Mar. Drugs 2010, 8, 2721-2732; doi:10.

3390/md8102721
Penerjemah NAMA : I WAYAN DARYA KARTIKA NRP : C34090077 KELOMPOK : 5 (NSP)
OPEN ACCESS

Marine Drugs
ISSN 1660-3397 www.mdpi.com/journal/marinedrugs

Artikel

Efek Racun dari Asam Domoic pada Ikan Laut Sparus aurata
Isabel Nogueira , Alexandre Lobo-da-Cunha , Antnio Afonso , Socorro Rivera , Joana 1 1,4 3 3 Azevedo , Rogrio Monteiro , Rosa Cervantes , Ana Gago-Martinez and Vtor Vasconcelos 1,5, *
1 1 1,2 1 3

CIIMAR/CIMAR, Centro Interdisciplinar de Investigao Marinha e Ambiental, Rua dos Bragas 177-289, 4150-123 Porto, Portugal; E-Mails: isabelcaldevilla@gmail.com (I.N.); aafonso@icbas.up.pt (A.A.); joana_passo@hotmail.com (J.A.) Laboratrio de Biologia Celular, Instituto de Cincias Biomdicas Abel Salazar, ICBAS, Lg. Abel Salazar 2, 4099-003 Porto, Portugal; E-Mail: alcunha@icbas.up.pt (A.L.C.) Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Qumica, As Lagoas Marcosende C.P. 36210, Spain; E-Mails: srivera@uvigo.es (S.R.); rosynac@uvigo.es (A.G.-M.) Laboratrio de Histologia e Embriologia, Instituto de Cincias Biomdicas Abel Salazar, ICBAS, Lg. Abel Salazar 2, 4099-003 Porto, Portugal; E-Mail: rafmont@icbas.up.pt (R.M.) Departamento de Biologia, Faculdade de Cincias, Universidade do Porto, Rua do Campo Alegre 4169-007 Porto, Portugal

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: vmvascon@fc.up.pt; Tel.: +351-223-401814; Fax: +351-223-390608. Received: 8 September 2010; in revised form: 7 October 2010 / Accepted: 14 October 2010 / Published: 15 October 2010

Abstract: Neurotoksisitas diinduksi pada ikan oleh asam domoic (DA) dinilai sehubungan dengan terjadinya tanda-tanda neurotoksik, mematikan, dan histopatologi dengan mikroskop cahaya. Sparus aurata terkena dosis tunggal dari DA oleh intraperitoneal (ip) injeksi 0, 0,45, 0,9, dan 9,0 mg kg-1 DA bw. Kematian (66,67 16,67%) hanya diamati pada dosis 9,0 mg kg-1 bw. Tanda-tanda toksisitas neurologis yang terdeteksi untuk dosis 0,9 dan 9,0 mg kg-1 DA bw. Selain itu, konsentrasi rata-rata ( SD) dari DA terdeteksi oleh HPLC-UV di ekstrak dari otak setelah terpapar 9,0 mg kg-1 DA bw adalah 0,61 0,01,. 0,96 0,00, dan 0,36 0,01 mg kg-1 DA jaringan di 1, 2, dan 4 jam. Kurangnya utama kerusakan otak yang permanen dalam S. aurata, dan reversibilitas tanda neurotoksik, menunjukkan bahwa kerentanan rendah untuk DA atau pemulihan saraf terjadi pada individu yang terkena. Keywords: asam domoic; neurotoksin; Sparus aurata racun neuro kekerangan; Pseudo-nitzschia; alga;

