Jurusan Biologi FMIPA UNM

Makassar.
Balinsky, B.I. 1970. An Introduction to Embriology. W.B. Saunder Company :
London
Basri. 2012. Perkembangan Hewan. Makassar: Jurusan Biologi FMIPA UNM
Campbell. 2008. Biologi Umum Jilid 3 Edisi Kedelapan. Erlangga : Jakarta.
Connolly, M. H. 2010. High-Throughput Methods for Visualizing the Teleost
skeleton: Capturing Autofluorescence of Alizarin Red, dalam Journal of
Applied Ichtyologhy. 26 (2010), 274277.
Jasin, Maskoeri. 1992. Zoologi Vertebrata. Surabaya: Sinar wijaya.
Jessop, N. M. 1988. Theory and Problem of Zoology. B & JO Entreprise Pte Ltd,
Singapore.
Soeminto. 2000. Embriologi Vertebrata. Fakultas Biologi UNSOED: Purwokerto.
Sudarwati. 1990.Dasar-dasar Struktur dan Perkembangan Hewan .ITB: Bandung
Storer. 1978. General Zoology. McGrawHill Publishing Company : New York.
Villee, C. A., W. F. Walker, and R. D. Barnes. 1988. Zoologi Umum. Erlangga :
Jakarta.
Yatim, W. 1983. Embriologi. Tarsito : Bandung.