Kromatografi Cair
Kromatografi Cair
KROMATOGRAFI CAIR
kelarutannya dalam fase diam kecil. Ada dua tipe dalam kromatografi partisi yaitu
:
1. Normal phase chromatography atau kromatografi fase normal, bila fase
diamnya bersifat polar dan fase geraknya bersifat non polar. Fase diam
yang dapat digunakan adalah amino (-NH2), Cyano (-CN) dan Diol
(glycidoxy-ethilmethokxysilane)
2. Reverse phase chromatography atau kromatografi fase terbalik, bila fase
diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar. Fase diam
yang dapat digunakan adalah RP-2 ( Si-CH2-CH3 ), RP-8 (Si-(CH2)7CH3), RP-18 (Si-(CH2)17-CH3.
Ion Exchange Chromatography atau Kromatografi Penukar Ion
Fase diam yang digunakan adalah molekul yang memiliki muatan ionik di
permukaannya dan muatannya berlawanan dengan muatan ionik solut. Kadang
molekul fase diam ini diikatkan pada bahan penyangga. Kromatografi tipe ini
cocok digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa ionik.
Pada gambar di atas fase diam mempunyai muatan positif. Bila ada solut
yang bermuatan positif lebih kuat maka dapat mendesak dan menggantikan
muatan positif fase diam dan terjadilah proses retensi solut dalam fase diam.
Adanya perbedaan kekuatan interaksi antara solut dan fase diam menyebabkan
terjadinya pemisahan. Ada dua macam kromatografi penukar ion yaitu :
1. Penukar kation (cationic exchange}, bila muatan yang dipertukarkan
adalah positif
X+ + R-K+
X+R- + K+
X-R+ + Cl-
CONTOH SOLVEN
II
ALKOHOL ALIFATIK
III
IV
DIKLORMETAN, 1,2-DIKLOROETIL
1,2
VI
VII
VIII
KLOROFORM, M-KRESOL,
M
AIR
Terlalu mahal
Viskositas rendah
Sampel yang terdiri dari campuran senyawa yang meiliki kisaran harga
factor kapasitas 0.5<k'<20
Namun demikian teknik SPE memiliki kekurangan yaitu variabilita isi dari tiap
Pemekatan sampel
Penggantian pelarut
Derivatisasi in situ
gas.
Detektor
yang
paling
banyak
dipergunakan
adalah
Kecepatan alir fase gerak, kecepatan alir yang sangat lambat akan
menyebabkan terjadinya difusi longitudinal, sedangkan bila terlalu cepat
akan menyebabkan terjadinya transfer masa non ekuilibrium, sehingga
terjadi pelebaran pita kromatogram
Ukuran partikel fase diam, semakin kecil ukuran partikel maka efisiensi
semakin baik Tetapi menyebabkan tekanan dalam kolom semakin besar
sehingga dibutuhkan kekuatan pompa yang semakin besar.
Viskositas fase gerak, semakin kecil harga viskositas fase gerak maka
efisiensi kolom semakin besar.
Volume
ekstra
kolom,
semakin
besar
volume
ekstra
kolom
Jumlah sampel dan volume sampel, bila jumlah maupun volume sampel
sangat besar (overload) maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita
semakin besar, sehingga efisiensi semakin berkurang.
Detector, merupakan alat untuk melihat adanya sinyal dari analit atau solut yang
sedang dianalisis. Hendaknya memiliki kriteria : sensitivitasnya tinggi, batas
deteksi rendah, linearitas respon tinggi dan reprodusibilitasnya tinggi. Ada
banyak detektor yang dapat diaplikasikan, yaitu :
Fase gerak yang dipakai tidak boleh menyerap sinar uv/vis pada panjang
gelombang yang dipilih.
PEPTIDA
C18 atau C8
PROTEIN
C4, C3, CN
Dimensi Partikel
0.46 X 15 atau 25 cm
0.46 x 5-15 cm
3.5-10 m (diameter)
3.5-10 m (diameter)
80-300 A (pori)
300 A (pori)
0.12% TFA/air
0.12% TFA/air
Solven B Gradien
0.10%TFA/air
0.10%TFA/air
Temperatur
40 - 80 C
40 - 80 C
Kecepatan alir
0.5 - 2 ml/menit
0.5 - 2 ml/menit
10-50 L
10-50 L
Berat
1-100 g
1-100 g
Recovery rendah
Faktor penyebab :
Kolom rusak, terlalu asam, terlalu hidrofob, terlalu kecil ukuran poriporinya
Denaturesi sampel
Pengatasannya :
Contoh aplikasi pemisahan peptida dan protein dengan ion exchange HPLC
Kondisi yang bisa dipakai :
VARIABEL
PROTEIN ASAM
PROTEIN BASA
(ANION EXCHANGE)
(KATION EXCHANGE)
Kolom
Bonded phase
CM, SP
Ukuran
5-25 x 0.46cm
5-25 x 0.46 cm
asetat
Na-asetat
35 c
1.0ml/ menit
35 c
l.0ml/menit
Fase gerak
Solven A
Solven B
Gradien
Temperatur
Kecepatan alir
Ukuran sampel
10-50 l
10-50 l
Volume Berat
1-100 g
1-100 g
Keuntungan :
Variabel
Kondisi
Fase diam
C18, panjang 15 cm
Fase gerak
Elusi
Temperatur
Temperatur kamar
Detektor
Spektrofotometer UV 254 nm
Volume injeksi
20 l
Perhitungan
Standard eksternal
Variabel
Kondisi
Fase diam
C18, panjang 15 cm
Fase gerak
Temperatur
Temperatur kamar
Detektor
Volume injeksi
20 l
Perhitungan
Standard eksternal