Mar. Drugs 2010, 8 1. Introduction

2722

Asam domoic (DA) disintesis dengan ganggang laut, alga merah Chondria armata dan spesies dari genus diatom Pseudo-nitzschia [1,2]. DA adalah analog dari asam kainic (KA), yang menunjukkan aktivitas excitotoxic. DA dan KA secara struktural mirip dengan glutamat yang merupakan neurotransmiter dominan di sistem saraf pusat. Kesamaan ini seluruhnya memungkinkan DA dan KA untuk mengikat untuk reseptor keluarga [GluRs] glutamat,, merangsang neuroexcitatory dan efek neurotoksik [3 5]. Kasus keracunan DA yang pertama didokumentasikan terjadi pada tahun 1987 ketika setidaknya empat orang tewas dan lebih dari seratus orang lain menderita neurologis parah dan gangguan pencernaan [6]. Sejak itu, peristiwa keracunan DA lain telah tercatat di masyarakat laut, yang mengakibatkan kematian massal burung laut dan singa laut [7 10]. DA telah diakui sebagai phycotoxin berbahaya yang ditransfer lewat jaring-jaring makanan ke manusia, melalui konsumsi kerang [11] dan mamalia laut dan burung-burung, melalui planktivorus. Sejauh ini, neurotoksisitas DA-terinduksi pada ikan kurang dipahami dan mayoritas informasi yang tersedia terkait dengan tanda excitotoxicologi DA terinduksi yang muncul (i.p.) injeksi intraperitoneal dari DA berikut ini. Ketika hiu leopard remaja (Triakis semifasciata) disuntik intraperitoneal dengan dosis yang berkisar 9-27 mg kg-1 DA berat badan (bw), tidak ada tanda-tanda toksisitas diamati [14]. Sebaliknya, i.p. suntikan dosis 1-14 mg kg-1 DA bw diinduksi tanda-tanda excitotoxicologi dan kematian pada ikan teri (E. mordax) [15]. Bukti lebih lanjut dari neurotoksisitas DA dalam ikan juga diperoleh setelah suntikan ip ke killifish (Fundulus heteroclitus) dengan 5 mg kg-1 DA bw, yang menyebabkan perubahan perilaku dan meningkatkan ekspresi saraf c-Fos [16]. Demikian pula, suntikan i.p pada salmon coho (Oncorhynchus kisutch) dengan dosis 6,3 0,6 mg kg-1 DA bw mengakibatkan tanda-tanda neurotoksik [17]. Selain itu, perubahan dalam aktivitas metabolik dalam otak salmon Atlantik (Salmo salar) ditemukan setelah suntikan ip 6,0 mg kg-1 DA bw [8]. Untuk meringkas, dalam literatur ada bukti bahwa kerentanan neurotoksisitas DA pada ikan, berikut intraperitoneal (ip) injeksi, bervariasi dalam spesies. Oleh karena itu, tujuan utama dari studi adalah untuk mengevaluasi neurotoksisitas DA-induksi dalam model lain, seabream gilthead Sparus aurata. Spesies ini umum di Laut Mediterania, terdapat sepanjang pantai Atlantik Timur dari Inggris ke Senegal, baik di perairan laut dan payau seperti laguna pesisir dan daerah muara, dan memakan mangsa yang bervariasi, seperti kerang, yang terkonsentrasi DA selama blooming Pseudo-nitzschia. Untuk tujuan ini, neurotoksisitas DA terinduksi dinilai dengan menganalisa kematian, tanda-tanda terjadinya neurotoksik dan perubahan histopatologi. Distribusi reseptor glutamat 5, 6, dan 7 (GluR5, 6, 7) di otak S. aurata juga dipelajari dengan mikroskop. Selain itu, hubungan antara tanda-tanda neurotoksik yang diamati dan dianalisis pada daerah-daerah otak di S. aurata yang dipengaruhi oleh DA. Jumlah dari DA di hati dan otak S. aurata setelah paparan pada DA juga dievaluasi.

Mar. Drugs 2010, 8 2. Material and Metode 2.1. Secara kimia

2723

Semua pelarut dan reagen kimia kromatografi cair kinerja tinggi/High Performanc Liquid Chromatography (HPLC) atau analisis tingkat. Metanol (Merck) dan asetonitril (Pancreac) adalah HPLC berkualitas; asam perklorat (Pancreac) dan asam format (Prolabo) adalah analitis tingkat. DA (kemurnian 95%) dibeli dari Sigma-Aldrich. Air Mili-Q (Millipore Corporation) digunakan untuk mempersiapkan semua larutan toksin. 2.2. Pemeliharaan ikan Juvenile ikan laut (S. aurata) digunakan sebagai spesies model karena kemampuannya untuk menghasilkan data perilaku reproduksi dalam kondisi yang terkendali [19]. S. aurata disuplai sebuah peternakan ikan komersial (TIMAR Lda., Setbal., Portugal), di mana juvenil dibesarkan sampai mereka mencapai ukuran 10-15 g. Ikan disimpan di laboratorium kami selama dua bulan, dan selama itu mereka diberi makan tiga kali seminggu dengan ransum pemeliharaan 2-3% bw, sebelum digunakan dalam percobaan. S. aurata yang diaklimatisasi dengan kondisi eksperimental selama 48 jam di 150 L akuarium kaca. Makanan tidak disediakan selama fase aklimatisasi atau selama percobaan. Aerasi disediakan melalui tips plastik yang ditempatkan 2 cm di atas bagian bawah akuarium. 2.3. Desain eksperimen Percobaan dilakukan di air laut alami (34 0,7 ppm) di bawah photoperiod dari 12 jam terang: 12 jam gelap di 17 0,8C. Jumlah oksigen terlarut (68 22%), pH (7,7 0,1), dan konsentrasi amonia total (0,2 0,1 mg L-1) dipantau setiap hari. Semua akuarium yang berisi organisme uji diisolasi dengan plastik tembus cahaya untuk mengurangi rangsangan eksternal, seperti pergerakan eksperimen, getaran atau isyarat visual. Maksimal enam ikan per 36 L akuarium yang digunakan dalam percobaan dan untuk akun dari variabilitas akuarium antarkelompok, selalu ada tiga akuarium per perlakuan dan dua kontrol. Kontrol adalah individu tidak disuntik atau disuntikkan dengan phospat buffered saline (PBS). Kontrol digunakan dalam rangka untuk mengevaluasi perubahan non-toksik pada ikan yang disebabkan oleh manipulasi, stres terinduksi, atau efek dari PBS. DA dilarutkan dalam PBS dan larutan stok disimpan di -20C sampai larutan eksperimen disiapkan. Semuanya ikan dibius dalam waktu dua menit dengan perendaman dalam 2-phenoxyethanol (0,2 ml L-1), sebelum ditimbang, kemudian volume injeksi i.p. yang dihitung dalam rangka untuk mendapatkan konsentrasi diinginkan. Pada akhir setiap percobaan, air dari akuarium setiap diperbarui. Susunan eksperimental digunakan untuk mengevaluasi efek dari DA pada ikan laut dirangkum dalam Tabel 1.

