1

Kegiatan ke 2
Pembuatan Preparat Jaringan Hewan
(Dengan Metode Paraffin Block)

A. Tujuan Kegiatan
l. Mahasiswa dapat nłengetalłui teknik pembuatan preparat jaringan hewan
dengan menggunakan paraffin block
2. Mahasiswa dapat membuat preparat jaringan hewan dengan menggunakan
paraffin block
3. Mahasiswa dapat mengidentifikasi dan menyajikan hasil preparat jaringan
hewan dengan menggunakan paraffin block
B. Kajian Pustaka
Mikroteknik adalah teknik atau cara pembuatan sediaan secara
mikroskopis. Yang dimaksud dengan sediaan adalah semua obyek yang akan
diamati atau diperiksa dalam kegiatan praktikum biologi. Sediaan dalam
praktikum biologi dapat dibedakan berdasarkan macam, sifat, dan ukurannya.
Berdasarkan macamnya sediaan dibedakan atas sediaan mikroskopis dan
makroskopis, berdasarkan sifatnya ada sediaan basah dan permanen, sedangkan
berdasarkan bentuknya dibedakan atas sediaan utuh (whole mount) dan sediaan
irisan atau potongan. Mikroteknik disebut juga dengan istilah Histolgcal
Techniques yang sangat diperlukan untuk mendukung bidang ilmu;
mikroanatomi (histologi), sitologi, genetika sel, imunologi, mikrobiologi,
patologi, dan biologi perkembangan (Jailani, 2011: l).
Setiap makhluk hidup dapat berperan sebagai sumber sediaan basah
maupun permanen, baik keseluruhan maupun sebagian, misalnya: darah, cairan
eksudat, jaringan lunak, jaringan keras, epitel mukosa, embrio, kutu kepala, kutu
kucing, spirogyra, ujung akar bawang merahm ujung batang tanaman, daun dan
sebagainya. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sediaan
permanen antara lain: organ-organ yang besar diambilsebagian misalnya hepar
atau liper, organ yang berongga perlu dibuat ligature, diinjeksi cairan fiksatif
secukupnya, untuk organ yang tipis diperlukan perentangan di atas cawan petri
dengan menggunakan alat non fiksatif, sedangkan organ yang keras seperti
tulang keras diperlukan metode penggosokan memanjang atau melintang atau
dengan melakukan proses deklasifikasi (menghilangkan unsur kalsium dari
dalam jaringan) (Jailani, 2011: 1).
Metode paraffin digunakan untuk membuat sediaan permanen yang disayat
atau dipotong. Untuk mendapatkan irisan jaringan yang tipis digunakan paraffin
sebagai penyokong. Paraffin dapat emberikan konsistensi yang kuat sehingga
pemotongan lebih mudah dilakukan (Jailani, 2011 : 5).
Menurut Jailani (2011, 5) cara oembuatan sediaan secara garis besar dengan
menggunakan metode paraffin meliputi:
 2

1. Collecting (pengumpulan spesimen) dan fiksasi dengan bahan fikastif

2. Washing (pencucian) untuk menghilangkan sisa-sisa bahan fiksatif
3. Dehidrasi (menarik air dalam jaringan) dengan menggunakan alkohol
bertingkat dari konsentrasi 50% sampai dengan 100% (absolut)
4. Clearing (menjadikan jaringan lebih jernih dan transparan), menggunakan
bahan minyak seperti xylol atau xylene
5. Infiltrasi (penyusupan paraffin ke dalam rongga-rongga sel atau jaringan)
menggunakan paraffin cair yang telah dipanaskan, proses infiltrasi
berlangsung di dalam pemanas paraffin
6. Embedding (pembenaman atau penanaman potongan jaringan dalam block
paraffin)
7. Sectioning (pemotongan jaringan dalam block paraffin menjadi pita-pita
coupes) dengan memakai mikrotom putar (rotary microtome)
8. Affiixing (penempelan coupes dalam seri pewarnaan tertentu)
9. Staining (pewarnaan coupes dalam seri pewarnaan tertentu)
10.Mounting (pemberian perekat dengan indeks bias yang sama dengan
indeks bias object glass dan cover glass, sering digunakan entelan sebagai
mounting media)
11.Labelling (pemberian label atau keterangan yang memuat lab
penghasil, bahan sediaan, asal jaringan, arah potongan dan macam
pewarnaan)
Menurut Jailani (2011, 5-6) beberapa hal yang perlu diperhatikan
dalam pembuatan sediaan dengan metode paraffin:
1. Jangan mengoleksi potongan jaringan terlalu tebal, sehingga proses
fiksasi berlangsung lebih lama
2. Saat pencucian jangan terlalu lama jaringan direndam di dalam air,
karena jaringan akan menyerap air terlalu banyak
3. Proses dehidrasi, clearing dan infiltrasi lakukan sesuai dengan jadwak
waktu yang telah ditentukan
4. Sebelum melakukan embedding jaringan disesuaikan dulu dengan
paraffin panas yang telah disiapkan
5. Saat melakukan embedding suasana suhu jaringan dengan paraffin harus
sama, sehingga jaringan melekat erat dengan paraffin
6. Lakukan triming sebelum jaringan dipotong dengan menggunakan
mikrotom putar, agar coupes tidak melipat pada saat pemotongan
7. Bentangkan coupes pada water bath atau langsung ditempelkan pada
object glass yang sebelumnya telah diolesin gliserin-albumin 1 : 1
8. Keringkan coupes pada oven paraffin hingga paraffin melekat pada
object glass
9. Warnai coupes dalam seri pewarnaan sesuai dengan metode pewarnaan
yang dibutuhkan
 3

