Isolasi Plasmid
Isolasi Plasmid
Tanggal Pengumpulan
: 21 November 2014
disusun oleh :
Rahayu Jatiningsih
10612014
Kelompok 13
Asisten :
Riesa K.W.R
10611047
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA merupakan komponen terpenting yang dimiliki oleh mahluk hidup,
karena DNA adalah satuan fungsional terkecil yang pasti dimiliki oleh makhluk
hidup baik tanaman, binatang, manusia, bahkan bakteri. Untuk itulah, kegiatan
mempelajari DNA sangat dibutuhkan terutama dalam perkembangan ilmu genetik.
Tentunya ketika kita mempelajari DNA, isolasi terhadap DNA tersebut penting
untuk dilakukan. Isolasi DNA juga dibutuhkan dalam menyelidiki kasus tertentu
seperti pembunuhan, pencurian, dsb. (Haris et al., 2005).
Pada praktikum kali ini hal yang dilakukan salah satunya adalah isolasi
DNA. DNA yang digunakan bukanlah DNA genom melainkan DNA plasmid,
karena Plasmid memiliki suatu kekhususan yaitu mudah disisipi oleh gen lainnya
dan mampu bereplikasi beberapa kali dalam satu kali masa replikasi,
menyebabkan jumlahnya dapat bertambah dengan sangat cepat (Szczepanowski,
2008). Dari sifat khas itu, plasmid sering dimanfaatkan untuk menjadi vektor
suatu gen atau untuk menghasilkan ekspresi gen yang besar, seperti pada produksi
insulin. Penjelasan tersebut cukup mendukung pemilihan DNA plasmid dalam
percobaan dibandingkan DNA genom.
Dalam mempelajari DNA tentu saja tidak terlepas dari adanya suatu gen. Pada
gen terdapat urutan basa nukleotida yang membentuk rantai ganda yaitu DNA itu
sendiri. Ketika melakukan Amplifikasi Gen, sequence DNA ikut diperbanyak.
Amplifikasi gen sangat dibutuhkan dalam ilmu Rekayasa Genetika, pengetahuan
dalam ilmu forensik, serta diagnosis penyakit. Amplifikasi gen dapat dilakukan
dengan metode PCR. Kegiatan PCR ini dilakukan karena merupakan solusi
terbaik untuk menyediakan jumlah DNA yang banyak dari sampel suatu segmen
DNA yang tersedia dalam jumlah sedikit. Dalam waktu hitungan jam, sampel
DNA yang diperbanyak bisa berkembang jumlahnya menjadi jutaan kali lipat,
cukup untuk menyediakan DNA dalam sumber penelitian (Reece, 2012).
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
purifikasi dari molekul DNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Plasmid
Plasmid sering disebut sebagai DNA sirkuler. Hanya beberapa organisme
yang memiliki Plasmid tersebut, seperti tanaman yang memiliki klorofil,
prokariot, dan mitokondria. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal, hal
inilah yang membedakannya dengan DNA genom yang berada dalam
kromosom (Alberts, 2012). Plasmid memiliki suatu kekhususan yaitu mudah
disisipi oleh gen lainnya dan mampu bereplikasi beberapa kali dalam satu kali
masa replikasi, menyebabkan jumlahnya dapat bertambah dengan sangat cepat
(Szczepanowski, 2008).
Plasmid pada umumnya memiliki struktur tersier yang sangat kuat dan
kompak, yang biasanya membentuk sirkular. Sedangkan DNA genom jauh
lebih longgar pada ikatan di kedua untaiannya sehingga menyebabkan DNA
genom mudah sekali terdegradasi dibandingkan DNA plasmid (Susanto,
2012). Plasmid yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah PGEMT-easy
yang digambarkan pada peta plasmid berikut,
pada tahun 1993 atas hasil penemuannya ini. Masalah yang timbul sebagai awal
penciptaan PCR ini adalah bagaimana cara meneliti tentang suatu rantai DNA,
namun sumber DNA yang tersedia hanya sedikit. Maka diciptakanlah metode
PCR yang bisa masih bisa dimanfaatkan oleh para ahli di bidang genetika sampai
sekarang (Lo, 2006).
Menurut Lo (2006), prinsip dasar yang dilakukan PCR sebenarnya sangat
sederhana, karena PCR memiliki prinsip kerja berlandaskan terjadinya replikasi
DNA yang terjadi selama proses pembelahan sel. Siklus PCR dapat dilihat pada
gambar 2.2 berikut ini,
1
3
2
6
4
Keterangan :
1.
2.
3.
4.
5.
Denaturasi 1
Denaturasi 2,3,...,n
Annealing
Elongasi 1,2,...,n-1
Elongasi n
6. Cooldown
Dari profil di atas, terjadi
pengulangan proses 2 3 4
sebanyak 30 kali ( 30 siklus)
2.3 Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik yang dapat mengukur laju perpindahan
atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip
kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan
negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif
(anoda), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (anoda). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil
amplifikasi
dari
DNA.
Hasil
elektroforesis
yang
terlihat
adalah
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel
karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan
2.