Mar. Drugs 2010, 8

2724

Tabel 1. Susunan eksperimental digunakan untuk mengevaluasi efek dari asam domoic (DA) dalam gilthead seabream Sparus aurata, tiga ulangan digunakan dalam pengobatan masing-masing Susunan eksperimen Waktu (jam) Jumlah ikan per akuarium Pengamatan perilaku 0.5 dan 2 6 Pemeriksaan neurotoksisitas DA 24 6 Mortalitas Mikroskopi cahaya and immunohistochemistry 24 2 Analisa DA 1, 2, dan 4 3 Ikan tersebut ditangani sesuai dengan pedoman untuk akomodasi dan perawatan hewan dari Konvensi Eropa untuk Perlindungan Hewan Vertebrata digunakan untuk eksperimen dan tujuan ilmiah lainnya. 2.4. Pemeriksaan neurotoksisitas DA Delapan belas orang yang terkena 0,0; 0,9; 0,45; atau 9,0 mg kg-1 DA bw atau PBS dengan injeksi i.p.. Kami melakukan penelitian yang berbeda berturut-turut dalam waktu satu bulan, pengujian pengobatan yang berbeda pada saat yang sama, dengan menggunakan nilai nominal di atas konsentrasi disebutkan. Neurotoksisitas DA induksi dinilai dengan angka kematian dan terjadinya tanda-tanda neurotoksik, seperti seperti berenang dalam sebuah lingkaran, di spiral, atau terbalik. Video digital direkam selama 20 menit, mulai 30 menit dan dua jam setelah paparan. Selain itu, kematian dievaluasi setelah 24 jam paparan. Mengingat bahwa kematian 50% terdeteksi pada ikan yang disuntik dengan 9,0 mg kg-1 DA bw, tidak ada dosis yang lebih tinggi dari DA yang digunakan dalam penelitian ini.

2.5. Mikroskopi cahaya dan immunohistochemistry Enam orang terkena 0,0; 0,45; 0,9; atau 9,0 mg kg-1 DA bw atau PBS terbunuh oleh overdosis obat bius setelah 24 jam paparan. Otak, hati, lambung dan duodenum dikumpulkan dan tetap dberi formaldehid (4%). Jaringan ini diolah secara rutin untuk disimpan dalam parafin, potong di 4 mikrometer, dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. Bagian dari metencephalon (lebih khusus, korteks cerebellum), diencephalon, myelencephalon, dan mesencephalon dari individu terpapar ke PBS selama 24 jam yang dipasang pada slide, diperlakukan dengan 3-aminopropyltriethoxysilane (Sigma) untuk meningkatkan adhesi bagian, dan digunakan untuk studi imunohistokimia menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya [14]. Sebuah streptavidin-biotin peroksidase imunohistokimia kit (Histostain Plus; Zymed) digunakan untuk mendeteksi pengikatan antibodi primer, sesuai dengan instruksi pabrik dengan ringanadaptasi. Setelah membilas dalam air suling dan PBS, aktivitas peroksidase divisualisasikan menggunakan 0,05% 3,3-diaminobenzidine (DAB) pada PBS dan 0,03% H2O2, yang memberikan produk berwarna coklat. Setelah membilas di air keran, bagian yang dipasang di DPX. Antibodi monoklonal utama MAB379, yang mengakui epitop umum untuk GluR5,, 6 dan 7, dibeli dari Chemicon Internasional (Temecula). Kontrol negatif dilakukan di mana tidak ada antibodi primer ditambahkan; jaringan otak tikus yang digunakan sebagai kontrol positif. Immunoreactivity positif didasarkan pada penampilan pewarnaan oranye gelap, yang berhubungan dengan pengendapan deposisi DAB, seperti dibandingkan dengan kontrol yang positif dan negatif, mengungkapkan kehadiran antibodi monoklonal yang mengenali jenis

Mar. Drugs 2010, 8

2725

reseptor glutamat asam kainic (GluR 5, 6, 7). Informasi selengkapnya dapat juga ditemukan dalam karya Pulido [20] 2.6. Tingkat (level) DA di otak dan hati Untuk mengukur kadar DA di otak dan hati, sembilan orang terkena PBS atau 9,0 mg kg-1 DA bw. Setelah 1, 2, dan 4 jam paparan, otak dan hati dari tiga dari individu dihapus seperti dijelaskan di atas, ditimbang, dan kemudian lyophilized. DA diekstraksi dari jaringan dilarutkan S. aurata [21] dan protein diekstraksi dengan asam perklorat menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya [22]. Pemulihan percobaan dilakukan untuk mengevaluasi efisiensi dari metode ekstraksi. Untuk tujuan ini, otak dan hati sampel berduri dengan 50 ng dari DA. Nilai rata-rata pemulihan adalah 80% untuk sampel otak dan 90% untuk hati, yang menunjukkan adanya efek matriks yang mempengaruhi nilai-nilai pemulihan. Jumlah DA dalam jaringan ditentukan oleh HPLC-UV [21] sebagai diringkas dalam Tabel 2. Konsentrasi DA yang dihitung berdasarkan kurva standar yang digunakan standar eksternal DA, setelah koreksi untuk jumlah pemulihan.