10. Bersihkan kaca objek dari sisa-sisa pewarnaan dan xylol yang masih
menempel sebelum memberikan mounting media berupa entellan
11. Saat mounting usahakan tidak ada gelembung udara yang terjebak
diantara object glass dan cover glass
Metode yang digunakan pada penelitian kali ini adalah metode paraffin
yaitu metode yang paling sering digunakan. Keuntungan menggunakan metodi
ini yaitu pertama, irisan dapat lebih tipis dibandingkan enggunakan metode
lainnya yaitu daoat mencapai ketebalan rata-rata 6 mikrometer. Kedua, irisan
yang sifatnya seri dapat mudah dikerjakan. Ketiga, prosespengerjaannya lebih
cepat dibandingkan dengan metode seloidin (mikrotom beku). Selain
keuntungan tentu ada kerugian dari metode ini yaitu jaringannya akan menjadi
keras, mengerut dan mudah patah serta untuk jaringan yang besar akan sulit
dikerjakan dan enzim-enzim akan Iarut pada metode ini (Sari, 2015: 1l).
Proses pengolahan pembuatan block ini dimulai dari fiksasi, pencucian
(washing), dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi paraffin, penanaman
(embedding), penyayatan (section), penempelan (affixing), deparafinisasi
pewarnaan (staining), penutupan (mounting), dan labelling (Sari, 2015: 1l).
Fiksasi merupakan suatu usaha untuk mempertahankan
komponenkomponen sel atau jaringan agar tidak mengalami perubahan dan tidak
mudah rusak. Proses fiksasi ini diharapkan setiap molekul pada jaringan yang
hidup tetap berada pada tempatnya dan tidak ada molekul baru yang timbul. Pada
prosesnya ini tentu tidak akan berjalan dengan sempurna, apabila timbul molekul
asing baru padajaringannya disebut artefak (Sari, 2015: 11-12). Menurut Jailani
(2011, 7) tahap dalam fiksatif, yaitu:
1. Larutan fixatif: Bouin's solution
Bahan: Picric acid jenuh, aquosa 75 ml, Formaldehyde 25 ml, Glacial
acetic acid 5 ml
2. Potong-potong jaringan yang akan dibuat sediannya (insang, jantung,
ginjal, otak, tulang, dan lain-lain) sebesar 1x1 cm
3. Isilah botol plakon dengan Iarutan fiksatif. Usahakn organ atau jaringan
sediaannya terendam. Usahakan jaringan tidak melipat atau melengkung
dan banyaknya Iarutan fiksatif yang digunakan paling sedikit 10 kali
besarnya jaringan sehingga dapat terendam
4. Beri labellah botol plakon tersebut sesuai dengan jenis yang ada di
dalamnya dengan pensil 2B
5. Rendam selama 24 jam untuk jaringan otot. 5-6 jam untuk jaringan yang
lunak seperti rendan hepar.
Dehidrasi merupakan metode yang digunakan untuk mengeluarkan
seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan setelah dilakukan proses
fiksasisehingga nantinya dapat diisi dengan paraffin untuk membuat block
preparat. Proses dehidrasi ini menggunakan alkohol bertingkat. Mulai dari
alkohol 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, dan alkohol absolut. Prosesnya, suatu
 4