6. Voltase
BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan
Pada praktikum isolasi DNA plasmid dan amplifikasi gen menggunakan PCR,
alat dan bahan yang dibutuhkan adalah sebagai berikut
Tabel 3.1 Alat dan Bahan
Alat
Alat Sentrifuga
Vortex
Mikropipet
Tips
Inkubator
Alat Elektroforesis
- Cetakan gel untuk
membuat agarosa
- Alat pencetak sumur
- Tangki elektroforesis
- Sumber Arus
Mesin PCR
Tabung Eppendorf 0,2 ml
Alat pemanas
Bahan
1000 l kultur bakteri
Escherichia coli
Mikrotube 1,5 ml
300 l solution I
400 l solution II
200 l solution III
Isopropanol
EtOH 70 %
TE 50 l pH 8,0
Dream Taq 5 l
Primer forward 1 l
Primer Reverse 1 l
Deion
DNA template 1 l
dNTPs
MgCl2
Agarosa
TAE 50x
- 100 ml = 24,2 g Tris
- 5,71 ml Asam Asetat glasial
- 10 ml 0,5 M EDTA
Loading buffer 6x
- 0,25 % bromfenol biru
- 40 % sukrosa
- 30 mg/ml methyl green
Etidium Bromida (0,2 0,5
mg/ml)
Elektroforesis
BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
4.1.1 Foto Elektroforesis Plasmid DNA
Hasil yang di peroleh dari Elektroforesis terhadap plasmid PGEMTeasy pada kultur sel bakteri Escherichia coli DH5 ditunjukan dalam foto
berikut ini,
4.1.2
4.2 Pembahasan
4.2.1 Metode Isolasi dengan Alkalin Lisis
Dalam praktikum kali ini, digunakan tiga jenis larutan yaitu solution I,
solution II, dan solution III. Solution I berisi gabungan senyawa glukosa,
Tris-Cl dan EDTA yang berfungsi secara keseluruhan untuk menjaga
keutuhan DNA sel E.coli dengan membentuk resuspensi buffer antara
larutan dan bakteri E.coli. Menurut Tyler Mall (2013), glukosa pada solution
I berfungsi sebagi larutan isotonis yang menjaga tekanan osmotik pada sel
E. coli.Larutan glukosa tidak dapat di simpan untuk waktu yang lama dan
harus disimpan dalam suhu 4C. Larutan EDTA merupakan larutan chelates
yang menginaktivasi berbagai macam enzim yang dapat membahayakan
DNA. Larutan Tris-Cl berfungsi sebagai agen larutan penyangga yang
menjaga pH resuspensi agar tetap pada pH 8. Solution II terdiri atas larutan
basa kuat NaOH dan SDS. Larutan basa kuat digunakan karena isolasi
plasmid ini menggunakan metoda alkalin lisis sehingga DNA genome dan
plasmid pada bakteri E.coli dapat terdenaturasi dengan menggunakan
senyawa basa kuat. SDS 1% merupakan senyawa detergen yang larut
dengan fosfolipid sehingga berfungsi untuk melisiskan dinding sel bakteri.
Selain itu larutan SDS juga berfungsi untuk membersihkan DNA dari
senyawa protein, sehingga didapatkan plasmid dan DNA genome yang
bersih tanpa protein (Tyler, 2013). Solution III merupakan larutan netralisasi
yang mempunyai fungsi utama untuk merenaturasi plasmid oleh senyawa
potasium asetat dan asam asetat glasial. Selain itu, fungsi dari larutan
potassium asetat adalah untuk mengikat seluruh SDS (Sodium dodecyl
sulfate) dan mengubahnya menjadi senyawa KDS (Potassium dodecyl
sulfate). DNA tidak dapat terenaturasi karena selain memiliki rantai basa
yang sangat panjang, DNA terendapkan oleh penambahan senyawa
isopropanol. Kemudian, terdapat campuran senyawa EtOH dan TE pada
solution III. EtOH berfungsi untuk memisahkan pelet dengan plasmid
sehingga plasmid dapat bersih tanpa zat pengotor karena EtOH yang mudah
menguap akan memangkat plasmid kearea supernatan. TE berfungsi untuk
mengandung senyawa RNAses sehingga memotong seluruh RNA yang
tersisa agar tidak terbaca saat dielektroforesis (Tyler, 2013).
Secara garis besar terdapat lima tahapan utama dalam isolasi DNA
plasmid, yaitu isolasi sel, lisis dinding sel dan membran sel, purifikasi,
presipitasi, dan pencucian. Tahapan isolasi digunakan untuk mengisolasi sel
yang akan digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan
dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel sehingga membentuk
ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA kromosomal, DNA
plasmid, serta RNA. Selanjutnya dilakukan purifikasi dengan serangkaian
perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Setelah itu
dilakukan presipitasi guna mengendapkan kembali DNA plasmid dan
menghilangkan isolat lainnya diluar plasmid. Pencucian pun sama halnya
untuk menghilangkan isolat lainnya seperti DNA kromosom serta RNA.