Table 2. Kondisi HPLC-UV untuk analisis asam domoic Instrumen HPLC Kolom Fase berpindah Kecepatan aliran Detektor UV Panjang gelombang Volume injeksi Analisis data 3. Results 3.1. Neurotoksisitas DA Mortalitas S. aurata (n = 18) setelah injeksi i.p. dengan 9,0 mg kg-1 DA adalah 66,7 bw 16,7% (rata-rata SD). Dengan kondisi tersebut, 50% kematian terjadi pada 7,1 jam setelah terpapar. Tidak ada mortalitas diamati dalam kontrol atau setelah terpapar konsentrasi lain dari DA. Tidak ada tanda-tanda toksisitas diamati dalam kontrol. Pada beberapa individu terpapar 0,45 mg kg-1 DA bw, beberapa gangguan dalam perilaku, ditandai dengan berenang vertikal, yaitu, menaik dan menurun di kolom air, yang diamati. Individu-individu yang tersisa terus menunjukkan perilaku suka berteman, dengan ikan yang tersisa di tengah kolom air atau di dekat bagian bawah akuarium. Demikian pula, pada beberapa individu yang terkena 0,9 mg kg-1 DA bw, gangguan dalam perilaku yang teramati. Namun, untuk pengobatan ini, gangguan berhubungan dengan tanda-tanda neurotoksik, seperti berenang di sebuah lingkaran, di spiral, atau terbalik. Gangguan yang diamati dalam perilaku terbalik setelah 4-5 jam paparan untuk dosis 0,45 mg kg-1 DA bw dan setelah 12 jam untuk dosis 0,9 mg kg-1 DA bw. Sebaliknya, tanda-tanda neurotoksik diamati pada semua individu yang terkena 9,0 mg kg-1 DA bw 20-30 menit setelah injeksi i.p. Tanda-tanda ini, berenang dalam sebuah lingkaran, di spiral, atau terbalik, terbalik setelah 24 jam paparan racun dalam hidup individu. Perubahan dalam PV-980 Jasco Reversed Phase Phenomenex luna C18, 5 m, 100A ODS3, 250 4.6 mm Acetonitrile:Water 12% (v/v) with formic acid 0.2% (v/v) 1 1 mL min Jasco UV-1575 242 nm 20 L Borwin software

Mar. Drugs 2010, 8

2726

perilaku berenang terjadi dalam urutan berikut. Pada awalnya, ikan tetap dekat bagian bawah akuarium, ke satu sisi, tapi tidak mampu tinggal di posisi yang diharapkan. Selanjutnya, individuindividu menjadi terdistribusi secara merata di akuarium dan menunjukkan perilaku berenang lingkaran yang parah, di mana ikan tersebut sangat terdorong oleh sirip kaudal. Akhirnya, ikan tetap dekat permukaan akuarium, terbalik, mengambang atau sedikit terdorong oleh dada sirip. Selain itu, peningkatan reaktivitas S. aurata berbagai rangsangan, visual dan pendengaran diamati. Hewan yang masih hidup dimonitor selama periode empat minggu dan semua menunjukkan tanda-tanda pemulihan lengkap. 3.2. Mikroskopi cahaya dan immunohistochemistry Studi mikroskop cahaya mengungkapkan tidak ada perbedaan besar antara organ-organ dianalisis dari kontrol dan orang-orang yang terkena DA Gambar 1. Otak bagian dari S. aurata menunjukkan immunoreactivity positif pada antibodi monoklonal MAB379, yang diketahui sebagai reseptor glutamat jenis KA (GluR5, 6, dan 7): (1) Korteks serebelar terdiri dari lapisan granular (g), lapisan sel Purkinje (P) dan lapisan molekul (m). Glomeruli serebellar (arah panah) dan badan-badan sel Purkinje (arah panah) menunjukkan immunoreactivity kuat; (2) terdiri dari diencephalon neuropil (n) dan immunoreactive sel tubuh neuron (arah panah), (3) Myelencephalon neuropil terdiri dari (n), sel glial (arah panah), dan neuron dengan tubuh Nissl peripherial menunjukkan immunoreactivity kuat (panah); (4) mesencephalon menunjukkan lapisan dengan neuron immunoreactive kecil (arah panah) di stratum periventricularis (sp).

Mar. Drugs 2010, 8

2727

Antibodi monoklonal MAB379, digunakan untuk imunohistokimia bagian otak yang diperoleh dari ikan yang disuntik dengan PBS sendiri. Immunopositivity untuk MAB379 diamati dengan berbagai intensitas (Gambar 1). Kontrol negatif menunjukkan tidak immunostaining. Badan sel Purkinje, yang hadir di korteks cerebellum, menunjukkan immunoreactivity yang kuat, sedangkan glomeruli serebellar, yang terletak di lapisan granular, menunjukkan immunoreactivity sedang (Gambar 1-). Beberapa neuron badan sel immunoreactive telah diidentifikasi dalam diencephalon (Gambar 1-2). Neuropil, yang merupakan pekerjaan yang padat dirasakan rumit terjalin proses glial baik, fibril, sinaptik terminal, akson, dan dendrit yang diselingi antara badan-badan sel saraf dan dari glial sel, ditemukan menjadi immunonegative. Selain itu, dalam myelencephalon (Gambar 1-3), yang kuat immunoreactivity diamati di neuron yang berisi tubuh Nissl perifer, yang dikenal untuk sesuai dengan ribosom dalam agregat besar dan retikulum endoplasma kasar. Selanjutnya, dalam mesencephalon, lapisan dalam periventricularis strata yang berhubungan dengan neuron kecil ditemukan untuk menunjukkan pewarnaan positif sedang (Gambar 1-4).

