TEKNIK-TEKNIK DASAR

Di Inggris manupulasi gen didefenisikan sebagai pembentukan

kombinasi baru materi yang dapat diturunkan dengan

melakukan penyisipan (insertion) molekul-molekul asam
nukleat, yang dihasilkan dengan cara apapun di luar sel,
kedalam suatu virus, plasmid bakteri atau sistem pembawa
lainnya

yang

memungkinkanb

terjadinya

penggabungan

kedalam organisme inang secara tidak alami tetapi selanjutnya

mampu mengadakan penggandaan lagi. (Old, 1989)

Dorongan awal untuk memanipulasi gen terjadi pada awal

tahun 1970-an dengan adanya perkembangan serentak
teknik teknik untuk:
Transformasi Eschericia cooli
Pemotongan dan penggabungan molekul-molekul DNA
Pemantauan reaksi-reaksi pemotongan dan penggabungan.

(Old, 1989)

MASALAH-MASALAH DASAR
Terdapat kesulitan yaitu
Kurang tepatnya transkripsi dan translasi
DNA eksogen tidak dapat dipertahankan didalam sel-sel

yang mengalami transformasi

DNA eksogen gagal bergabung
Ujung replika tidak berfungsi di dalam sel inang. (Old,

1989)

Cara Pemecahan : Teknik-teknik Dasar

Cara pemecahan paling mudah adalah melekatkannya ke replikon
yang tepat. Bakterti dan plasmid kecil merupakan plasmid yang
paling tepat karena mereka merupakan replikon mereka sendiri.
Penyusunan

suatu

molekul

majemuk

atau

molekul

rekombinanbuatan semacam itu disebut juga rekayasa genetik

ataumanipulasi gen karena adanya potensi untuk murnikan dan
dipotong agar terbuka DNA penumpang harus disisipkan kedalam
molekul vektor untuk menciptakan rekombinan menciptakan
rekombinasi genetik baru secara biokimia. (Old, 1989)

Suatu vektor harus dilengkapi dengan:

vektor DNA harus dimurnikan dan dipotong agar
terbelah
DNA penumpang harus disisipkan kedalam molekul
vektor untuk menciptakan rekombinan buatan
Reaksi pemotongan dan penggabungan harus di pantau
Harus di tranformasikan ke sel inang. (Old, 1989)

Elektroforesis gel agarosa

gel tersusun atas polisakarida atatau agarosa. Agarosa

dipakai untuk mmemisahkan fragmen-fragmen DNA

yang mempunyai ukurannya beberapa ratus pasangan
basa. Polisakarida lebih suka oleh fragmen-fragmen
lebih kecil. Untuk fragmen DNA lebih besar telah
dikembangkan elektroforesis dalam agarosa dengan
bidang bergetar atau pembalikan bidang.
Molekul-molekul DNA itu beruatan negatif dan di
dalam medan listrik molekul DNA bergerak melalui
gel pada kecepaatan tergantung pada ukurannya.
(Old, 1989)

Pembuatan plot berdasarkan panjang fragmen atau

gerak molekul terhadap harga kebalikan kecepatan

bergerak akan memberikan suatu garis lurus dengan
rentangan yang lebih besar dibandingkan pembuatan
plot semilogasitma.
Keuntungan elektroforesis ini adalah pita DNA dapat
dideteksi dengan kepekaan tinggi. Pita-pita DNA
didlam gel terwarna karena membantu jembatan
dengan zat warna etidium bromida. (Old, 1989)

Metode Titik Southern, Northern, Dan Western

Mentransfer makromolekul dari gel, yang melalui gel ini mereka telah
dipisahkan secara elektroforetik, kepermukaan suatu suatu membran
sekali ditranformasi, makromolekul itu akan atau dapat dimobilisaasi atau
difksasi secara kurang lebih permanen pada membran membran ini relatif
mudah ditangani dan dapat digunakan untuk berbagai macam teknik
analisis.
Fragnmen-fragmen DNA retriksi didalam gel agarosa didenaturasi dengan
memberi perlakuan alakalis dan gelnya kemudian diletakkan diatas kertas
filter yang dijenuhkan dengan larutan penyangga. (Old, 1989)

Permukaan gel paling atas ditutup dengan filter

selulosa nitrat dan ditutupi lagi dengan kertas filter
kering Larutan penyangga akan merembes ke gel
karena ditarik oleh kertas filter keringdan bersamanya
ikut DNA yang denaturasi padari gel. Pada saat DNA
berinti
tunggal
ini
bersinggungan
dengan
nitroselulosa.
Proses pembentukan ini memakan waktu beberapa jam
hingga selesai dan hasilnya adalah pentransferan DNA
dari gel ke membran yang menyeruupai pola Sali
spaisal pita pada permukaan membran yang
menyerupai pola asli fraksionasi gel, dengan
kehilangan resolusi minimal. (Old, 1989)

Filter itu kemudian dimasukkan ke dalam larutan RNA

radioaktif , DNA yang berinti tunggal yang urutannya

komplemen dengan pita atau pita-pita DNA yang
dipindahkan dengan sistem bintik yang akan tredeteksi
Untuk menghilangkan radioaktivitas yang tidak terikat

dan

daerah-daerah

autoradiografi

hibridisasi

dengan

dideteksi

menempatkan

secara

membran

sehingga bersentuhan dengan film sinar-x. (Old,

1989)

Transformasi Escherichia coli

Mendel dan higa (1970) menemukan bila diperlakukan dengan CaCl,

sel-sel E. coli dapat mengambil DNA dari bakteriofag

Cohen (1972) menunjukkan bahwa sel-sel E.coli yang diperlakukan

dengan CaCl juga merupakan penerima efektif bagi DNA plasmid.

Hoekstra (1980) menunjukkan bahwa sel-sel RECBC+ dengan DNA

linearhanya mungkin dilakukan apabila sel melakukan rekombinasi

Hanahan

(1983) telaah meneliti kembali faktor-faktor yang

mempengaruhi

efisiensi

transformasi,

dan

telah

merancang

seperangkat kondisi untuk efisiensi optimal. (Old, 1989)

Transformasi organisme lain

Protoplas b subtilis ityu sudah mungkin di

transformasi teknik ini meningkatkan

frekuensi transformasi .
Teknik yang mirip digunakan untuk
mentransformasi actynimycetes yang barubaru ini ditunjuk kan bahwa
frekuensitransformasi dapat ditingkatkan
secara cukup dengan membungkus DNA di
liposom, kemudian mwemfungsikannya
dengan sel inang.
Protoplas merupakan keharusan pada
tumbuhan tingkat tinggi. (Old, 1989)

PRINSIP KLONING
Unsur-unsur yang esensial diperlukan dalam kloning adalah:
Enzim retraksi (enzim pemotong DNA)
Kloning vektor (pembawa)
Enzim lipase yang berfungsi untuk menyambung rantai DNA

Proses dasar kloning DNA

Pemotongan DNA
Penyambungan potongan-potongan fragmen DNA dengan enzim ligase
Transformasi rekombinan DNA
Seleksi (Edi, 2015)