(Schmid, 2003)
Berdasarkan hasil elektroforesis yang didapatkan dari isolasi plasmid
PGEMT-easy, kelompok kami yaitu kelompok 13 mendapatkan hasil yang
cukup baik, artinya keberadaan plasmid PGEMT-easy telah berhasil
dikonfirmasi. Hal tersebut terlihat bahwa terdapat dua band yang
mengindikasikan bahwa DNA plasmid telah berhasil di isolasi. Jika
Jika dibandingkan dengan kelompok lain pun terlihat hasil yang sama, plasmid
telah berhasil di isolasi, hanya saja kelompok 11 menunjukan hasil yang smear.
Menurut Dube (2010), penyebab munculnya smear pada percobaan elektroforesis
DNA diantaranya adalah:
1. Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis. Hal ini dapat diatasi dengan
mengurangi jumlah DNA yang digunakan. Dengan membatasi jumlah
komponen DNA yang diteliti, hasil elektroforesis yang didapat tentu akan
lebih akurat.
2. Terlalu banyak garam pada DNA. Seharusnya garam digunakan pada
takaran yang memang dianjurkan dan sesuai literature selama proses
elektroforesis DNA. Kelebihan garam malah akan mengganggu proses
elektroforesis dan memengaruhi hasil yang akan didapat. Kondisi ini dapat
diatasi dengan teknik presipitasi garam berlebih menggunakan etanol.
3. DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease.
4. Ban DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan. Kondisi ini dapat diatasi
dengan cara menambahkan etidium bromida saat elektroforesis.
5. Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. Penggunaan voltase listrik yang
lebih dari 20 V/cm selama proses elektroforesis dapat memengaruhi hasil
yang didapat di akhir percobaan. Oleh sebab itu, selalu gunakan voltase
listrik dalam rentang di bawah 20V/cm serta selalu ingat untuk menjaga
temperature lingkungan tetap di bawah 300 C selama elektroforesis
berlangsung, tujuannya adalah agar DNA tidak terdenaturasi akibat suhu
yang terlalu tinggi.
6. DNA terkontaminasi protein.Protein dan zat organik lainnya (bahkan fenol
sekalipun) akan menyebabkan hasil elektroforesis yang didapat menjadi
smear karena kesemua bahan tersebut akhirnya menjadi kontaminan bagi
DNA. Kontaminan tersebut yang menyebabkan hasil elektroforesis yang
didapattidak jelas dan buruk akibat DNA yang dielektroforesis tidak
sepenuhnya DNA murni.Hal ini dapat diatasi dengan cara ekstraksi
protein menggunakan fenol.
4.2.2
Amplifikasi PCR
Dalam percobaan ini digunakan beberapa komponen untuk membantu
target. Pada reaksi awalnya, suhu yang tinggi diberikan pada DNA rantai
ganda mejadi rantai tunggal. Komponen terakhir adalah primer yang
berperan sebagai untaian DNA tunggal yang pendek dan berperan sebagai
komplementer yang mengisi DNA template.
Menurut Lo (2006), pada dasarnya PCR terjadi dalam tiga tahap, yakni
Denaturasi akibat adanya panas yang diberikan kepada DNA, Annealing
atau penempelan DNA primer dalam temperatur yang sangat dingin, dan
yang terakhir adalah pemanjangan/ekstensi dari DNA primer yang telah
dilakukan proses annealing dengan menggunakan DNA polimerase.
Berikut ini adalah tahap-tahap yang terjadi dalam PCR :
template disiapkan
Gambar 4.7 Rantai nukleotida yang baru terbentuk sebagai hasil ekstensi
(Campbell, 2007)
Gambar 4.9 Hasil elektroforesis PCR kelompok 13 yang dicocokan dengan Leader
(Dokumentasi pribadi, 2014) dan (thermosciencetificbio, 2012)
Elektroforesis
Beberapa reagen yang digunakan dalam percobaan elektroforesis
diantaranya agarosa, TAE, loading buffer, dan Etidium Bromidam, masingmasing reagen memiliki peran dan fungsi tersendiri yang amat mendukung
dan menentukan hasil akhir dari percobaan.
BAB V
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan isolasi DNA plasmid dan amplifikasi gen
menggunakan PCR kali ini, dapat ditarik kesimpulan yaitu;
1. DNA plasmid PGEMT-easy telah berhasil di isolasi menggunakan metode
alkalin lisis dengan panjang 1500 bp.
2. Amplifikasi promotor gen MaEXPA1 dari DNA plasmid PGEMT-easy
yang di isolasi dengan metode PCR tidak berhasil dilakukan.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N., et al. 2007 Biology : Eight Edition. California : Pearson.
Cheng, L., Zhang D. Y. 2008. Molecular Genetic Pathology. New Jersey :
Humana Press.
Haris N ., et al. 2005. Konstruksi Pusaka cDNA dari daun klon karet AVROS
2037 yang Diinfeksi Patogen Corynespora cassiicola. Menara Perkebunan,
Volume 2 (73), pp. 44-62.
Lo, Dennis., et al. 2006. Clinical Applications of PCR : Second Edition. New
Jersey : Humana Press.
Reece, J. B., et al. 2012. Campbell Biology Concept and Connections : Concept
and Connection. California : Pearson.