3.3.Tingkat(level) DA di otak dan hati Rataan ( SD) konsentrasi dari DA yang terdeteksi oleh HPLC-UV di ekstrak dari otak S. aurata setelah terekspos dengan injeksi i.p. untuk 9,0 mg kg-1 DA bw adalah 0,61 0,01, 0,96 0,00, dan 0,36 0,01 mg kg-1 DA jaringan di 1, 2, dan 4 jam, masing-masing (Gambar 2). Rataam ( SD) konsentrasi dari DA dalam ekstrak hati dari S. aurata setelah 1 dan 2 jam paparan 2,45 0,02 dan 4,59 0,03 mg kg-1 DA jaringan, masing-masing (Gambar 2). DA konten dalam ekstrak hati setelah 4 jam paparan tidak dievaluasi, karena adanya diketahui setelah ekstraksi senyawa yang memiliki waktu retensi yang sama dan polaritas sebagai DA. Ini Senyawa tidak ditemukan dalam ikan yang terkena PBS sendiri. Gambar 2. Domoic acid (DA) konten (mg kg-1 DA) Di otak dan ekstrak hati dari S. aurata setelah injeksi i.p. dari 9 mg kg-1 DA bw. * Tidak ada evaluasi mungkin karena coelution; Nilai konten DA mewakili rata-rata SD dari dua perlakuan meniru.

Mar. Drugs 2010, 8 4. Pembahasan

2728

Dalam studi ini, neurotoksisitas DA terinduksi pada ikan dinilai sehubungan dengan kematian, terjadinya tanda-tanda neurotoksik, dan dengan pengamatan menggunakan mikroskop cahaya. Selanjutnya, jumlah dari DA yang hadir dalam ekstrak hati dan otak dari S. aurata dihitung. Kesamaan struktur dari DA menjadi asam glutamat dan, khususnya, KA, menunjukkan bahwa DA dapat mengaktifkan KA dan reseptor glutamat subtipe AMPA [23]. Namun, mekanisme saraf stimulasi dalam menanggapi DA belum diklarifikasi dengan baik. Studi dalam budaya kortikal primer telah menunjukkan bahwa DA bertindak melalui afinitas tinggi mengikat AMPA-dan reseptor glutamat KAsensitif untuk menghasilkan kematian sel eksitotoksik [24]. Penyebab awal dari excitotoxicitas adalah peningkatan konsentrasi ekstraseluler glutamat, yang mengakibatkan aktivasi berlebih reseptor glutamat ionotropic lokal. Ini menyebabkan masuknya dari Ca2 +, yang menghasilkan kegagalan sel untuk mempertahankan ion intraseluler homeostasis, dan ini pada gilirannya memicu kematian sel [25]. Selain itu, Ca sitosolik 2+ jenjang telah dilaporkan meningkat di neuron hipokampus piramidal setelah terpapar DA [26]. DA juga telah terbukti menyebabkan eksitasi di neuron hippocampal tikus kultur [27]. Dalam studi ini, kami tidak menemukan perubahan morfologi utama yang disebabkan oleh dosis tunggal dari DA. Sebaliknya, Tryphonas dan Iverson [28] melaporkan bahwa ip pemberian dosis tunggal 4 mg kg-1 DA untuk tikus mengakibatkan kerusakan akut. Khas vacuolation dari neuropili, pembengkakan sitoplasma hidropik penduduk astrosit dan sel saraf hyperchromasia dan terjadi penyusutan. hilangnya sel saraf DA-diinduksi (> 80%) serta hilangnya sel tubuh saraf dan degenerasi dari dendrit, di tikus telah dilaporkan [24]. Di sisi lain, vacuolation dari neutropil dan hypercromasia di hipokampus, hipotalamus, daerah prostema, dan lapisan dalam retina dicatat post-mortem pada primata yang telah diberikan 0,5 mg DA DA kg-1 intravena atau 4 mg kg-1 DA i.p. [29]. Fakta bahwa kita tidak mengamati kerusakan jaringan permanen di S. aurata oleh mikroskop cahaya, dan bahwa tanda-tanda beracun diamati setelah terpapar DA yang reversibel, menunjukkan bahwa pemulihan saraf terjadi dalam individu yang terkena. Dalam penelitian kami, tanda-tanda khas neurotoksik diamati pada semua individu 9,0 mg terkena DA kg-1 setelah 20-30 menit. Berbagai tandatanda beracun diamati di S. aurata yang yang terkena dosis tunggal 9,0 mg kg-1 DA, Misalnya berenang di lingkaran, dalam spiral, atau terbalik, yang konsisten dengan yang dilaporkan sebelumnya untuk genera ikan lainnya setelah disuntikkan dengan DA i.p. [15,17]. Administrasi sistemik dari DA untuk tikus dengan dosis 1,3 mg tunggal kg-1 juga menyebabkan berbagai tanda keracunan, yang meliputi perilaku stereotypic kaki belakang, goresan, dan kematian [30]. Demikian pula dengan penelitian kami, penulis ini juga melaporkan pendengaran berlebihan mengejutkan signifikan pada tikus terkena DA. Demikian juga, sebuah studi tentang respon perilaku mencit setelah pemberian ekstrak ip kerang, mengamati berbagai tanggapan, termasuk aktivitas hipo, sedasi, kekakuan, goresan, kepala tenun, kehilangan kontrol postural, tremor, kejang, dan kematian [23]. Mirip neurotoksik efek ke yang diamati pada hewan pengerat juga telah dilaporkan dalam primata non-manusia, tetapi didominasi oleh tersedak dan muntah. Monyet Cynomolgus yang terkena dosis tunggal 4 mg kg-1 DA menunjukkan muntah parah, hipotermia, edema paru akut, dan kematian dalam waktu empat jam [29]. Perjalanan waktu pengamatan tanda-tanda neurotoksik relevan untuk interpretasi lain data yang dikumpulkan, seperti konsentrasi dari DA di ekstrak jaringan. Pada dua jam setelah i.p. administrasi, konsentrasi ekstrak DA di otak dan hati telah meningkat, yang menunjukkan