jaringan akan dicelupkan dimasing-masing alkohol dengan kisaran waktu

tertentu sampai prosesnya berakhir (Sari, 2015: 12).
Berbagai jenis dehidratan yang dapat digunakan antara Iain adalah etanol
atau alkohol, isopropil alkohol, dan aseton. Dehidratan yang digunakan berseri
mulai dari kadar rendah yang banyak mengandung air hingga kadar tinggi. Untuk
jaringan embrionik akan memberikan hasil lebih baik jika dimulai dengan etanol
30%. Etanol merupakan cairan bening, mudah terbakar, hidrofilik, dan larut
dalam air hingga kadar tinggi (Jailani, 2011: 2).
Menurut Jailani (2011, 7-8) tahapan dehidrasi bertahap, yaitu:
1. Siapkan larutan alkohol dengan urutan konsentrasu menaik dari 70%, 80%,
90%, 95% dan alkohol absolut. Tempatkan masing-masing larutan tersebut
dalam suatu tempat atau botol dan beri label Iuarnya.
2. Buanglah larutan fiksatif bouin's tersebut dengan alkohol 70%, dikosvok-
kocon hingga bersih dan diganti setiap 1/2 jam sekali (tidak mutlak) jangan
berpindah kelarutan diatasnya jika dalam larutan alkohl 70% ini belum jernih
untuk proses selanjutnya pekerjaan tidak boleh dihentikan kembali pada tahap
dehidrasi dalam alkohool 70% relatif cukup aman dapat ditunda hingga
beberapa hari
3. Gantilah semua larutan alkohol 70% dengan alkohol 80% selama 3x 1/2 jam
4. Gantilah semua larutan alkohol 80% dengan alkohol 90% selama 3x 1/2 jam
5. Gantilah semua larutan alkohol 90% dengan alkohol 95% selama 3x l/2 jam
6. Gantilah semua larutan alkohol 95% dengan alkohol absolut selama3x1/2 jam
Penjernihan adalah metode yang digunakan mengeluarkan alkohol dari
jaringan dan menggantikannya dengan suatu larutan yang berikatan dengan
paraffin. Pada proses clearing ini sangat kruisal karena apabila di jaringan masih
tersisa alkohol walaupun sedikit, paraffin tidak akan nisa masuk ke dalam
jaringan. Sehingga jaringan nantinya tidak akan sempurna dalam pembuatan
blocking, pemotongan, dan pewarnaan. Proses clearing ini menggunakan
bermacam-macam zat penjernih yaitu xylol atau xylene dan toluol atau toluene
yang memiliki kelebihan dan kekurangannya masingmasing. Xylol atau xylene
kelebihannya yaitu prosesnya cepat dan harganya tidak terlalu mahal.
Kekurangannya yaitu jaringan dapat dipindahkan hany dari alkohol absolut, dan
jaringan yang dijernihkan dengan xylene tidak begitu jelas menjadi transparan,
sehingga tidak diketahui proses ini berjalan sempurna atau tidak (Sari, 2015: 12).
Toluol atau toluene kelebihannya yaitu sudah banyak dipergunakan oleh
kebanyakan laboratorium, harganya murah, mudah didapat, dan jaringan yang
penjernihannya sempurna akan terlihat jelas transparan. Tetapi apabila jaringan
tidak terlihat transparan berarti proses dehidrasi yang sebelumnya belum
sempurna. Kekurangannya yaitu jaringan hanya bisa dipindahkan dari alkohol
absolut apabila jaringan terlalu lama di toluol akan menyebabkan kerasnya
jaringan sehingga sukar untuk dipotong menggunakan mikrotom (Sari, 2015: 12-
13).
 5

Penanaman (embedding) merupakan proses untuk mengeluarkan cairan

pembening dari jaringan dan digantikan dengan paraffin. Jaringan ini harus
terbebas dari cairan pembening karena nantinya akan mengkristal dan sewaktu
dipotong jaringan akan dibenamkan di larutan parffin selama 3x dan dalam
jangka waktu tertentu sambil dipanaskan agar paraffinnya tidak membeku.
Keuntungan menggunakan paraffin dengan titik lebur rendah yaitu jaringannya
tidak mudah menjadi rapuh. Sedangkan keuntungan memakai paraplast yaitu
sifat paraffinnya sangat elastis sehingga tidak mudah robek atau rusak ketika
dipotong (Sari, 2015: 13).
Menurut Jusuf (2009, 19) zat pembenam (impregnasi agent) yang
dipakai adalah:
1. Paraffin cairan panas yang mempunyai temperatur lebur (melting
temperature)
2. Paraffin hisotek khusus (tissue mat) dengan suhu 560C
3. Paraplast yaitu campuran paraffin murni dengan beberapa polimer plastik
Keuntungan memakai paraffin dengan titik lebur rendah adalah jaringan
tidak mudah menjadi rapuh/ garing. Keuntungan memakai paraplast adalah sifat
paraffinnya lebih elastis sehingga tidak mudah sobek ketika dipotong dengan
mikrotom dan dapat dipotong lebih mudah (Jusuf, 2009: 20).
Pembuatan blocking merupakan proses pembuatan proses agar dapat
dipotong menggunakan mikrotom. Proses ini menggunakan paraffin sebagai alat
menempelkan jaringannya agar mudah dipotong. Prosesnya yaitu dengan
menyiapkan tempat blockingnya, dan menuangkan paraffin dilanjutkan dengan
memasukkan organ ke dalam paraffin yang sudah disediakan. Selanjutnya
setelah block paraffin kering dan sudah beku dapat dikeluarkan dari tempat
blocking dan dapat dilanjutkan ke proses selanjutnya. Block paraffin yang sudah
beku akan dipotong harus diberi label atau disebut affiksing, metode ini
bertujuan agar diketahui organ yang akan dipotong nanti. Pengecoran (blocking)
adalah proses pembuatan block preparat agar dapat dipotong dengan mikrotom
(Sari, 2015: 13).
Pemotongan (mounting) adalah proses pemotongan block preparat dengan
menggunakan mikrotom (Jusuf, 2009: 21).
Menurut Jusuf (2009, 21) sebelum melakukan pemotongan rangkaian
persiapan yang harus dilakukan adalah:
l. Persiapan pisau mikrotom
Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat
dipotong dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang
baik. Pisau mikrotom kemudian diletakkan pada tempatnya di mikrotom
dengan sudut tertentu. Rekatkan block paraffin pada holder
denganmenggunakan spatula atau scalpel. Letakkan tempat duduk blok
paraffin beserta block preparat pada tempatnya pada mikrotom
2. Persiapan kaca objek
 6

