Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode

parafin melalui beberapa tahapan, yaitu (Widjajanto, 2001):

a. Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting)

Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari

sumber alami baik berupa tumbuhan yang akan digunakan sebagai bahan dasar

dalam mikroteknik. Pada jaringan tumbuhan setelah dilakukan pengambilan

diperlukan proses pencucian (washing). Pencucian (washing) adalah suatu tahap

yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan. Pencucian ini perlu

dilakukan karena jaringan yang diambil pada pada tumbuhan sering kali dalam

keadaan kotor.

Pencucian (Washing) jaringan yang diambil pada hewan perlu dilakukan

pencucian karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keadaan

kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan

hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu

secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara.

Pencucian (Washing) merupakan tahap yang membedakan metode paraffin hewan

dengan tumbuhan, pada pembuatan preparat tumbuhan tidak dilakukan pencucian.

Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam

fisiologis. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai: NaCl 0.8-0.9%, Larutan

Ringer, dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin. Komposisi

larutan ringer adalah: (NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah

panas), (NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin). NaCl

merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15

menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan
menyebabkan pembengkakan sel. Syarat dalam pengambilan objek ini adalah

sebagai berikut: 1). objek yang diambil dalam kondisi sehat, 2). objek yang

diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan, 3). menggunakan pisau yang

tajam, 4). ukuran jaringan yang diambil kurang lebih 0.5 cm. 5. langsung dicuci

dan difiksasi

b. Fiksasi (Fixation)

Fiksasi (fixation) adalah usaha mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan

agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun

ukuran. Media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri dari

unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi agar

jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan. Fiksatif yang

sering digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah FAA (Formaldehyde

Acetic Acid). Formula FAA untuk jaringan tumbuhan adalah: Ethil alkohol (50 ml),

Asam asetat grasial (5 ml), Formalin (10 ml), Akuades (35 ml). FAA ini juga dapat

digunakan untuk jaringan hewan. Formula FAA untuk jaringan hewan adalah: Formalin

(10 ml), Alkohol 70% (90 ml), Asam asetat grasial (2 ml). 

Fiksasi (fixation) dilakukan selama 3 jam, tanpa pencucian. Lama jaringan

disimpan dalam larutan fiksatif tergantung pada: 1) Jenis jaringan, misalnya jaringan

tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan intestinum. 2). Tebal atau tipisnya jaringan

atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar jaringan yang difiksasi maka semakin lama

waktu yang diperlukan. 3). Jenis fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi

yang berbeda. 

Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan

metode parafin adalah: 1). mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)

jaringan dengan cepat, sedangkan keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.

2). mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme

ataupun kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang

dikenal dengan autoloisis. 3). Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan

keras (mordant) yang merupakan komponen jaringan fiksatif. 

Aerasi merupakan proses penarikan udara dari dalam jaringan dengan cara

di vakum, yang bertujuan untuk memudahkan fiksatif masuk ke dalam jaringan

dengan sempurna,. Tahap ini diutamakan pada jaringan tumbuhan, karena sel pada

jaringan hewan hanya terdiri dari membran sel dan vakuola yang kecil, sehingga

udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan mudah keluar

melalui membran sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan pada sel tumbuhan

memiliki dinding sel dan vakuola yang besar, sehingga mengandung banyak udara

yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan melalui dinding sel yang tebal

waktu fiksasi

c. Dehidrasi (dehydration)

Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan

menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk

mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah difiksasi. Proses dehidrasi

merupakan serangkaian proses dengan cara memasukan sample ke dalam larutan

dehidrasi secara berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dengan

mengurai konsentrasi air.

Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode

paraffin adalah alkohol. Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol,

aniline oil dan bergamot oil. Alkohol merupakan dehidran yang umum digunakan,

karena relatif lebih murah dan mudah diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil

yang baik, bahkan untuk jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak, sumsum

tulang belakang, dan embrio. Dalam penggunaan alkohol dipakai serial dengan
konsentrasi yang berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi.

Lama perendaman tergantung untuk masing-masing konsetrasi berkisar 1-6 jam.

Alkohol 70% sebagai stoping point, jaringan di malamkan.

Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alkohol dilakukan setingkat

demi setingkat. Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan

secara tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang

terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti masih

ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini

dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat penjernih,

dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah lama dalam

larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan harus

dikembalikan ke dehidran.

d. Penjernihan (Clearing)

Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi.

Tujuan dari penjernihan ini adalah menggantikan tempat alkohol sementara dalam

jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium

penjernih sebelum proses penanaman dalam parafin. Medium penjernih ini akan

menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai

dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.

Lama jaringan dalam medium penjernih tergantung pada: 

1. Ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan. 
2. jenis reagen yang dipakai. 
3. bila dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah setengah
hingga tiga jam. Bila dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka jaringan akan
mengeras dan rapuh yang tentunya sulit untuk disayat. 
4. Jenis jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam
menggunakan minyak cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung
menjadi keras atau getas bila dijernihkan dengan xilol atau benzene. 
Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih: minyak aniline,
Benzene, karbon tetraklorida, karbon bisulfida, minyak kayu cadar, kloroform,
minyak cengkeh, Xylol. 
e. Infiltrasi (Infiltration)

Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman

(embeddingmedia) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan

dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang

digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya

dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis parafin

yang digunakan. Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan parafin keras

dengan titik leleh 56°C-58°C. Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn

langsung dimasukan ke dalam parafin murni, tetapi sebelum parafin murni

jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan

parafin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan

campuran ini terlalu lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar

kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dsri

prubahan lingkungan yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang

mendadak ini dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti

jaringan menjadi sangat mengkerut.

Setelah dalam campuran parafin dan bahan penjernih, jaringan baru

dipindahkan ke parafin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya

berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan

dalam oven.Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan
parafin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang

sama seperti hidup.

f. Penanaman (Embedding)

Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau

penanaman jaringan ke dalam balok-balik parafin (cetakan) sehingga

memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini

adalah untuk membuat balok parafin yang berisi jaringan yang akan dibuat

preparat permanen.

Parafin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh

yang sama dengan parafin yang digunakn waktu infiltrasi. Parafin ketiga yang

dipakai pada infiltrasi dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat

memang sudah bersih dari bahan penjernih.

g. Penyayatan (Sectioning)

Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin

yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk

membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop.

Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan,

diantaranya adalah yaitu proses embedding lebih cepat dan lebih simpel.

h. Penempelan dan Afiksasi (Afixing)

Afixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada

kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu, dapatberupaparafinpadat yang

dicairkan lalu dimasukkan kedalam box ukuran tertentu dan dibiarkan memadat.

Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita parafin yang sudah berisi

sayatan jaringan pada kaca objek.

i. Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining)

Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan

menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek.

Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan.

Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari parafin.

Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk memperjelas

berbagai elemen jaringan, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan

ditelaah dengan mikroskop tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga

sulit untuk diamati.

j. Penutupan dan Labelling

Langkah terakhir adalah menyimpan sayatan dalam canada balsem serta

menutupnya dengan kaca penutup. Penempatan kaca penutup hendaklah

dilakukan dengan rapi dengan cara menempatkan suatu sisi kaca tersebut samping

sayatan kemudian dengan hati-hati sisi dihadapannya diturunkan dengan jarum.