Mar. Drugs 2010, 8

2729

bioavailabilitas dari DA dalam sirkulasi sistemik. Sebaliknya, pada empat jam, jumlah racun terdeteksi di otak menurun lagi, untuk nilai yang lebih rendah dari yang terdeteksi pada satu jam setelah paparan. Data-data ini dalam perjanjian dengan jangka waktu diamati untuk pemulihan dari perilaku normal untuk semua laporan DA, yaitu, setelah empat jam paparan, dan juga dengan temuan yang dipublikasikan dalam literatur. Lefebvre et al. [17] menunjukkan bahwa DA hadir pada ikan hanya untuk jangka waktu singkat. Para jumlah DA yang kita terdeteksi dalam hati setelah satu atau dua jam paparan menunjukkan bahwa toksin diserap baik dari rongga selom ke dalam darah melalui kapiler, seperti yang telah diharapkan karena kelarutan tinggi DA di dalam air. Tingkat toksisitas dipamerkan, dan jumlah dari DA terdeteksi di jaringan yang dianalisis, juga menunjukkan bahwa sebagian besar toksin memasuki sistemik sirkulasi langsung. Selain itu, konsentrasi dari DA dalam ekstrak dari otak, menunjukkan bahwa bagian dari DA yang diberikan ip, bermigrasi ke otak menyebabkan tanda-tanda neurotoksik yang disebutkan di atas . Data yang sangat terbatas tersedia dalam literatur mengenai penyerapan, distribusi, metabolisme, dan ekskresi dari DA di model non-mamalia. Truelove et al. (1996) melaporkan bahwa pada tikus yang 5 mg kg-1 DA bw diberikan oleh gavage oral (og), hanya 2% dari dosis diekskresikan dalam urin [31,32]. Data dari tes neurotoksisitas mengungkapkan bahwa kerentanan S. aurata untuk ip paparan DA adalah mirip dengan ikan lain, seperti ikan teri, ikan salmon coho, dan salmon Atlantik. Disarankan kerentanan rendah terhadap efek toksik DA ditunjukkan pada individu yang bertahan pada pengobatan 9,0 mg kg-1 DA, mungkin sesuai dengan tidak adanya efek neurotoksik dalam hiu macan tutul, yang memiliki telah terkena konsentrasi DA yang tiga kali lebih tinggi daripada yang digunakan dalam penelitian ini [14]. Gambaran faktor-faktor yang berbeda yang dapat memodifikasi cedera sel berhubungan dengan excitotoksisitas DA, dapat ditemukan dalam literatur [20]. Meskipun individu-individu yang masih hidup dalam penelitian kami muncul untuk memulihkan sepenuhnya dengan tidak ada lesi yang jelas, studi yang lebih rinci diperlukan untuk menilai efek dari DA pada aktivitas metabolik otak atau fitur ultra. Dalam studi ini, kami mendeteksi immunoreactivity positif untuk antibodi monoklonal MAB379, yang mengenali reseptor glutamat jenis KA (GluR5, 6, 7) di otak S. aurata, khususnya di korteks cerebellum, diencephalon, myelencephalon, dan mesencephalon. Hal ini menunjukkan bahwa wilayah otak tersebut mengandung setidaknya satu dari reseptor glutamat jenis jenis KA , yang merupakan target untuk DA. Penelitian imunohistokimia dilakukan di hiu macan tutul teridentifikasi pola serupa immunoreactivity di daerah yang sama dari otak [14]. Di alam, paparan S. aurata untuk konsentrasi sublethal dari DA melalui rantai makanan trofik mungkin mengkompromikan perilaku seperti penangkapan mangsa, menghindari pemangsa, pacaran, dan kawin. Namun demikian, penelitian telah menunjukkan bahwa toksisitas DA jauh lebih tinggi dengan ip injeksi dibandingkan dengan lisan asupan pada spesies ikan lainnya [17]. Secara keseluruhan, studi imunohistokimia dan pengamatan perilaku mengaktifkan putatif hubungan antara dua set temuan yang akan didirikan. Otak kecil, yang menunjukkan kuat immunoreactivity untuk antibodi MAB379, yang diketahui terlibat dalam pemeliharaan posisional keseimbangan, yang jelasjelas terpengaruh dalam terkenamya DA S. aurata. Secara khusus, metencephalon ikan terlibat dalam memproses informasi yang penting untuk menjaga posisi keseimbangan organisme dan untuk penyempurnaan tindakan motor. Fungsi-fungsi ini jelas terpengaruh pada individu yang terpapar 9,0 mg kg-1 DA bw. Selain itu, myelencephalon beroperasi terutama pada tingkat refleks, mengingat bahwa itu berisi pusat viseral, pendengaran, dan proprioreceptive refleks [33]. Myelencephalon juga daerah yang terkait dengan penerimaan suara dan mengintegrasikan rasa dan indra pendengaran [34]. Fungsi-fungsi ini terkena dampak di S. aurata yang terkena 9,0 mg kg-1 DA bw, seperti diungkapkan oleh peningkatan