3. Persiapak waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C
4. Persiapan sengkelit atau kuas
Menurut Jusuf (2009, 21-22) teknik pemotongan paraffin yang
mengandung preparat adalah sebagai berikut:
l. Rekatkan blok paraffin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di
mikrotom. Tempat duduk blok paraffin beserta blok paraffinnya kemudian
diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan
kuat
2. Letakkan pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya.
Biasanya sudut kemiringan berkisar 20-300 C
3. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya diapaki ketebalan antara
5-7 mikrometer
4. Gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok
preparat secara teratur dn ritmis. Buang pita-pita paraffin yang awal tanpa
jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat
jaringan
5. Pita paraffin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati
menggunakan sengkelit atau kuas ke dalam waterbath yang temperaturnya
diatur 37-40 0C dan biarkan beberapa saat hingga pita paraffin tersebut
mengembang
6. Setelah pita paraffin terkembang dengan baik, tempelkan pita paraffin
tersebut pada kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca
objek itu ke dalam waterbath dan menggerakannya ke arah pita paraffin.
Dengan menggunakan sengkelit atau kuas pita paraffin ditempelkan pada
kaca objek. Setelah melekat kaca objek digerakkan keluar dari waterbath
dengan hati-hati agar pita paraffin tidak melipat
7. Letakkan kaca objek yang berisi pita paraffin di atas hot plate dengan
temperatur 40-45 0C, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah
dengan melewatkan kaca objek diatas api sehingga pita paraffin melekat erat
di atas kaca objek
8. Setelah air kering dan pita paraffin telah melekat dengan kuat. Simpan kaca
objek berisi potongan paraffin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai
Pewarnaan adalah teknik untuk memberikan warna pada komponen
selular dengan tujuan dapat membedakan antar sel tersebut. Warna adalah
persepsi dari mata yang dapat dibedakan berdasarkan panjang gelombang.
Teknik pewarnaan ini membantu dalam menghasilkan kontras dimana setiap
warna memiliki afinitasnya masing-masing (Sari, 2015: 15).
Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin (HE) adalah jenis pewarnaan rutin
yang paling umum dipakai. Prosedur ini digunakan dalam proses pembuatan
preparat histopatologi dan berbagai spesies hewan sakit atau mati akan
memerlukan pemeriksaan histopatologi untuk peneguhan diagnosis hewan yang
bersangkutan (Muntiha, 2011: 1).
 7

Hematoksilin yang berfungsi untuk memulas inti sel dan memberikan

warna biru (basofilik) serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin,
digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan
memberikan warna merah muda dnegan nuansa yang berbeda (Jusuf, 2009: 24).
Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun
1863. Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila
ditambahkan senyawa lainnya seperti aluunium, besi, krom, dan tembaga.
Senyawaan hematoksilin yang sering dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu
hematein. Proses oksidasi senyawaan hematoksilin ini dikenal sebagai ripening
dan dapat dipercepat prosesnya dengan menambahkan senyawaan yang
bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida, hidrogen peroksida,
potassium pennaganat dan sodium iodat (Jusuf, 2009: 24).
Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hamtoksilin untuk
mewarnai inti sel akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses
oksidasi telah selesai. Untuk memperpanjang proses ini larutan hemaktosilin
dapat disimpan dalam wadah tertutup dan disimpan dalam ruangan gelap.
Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan diganti sekurangkurangya
seminggu sekali. Jenis hemaktosilin y sering dipakai adalah mayer, delafied,
erlich, safranin, dan phloxine (Jusuf, 2009: 24).