Mar. Drugs 2010, 8

2730

reaktivitas individu untuk rangsangan visual dan pendengaran. Kesimpulannya, data yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan bahwa dosis tunggal sublethal dari DA tidak tampaknya mengakibatkan kerusakan akut pada jaringan otak dari gilthead seabream S. aurata. Demikian pula, perubahan perilaku yang terjadi setelah injeksi ip dosis, tunggal sublethal dari DA ditemukan dikembalikan sepenuhnya setelah 24 jam. Ucapan terima kasih Karya ini didukung oleh proyek POCTI/MAR/61569/2004 dari Yayasan Sosial Eropa (FSE QSA III) dan Yayasan Sains dan Teknologi (FCT) dan oleh hibah BPD/14843/2003 dan SFRH/BPD/41288/2007 dari FCT.

Referensi 1. 2. 3. 4. Takemoto, T.; Daigo, K. Constituents of Chondria armata. Chem. Pharm. Bull. 1958, 6, 578580. Bates, S.S. Domoic acid-producing diatoms: another genus added. J. Phycol. 2000, 36, 978983. Clayden, J.; Read, B.; Hebditch, K.R. Chemistry of domoic acid, isodomoic acids, and their analogues. Tetrahedron 2005, 61, 57135724. Hald, H.; Naur, P.; Pickering, D.S.; Sprogoe, D.; Madsen, U.; Timmermann, D.B.; Ahring, P.K.; Liljefors, T.; Schousboe, A.; Egebjerg, J.; Gajhede, M.; Kastrup, J.S. Partial agonism and antagonism of the ionotropic glutamate receptor iGLuR5: structures of the ligand-binding core in complex with domoic acid and 2-amino-3-[5-tert-butyl-3-(phosphonomethoxy)-4isoxazolyl]propionic acid. J. Biol. Chem. 2007, 282, 2572625736. Hampson, D.R.; Manalo, J.L. The activation of Glutamate receptors by kainic acid and domoic acid. J. Nat. Toxins 1998, 6, 153158. Bates, S.S.; Bird, C.J.; de Freitas, A.S.W.; Foxall, R.; Gilgan, M.; Hanic, L.A.; Johnson, G.R.; McCulloch, A.W.; Odense, P.; Pocklington, R.; et al. Pennate diatom Nitzschia pungens as the primary source of domoic acid, a toxin in shellfish from Eastern Prince Edward Island, Canada. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1989, 46, 12031215. Sierra, B.A.; Palafox-Uribe, M.; Grajales-Montiel, J.; Cruz-Villacorta, A.; Ochoa, J.L. Sea bird mortality at Cabo San Lucas, Mexico: evidence that toxic diatom blooms are spreading. Toxicon 1997, 35, 447453. Lefebvre, K.A.; Powell, C.L.; Busman, M.; Doucette, G.J.; Moeller, P.D.R.; Silver, J.B.; Miller, P.E; Hughes, M.P.; Singaram, S.; Silver, M.W.; Tjeerdema, R.S. Detection of domoic acid in northern anchovies and California sea lions associated with an unusual mortality event. J. Nat. Toxins 1999, 7, 8592. Silvagni, P.A.; Lowestine, L.J.; Spraker, T.; Lipscomb, T.P.; Gulland, F.M.D. Pathology of domoic acid toxicity in california sea lions (Zalophus californianus). Vet. Pathol. 2005, 42, 184191.

5. 6.

7.

8.

9.

Mar. Drugs 2010, 8

2731

10. Busse, L.B.; Venrick, E.L.; Antrobus, R.; Miller, P.E.; Vigilant, V.; Silver, M.W.; Mengelt, C.; Mydlarz, L.; Prezelin, B.B. Domoic acid in phytoplankton and fish in San Diego. Harmful Algae 2006, 5, 91101. 11. Quilliam, M.A.; Wright, J.L.C. The amnesic shellfish poisoning mystery. Anal. Chem. 1989, 61, 1053A1060A. 12. Bargu, S.; Powell, C.; Coale, S.; Busman, M.; Doucette, G.; Silver, M. Krill: a potential vector for domoic acid in marine food webs. Mar. Ecol. Prog. Ser. 2002, 237, 209216. 13. Bargu, S.; Silver, M. Field evidence of krill grazing on the toxic diatom genus Pseudo-nitzschia spp. in Monterey Bay, California. Bull. Mar. Sci. 2003, 72, 629638. 14. Schaffer, P.; Reeves, C.; Casper, D.R.; Davis, C.R. Absence of neurotoxic effects in leopard sharks, Triakis semifasciata, following domoic acid exposure. Toxicon 2006, 47, 747752. 15. Lefebvre, K.A.; Dovel, S.L.; Silver, M.W. Tissue distribution and neurotoxic effects of domoic acid in a prominent vector species, the northern anchovy Engraulis mordax. Mar. Biol. 2001, 138, 693700. 16. Salierno, J.D.; Snyder, N.S.; Murphy, A.Z.; Poli, M.; Hall, S.; Baden, D.; Kane, A.S. Harmful algal bloom toxins alter c-Fos protein expression in the brain of killifish, Fundulus heteroclitus. Aquat. Toxicol. 2006, 78, 350357. 17. Lefebvre, K.A.; Noren, D.P.; Schultz, I.R.; Bogard, S.M.; Wilson, J.; Eberhart, B.T.L. Uptake, tissue distribution and excretion of domoic acid after oral exposure in coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Aquat. Toxicol. 2007, 81, 266274. 18. Bakke, M.J.; Horsberg, T.E. Effects of algal-produced neurotoxins on metabolic activity in telencephalon, optic tectum and cerebellum of Atlantic salmon (Salmo salar). Aquat. Toxicol. 2007, 85, 96103. 19. Begout, M.L.; Lagardere, J.P. An acoustic telemetry study of seabream (Sparus aurata L.): first results on activity rhythm, effects of environmental variables and space utilization. Hydrobiologia 1995, 301, 417423. 20. Pulido, O.M. Domoic acid toxicologic pathology: A review. Mar. Drugs 2008, 6, 180219. 21. Quilliam, M.A.; Xie, M.; Hardstaff, W.R. A Rapid Extraction and Clean-Up Procedure for Determination of Domoic Acid in Tissue Sample; Technical Report 64 (NRCC No 3301); National Research Council Canada, Institute of Marine Bioscence: Halifax, NS, Canada, 1991. 22. Cervantes, C.R.C.; Alfonso, P.M.; Duran, B.R.; Vidal, L.; Leao, M.; Gago, M. Application of precolumn oxidation HPLC method with fluorescence detection to evaluate saxitoxin levels in discrete brain regions of rats. Toxicon 2007, 49, 8999. 23. Tasker, R.; Connell, B.; Strain, S. Pharmacology of systemically administered domoic acid in mice. Can. J. Physiol. Pharmacol. 1991, 69, 378382. 24. Larm, J.A.; Beart, P.M.; Cheung, N.S. Neurotoxin domoic acid produces cytotoxicity via kainate-and ampa sensitive receptors in cultured cortical neurones. Neurochem. Int. 1997, 31, 677682. 25. Berman, F.W.; Murray, T.F. Domoic acid neurotoxicity in cultured cerebellar granule neurons is mediated predominantly by NMDA receptors that are activated as a consequence of excitatory amino acid release. J. Neurochem. 1997, 69, 693703.

Mar. Drugs 2010, 8

2732

26. Xi, D.; Ramsdell, J.S. Glutamate receptors and calcium entry mechanisms for domoic acid in hippocampal neurons. Neuroreport 1996, 7, 11151120. 27. Stewart, G.R.; Zorumski, C.F.; Price, M.T.; Olney, J.W. Domoic acid: a dementia-inducing excitotoxic food poison with kainic acid receptor specificity. Exp. Neurol. 1990, 110, 127138. 28. Tryphonas, L.; Iverson, F. Neuropathology of excitatory neurotoxins: The domoic acid model. Toxicol. Pathol. 1990, 27, 165169. 29. Tryphonas, L.; Truelove, J.; Iverson, F. Acute parenteral neurotoxicity of domoic acid in cynomolgous monkeys (Macaca fascicularis). Toxicol. Pathol. 1990, 18, 297303. 30. Sobotka, T.J.; Brown, R.; Quander, D.Y.; Jackson, R.; Smith, M.; Long, S.A.; Barton, C.N.; Rountree, R.L.; Hall, S.; Eilers, P.; Johannessen, J.N; Scallet, A.C. Domoic acid: neurobehavioral and neurohistological effects of low-dose exposure in adult rats. Neurotoxicol. Teratol. 1996, 18, 659670. 31. Truelove, J.; Mueller, J.; Pulido, O.; Iverson, F. Subchronic toxicity study of domoic acid in the rat. Food Chem. Toxicol. 1996, 34, 525529. 32. Truelove, J.; Mueller, R.; Pulido, O.; Martin, L.; Fernie, S.; Iverson, F. 30-day oral toxicity study of domoic acid in cynomolgus monkeys: lack of overt toxicity at doses approaching the acute toxic dose. Nat. Toxins 1997, 5, 111114. 33. Kardong, K.V. Vertebrates: Comparative Anatomy, Function, Evolution, 3rd ed.; McGraw-Hill: New York, NY, USA, 2002; pp. 609653. 34. Amin, A.B.; Mortensen, L.; Poppe, T.T. Histology Atlas, Normal Structure of Salmonids; Akvapatologisk Laboratorium AS: Bod, Norway, 1992. 2010 by the authors; licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).